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La tendencia actual en el control químico y racional de plagas es el uso de compuestos de acción específica. Los inhibidores alimentarios preingestivos producen en insectos bloqueo de receptores sensoriales responsables de la selección de la fuente de alimento. Teniendo en cuenta que dicho bloqueo puede ser producido por compuestos que reaccionan con grupos -SH de estructuras sensoriales de insectos. se evaluó la inhibición alimentaria producida por compuestos reactivos de sulfhidrilo (N-alquil maleamatos de metilo) sobre Triatoma infestans (vinchuca), principal vector de la enfermedad de Chagas en nuestro país. El tratamiento de ninfas V de T. infestans con los compuestos sintetizados produjo bloqueo total de la percepción de la fuente de alimento. La efectividad fue mayor para los isómeros cis puros respecto a los correspondientes cis-trans. Cuando predomina la via de ingreso cuticular, la mayor efectividad fue para los compuestos de cadena sustituyente más larga (DL50=1.9μg/i para cis octilo vs 16.3μg/i para cis etilo por aplicación tópica) (DL50=3.2μg/cm² para cis octilo vs 136.5μg/cm² para cis etilo por interposición de tela tratada). La exposición continua de poblaciones experimentales de T. infestans produjo disminución poblacional significativa durante 250 días (para cis butilo) hasta más de 400 días (para cis etilo). El estudio de la respuesta de vinchucas tratadas a fuentes de estímulo químico y térmico demostró correlación de efecto antialimentario con bloqueo de termoreceptores. El uso de inhibidores alimentarios en el control de poblaciones de Triatoma infestans, representan una alternativa promisoria en el control de insectos plaga con compuestos selectivos de bajo riesgo ambiental.

El receptor de factor de crecimiento semejante a la insulina (IGF-IR) pertenece a la familia de los receptores con actividad de tirosina quinasa (RTK) tipo II, su ligando más afín es el factor de crecimiento semejante a la insulina tipo I y es un factor clave en el desarrollo y la progresión del cáncer. Está demostrado que el IGF-IR es un requerimiento absoluto para el establecimiento y mantenimiento del fenotipo transformado, no siéndolo para el crecimiento de células normales, por lo que se lo considera un blanco ideal en la terapia antitumoral. Previamente demostramos que el bloque in vitro de la expresión del IGF-IR, utilizando oligodeoxinucleótidos antisentido (ASODN) al ARNm del IGF-IR, resultó en la inhibición de la proliferación mediada por el acetato de medroxiprogesterona (progestágeno sintético) de células C4HD pertenecientes a un tumor mamario murino progestágeno-dependiente. El objetivo del presente trabajo fue inhibir in vivo el crecimiento del tumor mamario C4HD empleando dos estrategias antisentido diferentes. En la primera estrategia, demostramos que la administración diaria intratumoral o sistémica en ratones hembra BALB-c de un ASODN fosfotiolado (AS[S]ODN) al IGF-IR resultó en la inhibición del crecimiento in vivo del tumor C4HD. El tratamiento indujo una disminución significativa en el volumen tumoral y en la velocidad de crecimiento, sin observarse ningún signo de toxicidad en los ratones tratados. El efecto antitumoral fue específico debido a su dosis-dependencia y a la falta de efecto en ratones tratados con [S]ODN sentido. Dado que la activación del IGF-IR resulta en la estimulación de varias cascadas intracelulares, incluyendo la vía de las proteínas quuinasas activadas por mitógenos (MAPK) y la vía de la fosfatidil-inositol-3-quinasa/Akt (PI-3K/Akt), decidimos estudiar que vías estaban afectadas por el bloqueo in vivo de la expresión de IGF-IR. Los tumores obtenidos de ratones tratados con AS[S]ODN mostraron disminución en la expresión y fosforilación del IGF-IR y en la fosforilación del sustrato del receptor de insulina-1, inhibición de la activación de PI-3K/Akt y p42/p44MAPK. Más aun, la inhibición in vivo de la expresión del IGF-IR resultó en la inhibición de la fosforilación del ErbB-2 y del ErbB-3 (RTK tipo I) y la inhibición de la formación del heterodímero ErbB-2/ErbB-3, demostrando in vivo la existencia de una interacción jerárquica entre IGF-IR y los ErbBs. Sin embargo, no encontramos regulación en la expresión y/o activación del receptor de progesterona inducida por el tratamiento in vivo con el AS[S]ODN. Por otra parte, numerosas evidencias indican que el efecto antitumoral del bloqueo de la expresión del IGF-IR involucra también una respuesta inmune del huésped. Por lo tanto en la segunda estrategia experimental, evaluamos la capacidad que tiene la inoculación de células tumorales C4HD tratadas con AS[S]ODN al IGF-IR para proteger de un posterior desafío tumoral y estudiamos la respuesta inmune desencadenada. Para ello, se inyectaron repetidamente ratones hembra BALB-c con células del tumor C4HD tratadas in vitro con el AS[S]ODN e irradiadas y se desafiaron luego con el tumor C4HD. La inmunización con células tratadas con el AS[S]ODN indujo una inhibición significativa del crecimiento del tumor C4HD con respecto a los tumores de los grupos controles. El efecto antitumoral resultó ser específico para el tumor C4HD, pues no se observó protección cuando se desafió con los tumores mamarios singeneicos 60HI o LM3. La inmunización en ratones nude no inhibió el crecimiento del tumor C4HD demostrando la dependencia de linfocitos T en el efecto protector. Además, no se detectaron anticuerpos específicos contra el tumor en los sueros de los ratones inmunizados, por lo que se descartó una respuesta de tipo humoral. Mediante ensayos de hipersensibilidad retardada, citotoxicidad por liberación de 51Cr y proliferación de esplenocitos, se confirmó que la inoculación de células tratadas con el AS[S]ODN desencadenó una respuesta inmune de tipo celular. Mediante un ensayo de citotoxicidad, previa depleción selectiva de las poblaciones de linfocitos T CD4+ o CD8+, se demostró que el efecto citotóxico era CD8+-dependiente. La inmunización provocó también la inducción de la producción de IFN-γ por los esplenocitos al ser enfrentados con el tumor, induciendo, a la vez, la lisis de las células tumorales por activación de la vía de muerte de Fas. El aumento de antigenicidad inducido por el tratamiento de las células tumorales con el AS[S]ODN al IGF-IR estuvo acompañado con un aumento en la expresión de la proteína chaperona de péptidos Hsp70 y de la molécula coestimuladora CD86. En conclusión, nuestros resultados demostraron por primera vez que el crecimiento de un tumor mamario puede ser inhibido tanto por la administración directa in vivo de AS[S]ODN al IGF-IR, o a través de la inducción de una respuesta inmune protectora al inyectar inmunógenos derivados de células tumorales tratadas con el AS[S]ODN al IGF-IR.

El balance y control del proceso de degradación y regenaración de la matriz extracelular es crucial para el correcto proceso de reparación tisular y mantenimiento de la arquitectura normal corneal y su transparencia. la principal función de síntesis del queratocito corneal es la de repararla matriz extracelular dañada. Las células epiteliales y queratocitos corneales son los responsables de la síntesis de metaloproteinasas y otras proteasas que van a contribuir a la degradación y remoldeado tisular corneal. Estas proteasas están bajo un estricto control regulador de la activación e inhibición de su actividad proteolítica. Un inhibidor natural de proteasas es el SLPI (inhibidor de proteasas secretado por leucocitos). Trabajos de biología molecular realizados con el péptido SLPI indicaron que su función antiproteasa como componente protector y modulador de procesos inflamatorios y degenerativos residía en el dominio terminal carboxilo. Nuevos estudios in vivo e in vitro demostraron que este péptido presentaba una carga molecular altamente catiónica, descubriendo así la función de péptido secretado por leucocitos en tejido corneal y otras estructuras oculares asociado a procesos infamatorios e infecciones oculares.

Se ha demostrado que los inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina (IECA) atenúan ciertas modificaciones tisulares asociadas al envejecimiento. Numerosas evidencias indican que las especies activas del oxígeno (EAO) están involucradas en el proceso de envejecimiento. El objetivo de esta tesis fue investigar si los IECA poseían algún efecto sobre el metabolismo de las EAO. Con este fin se condujeron experimentos, in vitro e in vivo, para estudiar la posibilidad que los IECA pudieran a) atrapar radicales libres per se, y/o b) inducir las defensas antioxidantes endógenas. Los IECA utilizados fueron enalapril, lisinopril y captopril. Los estudios existentes en la literatura acerca de los efectos protectores de los IECA durante el envejecimiento utilizaron dosis hipotensoras de estos compuestos. Por ende, los resultados no pueden separarse de la acción de los mismos sobre la presión arterial. En el presente trabajo, a fin de poder independizar el efecto beneficioso de los IECA de su acción hipotensora, se estudió en primer lugar el efecto del tratamiento crónico (24 meses) con dosis de enalapril que no afectaran la presión arterial sobre cambios histológicos asociados al envejecimiento normal en ratones. Los resultados indican que, aún en las dosis utilizadas, el tratamiento crónico con enalapril atenúa i) las modificaciones en el peso del riñón y el corazón, ii) las fibrosis renal intersticial y cardíaca, y iii) la disminución del número de mitocondrias en los miocardiocitos asociadas al proceso normal de envejecimiento. En base a estos resultados, se emplearon tratamientos prolongados (11 semanas) con dosis no hipotensoras de enalapril o captopril para estudiar su efecto sobre parámetros de estrés oxidativo en el cerebro, corazón, riñón, hígado, pulmón, eritrocitos y plasma de ratón. Se evaluaron las actividades de las enzimas superóxido dismutasa, selenio-glutatión peroxidasa, catalasa, glutatión reductasa, el contenido de glutatión, a-tocoferol, Bcaroteno, ubiquinol, y los niveles de marcadores de daño oxidativo a los lípidos y las proteínas. Ambos tratamientos incrementaron los niveles de las defensas antioxidantes enzimáticas y no enzimáticas con respecto a los controles no tratados, aunque los resultados no fueron uniformes en cuanto a su magnitud, ni a la variedad de los tejidos involucrados. Esto podría explicarse por la diferente metabolización y/o penetración tisular del enalapril y el captopril. En los eritrocitos, utilizados como un sistema modelo ín vitro, el aumento de las defensas antioxidantes estuvo acompañado por protección contra el daño oxidativo. En ensayos in vitro se evaluó la capacidad antioxidante directa del enalapril, lisinopril y captopril. El captopril es un IECA que posee un grupo sulfhidrilo al que se le han atribuido propiedades antioxidantes, mientras que el enalapril y el lisinopril están desprovistos del mismo. Los resultados indicaron que el captopril posee capacidad atrapadora de radicales libres, aún en las bajas concentraciones plasmáticas que se alcanzan en los usos terapéuticos. Por el contrario, no se pudo detectar una acción antioxidante directa del enalapril y el lisinopril. Por último, se investigó el efecto de la administración prolongada de enalapril sobre las defensas antioxidantes enzimáticas y no enzimáticas en pacientes sometidos a tratamiento hemodialítico crónico. En este modelo se utilizaron dosis hipotensoras de enalapril. Los datos demuestran que los pacientes en hemodiálisis (HD) crónica se encuentran en condiciones de estrés oxidativo cuando se los compara con controles sanos. Además, la administración de enalapril durante por lo menos 6 meses incrementa varias de las defensas antioxidantes en los eritrocitos y el plasma, en relación a los pacientes en HD crónica no tratados con enalapril. La incubación de superóxido dismutasa o de selenio-glutatión peroxidasa en presencia de enalapril o captopril no tuvo efecto sobre las actividades enzimáticas. Esto sugiere que los IECA aumentarían la actividad de las defensas antioxidantes enzimáticas por un mecanismo indirecto. Los niveles plasmáticos de óxido nítrico estaban elevados en los ratones tratados con enalapril o captopril durante 11 semanas. Debido a que se ha demostrado que la sobreproducción de óxido nítrico conduce a un moderado estrés oxidativo, y que éste último es capaz de actuar como un estímulo para la síntesis de las defensas antioxidantes en diferentes sistemas, se postuló que el aumento de las defensas antioxidantes de síntesis endógena inducido por los tratamientos prolongados con enalapril o captopril estaría mediado por la producción de oxído nítrico derivada de la acumulación de bradiquinina. Se concluye que el aumento de las defensas antioxidantes enzimáticas y no enzimáticas sería uno de los mecanismos mediadores de los efectos protectores demostrados por los IECA en el envejecimiento, así como en diversas situaciones experimentales y clínicas. Este efecto de los IECA abriría nuevas perspectivas con respecto a los mecanismos que subyacen las acciones terapéuticas de estas drogas.

El presente trabajo se realizó para aportar información sobre el comportamiento contráctil del miocardio frente a los agentes inhibidores de las fosfodiesterasas de nucleótidos - cíclicos y su relación con dichos nucleótidos. Se decidió investigar la interacción entre los niveles - intracelulares de AMPc y GMPc y la actividad de la proteína - quinasa AMPc-dependiente luego de la administración de los in hibidores de las fosfodiesterasas en corazón de rata aislado y perfundido,debido a los resultados contradictorios previamente descriptos para dichos inhibidores en diferentes especies (41,84-85,104-105,118,145-147). Como así también para - tratar de esclarecer el rol del GMPc en la mecánica cardíaca ya que se ha sugerido que dicho nucleótido modula el efecto - inotrópico positivo del AMPc (71,130-131,143,148-154).

En el presente trabajo de tesis se realizó el estudio de inhibidores fisiológicos y farmacológicos de la H+-ATPasa mitocondrial de tripanosomatídeos, con el fin de esclarecer el mecanismo de acción de la enzima de parásito, aportando mayores evidencias que permitan establecer posibles diferencias y similitudes con la enzima de mamífero. 1.- Se aisló y estudió el inhibidor peptidico (IF1) de la H+—ATPasdae T.cruzi y C.fasciculata. Los resultados obtenidos fueron los siguientes: a) Las partículas submitocondriales de T.cruzi y C.fasciculata filtradas a través de una columna de Sephadex G-50, aumentaron su actividad 3-4 veces, debido a la separación del IF1 de la enzima. El inhibidor de T.cruzi retenido en la columna de Sephadex G-50, se recuperó por aumento de la fuerza iónica del buffer en presencia de DTT y EDTA. b) Para la obtención de IF1 de la H+—ATPasade fracción mitocondrial de T.cruzi y C.fasciculata se procedió según el siguiente esquemade trabajo: I.- ruptura mecánica de las células con perlas de vidrio. II.- centrifugación diferencial para la obtención de fracción mitocondrial. III.— sonicación en buffer pirofosfato para la obtención de partículas submitocondriales. IV.- tratamiento con colato y precipitación fraccionada con (NH4)2SO4 para la obtención de la H+-ATPasa. V.- calentamiento y precipitación alcohólica con el fin de aislar al inhibidor proteico. c) La actividad del inhibidor se puso de manifiesto cuando se incubaron particulas activadas en presencia de IFl, en un volumen reducido para evitar la disociación y con el agregado de ATP-Mg para generar un estado conformacional transitorio de la enzima que permita la formación del complejo enzima-inhibidor. d) Los estudios de inhibición realizados determinaron la posibilidad de establecer interacciones entre la H+-ATPasa y el inhibidor de un mismo origen (interacciones homólogas), como asi también entre la enzima e inhibidor de distintos orígenes (interacciones heterólogas). Esto evidencia la existencia de importantes analogías entre las H+-ATPasas y los inhibidores proteicos de distintas especies. e) Se observó inhibición de la fracción soluble de la enzima (F1-ATPasa) de T.cruzi indicando que no seria necesaria la presencia de los componentes de membrana para que IF1 interactúa con la subunidad catalitica. f) El inhibidor de C.fasciculata resultó ser sensible a la inactivación por tripsina, similar a lo observado para el inhibidor de higado de rata y de corazón bovino. g) Por filtración del inhibidor proteico a través de una columna de HPLC-C18 con gradiente de acetonitrilo, se obtuvo un pico máximoa 35% de acetonitrilo que presentó actividad de inhibidor. Dicho valor de gradiente se asemeja al de elución de IF1 de corazón bovino y de C.utilis. h) El peso molecular calculado para IF1 de C.fasciculata por electroforesis en gel de poliacrilamida al 10 y 15% en presencia de SDS fue 8000-8500 ± 1500. Dicho valor se corresponde a los publicados para IF1 de otros organismos. Los datos obtenidos demuestran que las caracteristicas del inhibidor proteico de T.cruzi y C.fasciculata son similares a las descriptas para otros inhibidores. 2) Se demostró la regulación de la cadena respiratoria y la H+-ATPasa mitocondrial de T.cruzi y C.fasciculata por poliaminas. Los resultados se describen a continuación: a) Las fracciones mitocondriales de C.fasciculata aisladas en presencia de putrescina, espermidina y espermina presentaron mayor velocidad de consumo de oxigeno y disminución de la actividad de hidrólisis de ATP. b) En partículas submitocondriales de T.cruzi y C.fasciculata se observó inhibición de la H+-ATPasa por incubación con espermina, efecto posiblemente atribuido a la formación del complejo ATP-espermina, debido a que la inhibición por espermina se revierte con el aumento de la concentración de Mg2+ en el medio de reacción. c) La cinética de inhibición de la H+-ATPasade partículas submitocondriales de T.cruzi incubadas con espermina fue de tipo no competitivo. La fracción soluble Fl-ATPasa de T.cruzi no presentó inhibición. La inactivación por espermina de la H+—ATPasa de particulas submitocondriales de C.fasciculata fue de tipo competitivo y mixto, observándose aumento del Km y disminución de la Vmax. En la fracción F1-ATPasa de la enzima de C.fasciculata se observó inhibición de tipo competitivo. d) Las células de T.cruzi cultivadas en ausencia de poliaminas, presentaron una marcada activación de la enzima H+-ATPasa. Los presentes datos indican que las poliaminas intervienen en los procesos de regulación de los niveles de energia intracelulares de los tripanosomatideos similar a lo observado para células de mamíferos. 3) Se estudió la actividad de la H+-ATPasa de C.fasciculata y L.seymouri en presencia de drogas. Los resultados obtenidos muestran que: a) El crecimiento de C.fasciculata y L.seymouri fue inhibido por el agregado al medio de cultivo del nitrofurano nifurtimox y de la naftoquinona CG 8-935. b) La actividad de la H+—ATPasade fracción mitocondrial obtenida de C.fasciculata y de L.seymouri cultivadas con el agregado de droga al medio no presentó modificación. c) La incubación de partículas submitocondriales con el nitrofurano nifurtimox y con la naftoquinona CG 8-935 directamente en el medio de medida, produjo la inhibición de la actividad de la H+-ATPasa de C. fasciculata, de L.seymouri y de T.cruzi. d) La incubación de la fracción mitocondrial de C.fasciculata y de L.seymouri con el sistema generador de oxi-radicales xantina-xantina oxidasa no produjo inhibición de la H+-ATPasa a diferencia de lo observado con T.cruzi. e) La presencia de grupos -SH en la enzima H+-ATPasa de C.fasciculata y L.seymouri se puso de manifiesto incubando la fracción mitocondrial con reactivos específicos para grupos sulfhidrilos (NEM, CMB y FMA). Los resultados demostraron que los grupos -SH de la enzima de C.fasciculata se encuentran menos expuestos a dichos reactivos que en la enzima de L.seymouri. En ambos casos el FMA fue el inhibidor más efectivo, seguido por CMB y NEM.Estos datos concuerdan con lo observado para la enzima de T.cruzi. Los datos obtenidos sugieren sutiles diferencias entre las enzimas de C.fasciculata y L.seymouri, mientras que dichas diferencias se acentúan aún más al compararse con la enzima de T.cruzi.

Se sabe que los productos naturales constituyen una de las mayores fuentes de materia prima para el desarrollo de medicamentos y agentes antimicrobianos, debido a su diversidad química y a que se les supone una toxicidad inicial limitada al encontrarse en seres vivos. Requieren menor costo de obtención y procedimientos relativamente sencillos, si se comparan con los procedimientos de obtención por la vía de la síntesis química. Las fuentes vegetales de inhibidores peptídicos de proteasas (IPPs) han sido escasamente exploradas y tienen la ventaja de su extraordinaria riqueza y diversidad y, en muchos casos la inexistencia de patentes y procedimientos de extracción, dificultan su explotación. Los estudios referidos a material botánico de la flora latinoamericana son más escasos aún. Por ello, resulta de sumo interés el estudio de nuevos IPPs de origen natural para su potencial implementación como aditivo natural alimentario; así como el estudio de su vehiculización al sistema gástrico cuando forman parte de alimentos, sus absorciones, estabilidades y acciones orgánicas en tejidos centrales y periféricos.

El objetivo principal de este trabajo de investigación ha sido estudiar el mecanismo de inhibición de la sintesis de ácidos nucleicos del virus de la fiebre aftosa para favorecer la producción de un tipo de subparticula viral:las procápsides (también llamadas particulas vacías o particulas 7SS). Para ello fue necesario inhibir 1a formación de nuevas moléculas de ARN utilizadas en la sintesis de las particulas virales infecciosas —los viriones-, sin afectar la sintesis de las proteinas estructurales que dan origen a las procápsides. Las procápsides del virus aftoso poseen todas las propiedades antigénicas de los viriones pero carecen de ARN infeccioso. Una vacuna antiaftosa preparada con este tipo de antígeno posibilitaria mejorar sensiblemente la capacidad inmunogénica de la misma, ya que no requeriría de los procesos de inactivación a que son sometidas las vacunas convencionales.