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Planteo del problema: la otoesclerosis es una patología que en sus formas clínicas de hipoacusia mixta neurosensorial presenta un desafío diagnóstico no resuelto. El aporte de las imágenes no ha significado una ayuda, debido a técnicas complejas y de difícil interpretación. Se propone una técnica de medición densitométrica en tomografía computada con 10 puntos sobre la cápsula laberíntica para determinar focos de reabsorción o fijación ósea. Objetivos: determinar sensibilidad y especificidad de una nueva técnica de medición densitométrica en tomografía computada de pacientes con otoesclerosis. Material y métodos: se comparan 2 grupos. Un grupo control de 20 oídos sanos, y un grupo problema de 30 pacientes. A todos se les realiza medición de densitometría en Unidades Hounsfield (U.H.) de acuerdo a técnicas sencillas (7 a 10 puntos de medición). Resultados: en el grupo control se hallaron los siguientes valores de referencia: promedio y desviación estándar 2038+-64 U.H. en el grupo problema se hallaron valores por fuera del rango, determinándose un valor de 203 U.H. en más o menos del promedio, como valor altamente sugestivo de enfermedad (sensibilidad 80.8% y especificidad 85%).

El tratamiento prolongado con acetato de medroxiprogesterona (MPA) en ratones de la cepa BALB/c induce carcinomas mamarios de histología ductal, que expresan receptores de estrógenos y progesterona, y son metastásicos en pulmón y ganglio linfático. Estos tumores se mantienen in vivo por pasajes singeneicos, siendo hormono-dependientes (HD) ya que requieren del agregado exógeno del MPA para crecer, y no crecen en animales sin tratar con MPA. Se seleccionaron variantes hormono-independientes (HI) a partir de los tumores HD que comenzaron a crecer en los animales sin MPA. Estos tumores HI son capaces de crecer en animales sin tratar con MPA, pero mantienen los receptores hormonales. Los tumores HI presentan una respuesta diferencial a1 tratamiento con l7-ᵝ-estradiol (E2) y los antiprogestágenos mifepristona y onapristona. Se los clasifica en respondedores, aquellos tumores HI que inhiben su crecimiento in vivo por el tratamiento hormonal, y no respondedores a aquellos que no regresionan por el tratamiento. En la primera parte de este trabajo se estudió el cariotipo de los tumores HD (n=5) y sus variantes HI (n=ll) con técnicas de citogenética clásica (bandeo G) y molecular (hibridación in situ fluorescente, FISH), con el objetivo de relacionar el número de cromosomas y las alteraciones del cariotipo presentes con las características biológicas de los tumores. Tres de los 5 tumores HD (60%) presentaron un número de cromosomas en el rango diploide (ratón normal, 2n=40), mientras que los tumores HD que presentaron números modales en el rango triploide a tetraploide fueron estudiados en pasajes muy avanzados. Los tumores HI en pasajes tempranos presentaron números modales diploides. En pasajes tardíos la mayoría de los tumores HI (8 de los ll estudiados) presentaron cariotipos en el rango triploide a tetraploide. Todos los tumores presentaron alteraciones numéricas y estructurales de sus cromosomas. No se observó una alteración común a todos los tumores, o que estuviera asociada con la dependencia hormonal. Sin embargo, podemos inferir que los tumores con números modales diploides responderán al tratamiento con E2 y antiprogestágenos. Las alteraciones más frecuentes fueron ganancia de los cromosomas 3, 4 y 6 (entre el 50% y 60% de los tumores) y pérdida de los cromosomas 16 y X (en el 70% y 100% de los tumores, respectivamente). En un análisis global, la pérdida del cromosoma X resultó significativa. Se observaron numerosas translocaciones, que involucraron a los cromosomas 4 y 7 con mayor frecuencia (presentes en tres de las cuatro familias tumorales con alteraciones evaluables), observándose el mismo punto de ruptura para el cromosoma 7. Por otra parte, las alteraciones presentes en los tumores HD se conservan en los pasajes tempranos del crecimiento autónomo. En base a estos resultados podemos concluir que los tumores inducidos por el MPA serían diploides, y que con el continuo pasaje in vivo puede aumentar el número de cromosomas. La adquisición de la hormono-indepedencia no es causada por el aumento de la ploidía, y los tumores HI conservarían el cariotipo diploide de los tumores HD en los pasajes tempranos. El aumento del número de cromosomas y la adquisición de nuevas alteraciones sería posterior a la adquisición de la hormono-independencia y ocurriría como consecuencia del aumento de los pasajes. La ocurrencia en pasajes más tempranos de variaciones en el cariotipo observada en los tumores HI con p53 mutado, respecto de los tumores HI con p53 normal, podría estar asociada a las mutaciones en p53. Sin embargo, en el tumor HD la presencia de p53 mutado no está acompañada de inestabilidad cromosómica, sugiriendo que serían necesarios otros factores además de dichas mutaciones. En la segunda parte del trabajo se estudiaron los cambios del cariotipo durante el establecimiento de líneas celulares a partir de carcinomas mamarios murinos HD y HI. Se analizaron las variaciones en ploidía y de las alteraciones cromosómicas a lo largo de los repiques de las 8 líneas celulares obtenidas. Las líneas celulares conservaron el número de cromosomas diploide de los tumores parentales en los primeros repiques, este número de cromosomas aumentó con los posteriores pasajes in vitro, y se estabilizó en el rango triploide en 5 de las 8 líneas celulares, sugiriendo que éste les daría cierta ventaja para el crecimiento en cultivo. Sin embargo, una de las líneas celulares mantiene su cariotipo diploide hasta repiques avanzados. Todas las líneas celulares conservan los cromosomas marcadores de los tumores parentales a través de los repiques, pero 7 de las 8 líneas adquieren alteraciones nuevas desde repiques muy tempranos. Podemos concluir que el aumento de la ploidía se vería favorecido por el avance de los repiques. Por otra parte, los cromosomas marcadores del tumor no se pierden por el continuo cultivo in vitro, pero se favorece la formación de nuevas alteraciones. El conocimiento del cariotipo permitió, además de caracterizar las líneas celulares, discernir sobre el origen de una de las líneas establecidas. En resumen, en este trabajo de tesis se investigó la evolución cariotípica de diferentes tumores mamarios murinos en su evolución desde la hormono-dependencia hacia la independencia, y de las líneas celulares derivadas. En nuestro conocimiento, este es el primer informe del estudio citogenético en relación con la independencia hormonal en tumores mamarios murinos. Los genes ubicados en los sitios de ruptura de las translocaciones observadas, como por ejemplo Aurora C, merecen ser estudiados en investigaciones futuras.

1- Las penta-O-benzoíl-α-D-manopiranosas selectivamente marcadas con benzoílo (carbonilo-14C), se prepararon mediante benzoilación por fusión de derivados de metil-α-D-manopiranósidos parcial o totalmente bonzoilados. Esta reacción, permitió reemplazar grupos metilo, tritilo y/o etiliden por benzoílos con rendimientos aceptables. Se propuso una interpretación mecanística de la misma. 2- Se demostró la ausencia de migraciones intramoleculares del tipo 0->0 de los grupos benzoílos en la reacción de fusión. 3- Se comprobó que el grupo l-O-benzoílo de la penta-O-benzoíl-α-D-manopiranosa intercambia con los benzoílos presentes en el medio de reacción durante la fusión benzoilante. Bajo condiciones análogas no se observó intercambio de los grupos benzoiloxi de los carbonos restantes (C-2, C-3, C-4, C-6). 4- Se efectuó un estudio detallado de las conformaciones preferenciales de los derivados manopiranósicos. 5- Se discutieron los mecanismos propuestos por otros autores, para explicar en la amonólisis metanólica de acil derivados de monosacáridos, la formación de N-acil-glicosilaminas y l,l-bis(acilamido)-l-desoxi-polioles. 6- Se determinaron las contribuciones individuales aparentes de los grupos benzoílos de la penta-C-benzoíl-α-D-manopiranosa, a la formación de 1,1-bis (benzamido)-1-desoxi-D-manitol y N-benzoíl-D-manopiranosilamina, siendo los valores determinados para esta última, los primeros que se establecen para una N-acil-glicosilamina. 7- En base a los valores de contribución obtenidos y a los mecanismos considerados se postuló la existencia de un intermediario común, a partir del cual, se formarían N-benzoíl-D-manopiranosilamina y 1,l-bis(benzamido)-l-desoxi-D-manitol. 8- Los valores de contribución de los distintos grupos benzoílo a la formación de D-manosa-dibenzamida se correlacionaron con los obtenidos respectivamente por otros autores para D-glucosa-dibenzamida, D-galactosa-dibenzamida y L-arabinosa-dibenzamida. 9- Se propuso una interpretación para explicar la mayor contribución relativa, del grupo 2-O-benzoílo de la penta-O-benzoíl-α-D-manopiranosa, respecto a las contribuciones de los benzoiloxi en el carbono análogo de los derivados piranósicos benzoilados de D-glucosa, D-galactosa y L-arabinosa, a la formación de la aldosa-diamida respectiva. 10- Se prepararon las siguientes sustancias no descriptas en la literatura: a- Metil-2-O-bcnzoíl-3-O-nitro-4,6-O-etiliden-α-D-manósido. b- Metil-2-O—benzoíl-4,5-O-etiliden-O-α-D-manósido. c- Metil-2,3-di-O-benzoíl-4,6-O-etiliden-α-D-manósido. d- Metil-2-O-benzoíl(carbonilo-14C)-3-O-nitro-4,6-O-etiliden-α-D-manósido. e- Metil-2-O-benzoíl(carbonilo-14C)-4,6-O-etiliden-α-D-manósido. f- Metil-2-O-benzoíl(carbonilo-14C)-3-O-benzoíl-4,6-O-etiliden-α-D-manósido. g- Metil-2,3-di-O-benzoíl(carbonilo-14C)-4,6-O-etiliden-α-D-manósido. h- Metil-2,3,4-tri-O-benzoíl(carbonilo-14C)-6-O-tritil-α-D-manósido. i- Metil-2,3,4-tri-O-benzoíl(carbonilo-14C)-6-O-benzoíl-α-D-manósido. j- Metil-2,3,4-tri-O-benzoíl-6-O-benzoíl(carbonilo-14C)-α-D-manósido, k- Metil-tetra-O-benzoíl(carbonilo-14C)-α-D-manósido. l- l,3,4,6-tetra-O-benzoíl-2-O-benzoíl(carbonilo-14C)-α-D-manosa. m- l,4,6-tri-O-benzoíl-2,3-di-O-benzoíl(carbonilo-14C)-α-D-manosa. n- l,4,6-tri-O-benzoíl(carbonilo-14C)-2,3-di-O-benzoíl-α-D-manosa. ñ- 2,3,4-tri-O-benzoíl(carbonilo-14C)-1,6-di-O-benzoíl-α-D-manosa. o- l,2,3,4-tetra-O-benzoíl-6-O-benzoíl(carbonilo-14C)-α-D-manosa. p- 2,3,4,6-tetra-O-benzoíl(carbonilo-14C)-l-O-benzoíl-α-D-manosa.

Los perros son los principales reservorios domésticos de Trypanosoma cruzi, el agente causal de la Enfermedad de Chagas. Con el objetivo de estudiar la dinámica poblacional de los perros de Amamá y localidades vecinas (Provincia de Santiago del Estero, Argentina), se realizaron 8 censos cada 6 meses desde Mayo de 1994 a Diciembre de 1997. La abundancia varió muy poco entre años desde 294 hasta 345 perros. La tasa instantánea de crecimiento poblacional (r = 0,016/semestre) no fue significativamente diferente de 0. El 96% de las viviendas habitadas tenían uno o más perros (media, 3,1 perros por casa). La distribución de edades presentó una estructura estable, con un 76% de perros con 3 o menos años de edad, y un 75% de machos. Un 34% de las hembras tuvieron al menos una parición en los 6 meses previos, con una camada promedio de 5,1 cachorros que no fluctuó estacionalmente. En un análisis de factores clave de mortalidad, el sacrificio de los cachorros fue el único factor estadísticamente significativo, pero no se halló evidencia de que actuara en forma densodependiente. La probabilidad de morir específica por edades tuvo la típica forma en U de los mamíferos grandes, y fue superior en las hembras que en los machos. La población de perros se hallaría en estado estacionario y regulada por los propietarios mediante la manipulación de la tasa de mortalidad de los cachorros recién nacidos, especialmente hembras. La reacción de inmunoensayo enzimático (ELISA)fue utilizada para detectar anticuerpos específicos anti-T. cruzi en sueros de 182 perros mestizos rurales también analizados por hemoaglutinación e inmunofluorescencia indirectas. El 86% de los sueros tuvieron resultados concordantes para todas las técnicas serológicas. La especificidad de ELlSA fue del 96,2%. Entre 34 perros adultos con xenodiagnóstico positivo, la sensibilidad estimada fue del 94% para ELlSA e IFI. ELISA es la técnica de elección para la vigilancia serológica de infecciones por T. cruzi en poblaciones de perros de áreas que han sido rociadas con insecticidas. Se investigó si el perro podría ser un eficaz centinela de la transmisión vectorial de T. cruzi en el contexto de la fase de vigilancia. La seroprevalencia global de T. cruzi en la población canina disminuyó del 65,0% (54/83) en 1992, antes de un rociado con deltametrina, al 38,5% (70/182) en 1994, y al 15.2% (36/237) en 1996. Se registraron 12 cachorros nativos infectados nacidos después del rociado. De 13 variables consideradas en un análisis por regresión logística múltiple, las que resultaron significativamente asociadas con la probabilidad de estar infectado fueron (i) el número de Triatoma guasayana capturado en el domicilio para el período 1993-94, y (ii) la seropositividad a T. cruzi de la madre, y el número de perros cohabitantes infectados para 1995-96. La evidencia sugiere que los casos nuevos de infección podrían explicarse por diferentes rutas de transmisión que implicarían a T. guasayana como un vector secundario durante la vigilancia. Con el objetivo de investigar la contribución de los animales domésticos a la transmisión vectorial de T. cruzi, se construyó un modelo matemático de la dinámica poblacional de Triatoma infestans estructurado por estadios, a tiempo continuo, con una dependencia respecto de la temperatura en el tiempo de desarrollo de cada estadio y en la tasa de oviposición de las hembras. y que incorpora estocasticidad demográfica. La abundancia de T. infestans presentó fluctuaciones estacionales con un pico de densidad en los meses de verano. La abundancia promedio de triatominos en la vivienda y la amplitud de las oscilaciones dependió del tipo y número de hospedadores presentes. La incorporación de una gallina durante la estación cálida produjo un incremento del 40% en la densidad promedio de triatominos y oscilaciones de mayor amplitud. Cuando se enfrentó a humanos y perros susceptibles a distintas prevalencias de infección por T. cruzi en el vector, los perros se infectaron más rápidamente que los humanos. La inclusión de estocasticidad demográfica permitió una buena descripción de la evolución del sistema, estimar la probabilidad de que el sistema persista y de la ocurrencia de un evento de infección.

Steizel, Sebastián

Los cardiomiocitos poseen en la membrana diferentes transportadores iónicos encargados de regular el pH intracelular (pHi). Cuando el pHi es ácido existen dos mecanismos alcalinizantes responsables de dicha regulación: el intercambiador Na+/H+ (NHE) y el co-transportador Na+/HCO3- (NBC). Estudios previos describen la isoforma 1 de un NBC electrogénico (NBCe1) que en miocardio presenta una estequiometría 1 : 2 (Na+ : HCO3-) y que, además, posee dos bucles extracelulares con propiedades regulatorias (bucles 3 y 4). Experimentos realizados en miocitos aislados demuestran que el bloqueo del bucle 3 inhibe la actividad del NBCe1 y que el bloqueo del bucle 4 la aumenta.Las anhidrasas carbónicas (AC) son una familia de metaloenzimas que catalizan la hidratación reversible del dióxido de carbono (CO2) para producir ácido carbónico (H2CO3) que espontáneamente se hidroliza en HCO3- y H+. Resultados previos demuestran que las AC interaccionan con NHE y NBC formando lo que se conoce como metabolón de transporte iónico. De esta manera, las AC proveen de los iones necesarios para el funcionamiento de dichos transportadores, favoreciendo así la actividad de los mismos.Durante la isquemia-reperfusión (I/R) se producen cambios de pHi, que llevan a la activación de NHE y NBC, a la acumulación intracelular de Na+ y secundariamente a la de Ca2+, por activación del modo reverso del intercambiador Na+/Ca2+. La sobrecarga de Ca2+ es uno de los factores responsables de las alteraciones por I/R. Por lo tanto, las ¨intervenciones cardioprotectoras¨ han sido asociadas a una disminución de la concentración intracelular de este ion. Una de ellas es la llamada ¨reperfusión ácida (RA)¨. En la RA se perfunde al corazón con una solución de pH ácido, lo que reduce la actividad de los mecanismos alcalinizantes como consecuencia de la reducción del gradiente de H+ entre el citoplasma y el exterior celular. Esta menor actividad lleva a una menor sobrecarga de Na+ y por lo tanto, a una menor sobrecarga de Ca2+.El exceso de Ca2+ citosólico determina el aumento de la concentración de este ion en la mitocondria, que conduce a la formación y/o apertura de un poro de alta conductancia denominada poro de permeabilidad transitoria mitocondrial (PPTM). Este evento está ligado a las alteraciones mitocondriales por I/R y a la liberación de factores involucrados en la muerte celular.Distintos mediadores impactan sobre la membrana de los cardiomiocitos y producen la activación de cascadas de señalización que culminan en la mitocondria. Estas cascadas involucran a diferentes proteínas quinasas, entre ellas a las activadas por mitógenos (MAPK), perteneciendola p38 a una de sus subfamilias. Con respecto a esta proteína quinasa, existen estudios que muestran su papel cardioprotector, mientras que otros señalan su participación en la injuria generada por la I/R.Por todo lo expuesto, el objetivo general de este trabajo de tesis fue examinar la contribución del NBCe1 y de la AC a las alteraciones miocárdicas y mitocondriales producidas por I/R, analizando las vías de señalización involucradas. Específicamente, nuestro estudio se abocó a determinar los efectos de bloqueantes de NBCe1 y AC sobre el tamaño de infarto, la función miocárdica post-isquémica, la capacidad de retención de Ca2+ mitocondrial, la sensibilidad del PPTM al Ca2+ y el potencial de la membrana mitocondrial (Δψm). Otro de los objetivos de esta investigación fue analizar la participación de la p38MAPK en los efectos observados en las distintas intervenciones.Para cumplir con estos objetivos corazones aislados de rata Wistar de 4 a 5 meses de edad, perfundidos por el sistema de Langendorff, fueron sometidos a una isquemia global normotérmica de 30 minutos y luego reperfundidos durante 1 hora. Otros corazones fueron tratados durante los primeros 10 minutos de la reperfusión con un anticuerpo contra el bucle 3 del NBCe1 (a-L3) o con benzolamida (BZ, inhibidor de AC). En otro grupo experimental los corazones fueron tratados durante los 10 minutos previos a la isquemia y los primeros 10 minutos de la reperfusión con 6-etoxozolamida (ETX, inhibidor de AC). Para el protocolo de RA, los corazones fueron perfundidos durante los primeros 3 minutos de la reperfusión con una solución de pH = 6.4. En este grupo la reperfusión se completó hasta alcanzar los 60 min con la solución de pH = 7.4.La aplicación de 30 minutos de isquemia global y 60 minutos de reperfusión produjo un tamaño de infarto de aproximadamente 32 %. Este valor disminuyó significativamente con los tratamientos aplicados, llegando a aproximadamente 10, 6, 11 y 9 % en los grupos a-L3, BZ, ETX y RA, respectivamente.La función sistólica miocárdica disminuyó aproximadamente un 80 % al final del período de reperfusión. El tratamiento con a-L3, BZ, ETX y RA mejoró la recuperación post-isquémica del miocardio y los parámetros evaluados alcanzaron valores mayores a los obtenidos en el CI y S (62, 71, 62 y 55 % respectivamente vs. 20 %). La función diastólica también mejoró con todos los tratamientos. El aumento de la presión diastólica final observado durante la reperfusión fue significativamente menor en los corazones tratados con a-L3, BZ, ETX y RA.Las alteraciones mitocondriales detectadas en la reperfusión fueron significativamente atenuadas por los tratamientos. Así, la despolarización mitocondrial (Δψm aproximadamente -95mV) observada en el grupo no tratado fue revertida totalmente, adquiriendo en los grupos tratados con a-L3, BZ, ETX y RA valores aproximados a -140 mV, que fueron similares a los obtenidos en corazones no isquémicos. Las muestras mitocondriales procedentes de los corazones tratados también mostraron una recuperación de la capacidad de retención de Ca2+ y de la respuesta a dicho ion asociada a una menor apertura del PPTM.Con respecto a la p38MAPK, su expresión disminuyó a 41 % en los corazones sometidos a I/R pero aumentó significativamente en presencia de a-L3, BZ, ETX y RA, adquiriendo valores de alrededor de un 135 %. Con el objeto de determinar una posible vía de activación de p38MAPK y un posible blanco de dicha quinasa, evaluamos la expresión de calcineurina (fosfatasa dependiente de Ca2+) y la proteína de choque térmico 27 (en inglés Heat Shock Protein 27, HSP27) en todos los grupos experimentales. Nuestros datos muestran que la expresión de calcineurina aumentó mientras que la de HSP27 disminuyó en los corazones no tratados. El bloqueo del NBCe1, la inhibición de AC y la RA disminuyeron el contenido de calcineurina y aumentaron el de HSP27.Los datos de este trabajo de tesis también muestran que la administración de SB202190, inhibidor de p38MAPK, anula todos los efectos beneficiosos observados en los corazones tratados con a-L3, BZ, ETX y RA.Por lo tanto, los resultados obtenidos en este trabajo de tesis muestran que el bloqueo del bucle extracelular 3 del NBCe1 con a-L3, la inhibición de AC con BZ o ETX y la RA:1- Disminuyen el tamaño del infarto y aumentan la recuperación post-isquémica de la función sistólica y diastólica miocárdicas.2- Mejoran el estado mitocondrial, atenuando la despolarización y recuperando la capacidad de retención y de respuesta al Ca2+.3- Promueven una disminución de la expresión de calcineurina Aβ y un aumento del contenido de P-p38MAPK y P-HSP27.Estos datos indican que una reducción en la sobrecarga de Ca2+, consecuente a una actividad reducida de los mecanismos alcalinizantes, podría producir una menor activación de calcineurina y una activación de la vía p38MAPK-HSP27 que llevaría a la mejora mitocondrial, blanco final de la cardioprotección. Además, estos resultados sugieren que los tratamientos aquí ensayados podrían servir como posibles herramientas terapéuticas para atenuar los daños miocárdicos y mitocondriales producidos por la I/R.

Los cardiomiocitos poseen en la membrana diferentes transportadores iónicos encargados de regular el pH intracelular (pHi). Cuando el pHi es ácido existen dos mecanismos alcalinizantes responsables de dicha regulación: el intercambiador Na+/H+ (NHE) y el co-transportador Na+/HCO3- (NBC). Estudios previos describen la isoforma 1 de un NBC electrogénico (NBCe1) que en miocardio presenta una estequiometría 1 : 2 (Na+ : HCO3-) y que, además, posee dos bucles extracelulares con propiedades regulatorias (bucles 3 y 4). Experimentos realizados en miocitos aislados demuestran que el bloqueo del bucle 3 inhibe la actividad del NBCe1 y que el bloqueo del bucle 4 la aumenta. Las anhidrasas carbónicas (AC) son una familia de metaloenzimas que catalizan la hidratación reversible del dióxido de carbono (CO2) para producir ácido carbónico (H2CO3) que espontáneamente se hidroliza en HCO3- y H+. Resultados previos demuestran que las AC interaccionan con NHE y NBC formando lo que se conoce como metabolón de transporte iónico. De esta manera, las AC proveen de los iones necesarios para el funcionamiento de dichos transportadores, favoreciendo así la actividad de los mismos. Durante la isquemia-reperfusión (I/R) se producen cambios de pHi, que llevan a la activación de NHE y NBC, a la acumulación intracelular de Na+ y secundariamente a la de Ca2+, por activación del modo reverso del intercambiador Na+/Ca2+. La sobrecarga de Ca2+ es uno de los factores responsables de las alteraciones por I/R. Por lo tanto, las ¨intervenciones cardioprotectoras¨ han sido asociadas a una disminución de la concentración intracelular de este ion. Una de ellas es la llamada ¨reperfusión ácida (RA)¨. En la RA se perfunde al corazón con una solución de pH ácido, lo que reduce la actividad de los mecanismos alcalinizantes como consecuencia de la reducción del gradiente de H+ entre el citoplasma y el exterior celular. Esta menor actividad lleva a una menor sobrecarga de Na+ y por lo tanto, a una menor sobrecarga de Ca2+. El exceso de Ca2+ citosólico determina el aumento de la concentración de este ion en la mitocondria, que conduce a la formación y/o apertura de un poro de alta conductancia denominada poro de permeabilidad transitoria mitocondrial (PPTM). Este evento está ligado a las alteraciones mitocondriales por I/R y a la liberación de factores involucrados en la muerte celular. Distintos mediadores impactan sobre la membrana de los cardiomiocitos y producen la activación de cascadas de señalización que culminan en la mitocondria. Estas cascadas involucran a diferentes proteínas quinasas, entre ellas a las activadas por mitógenos (MAPK), perteneciendo la p38 a una de sus subfamilias. Con respecto a esta proteína quinasa, existen estudios que muestran su papel cardioprotector, mientras que otros señalan su participación en la injuria generada por la I/R. Por todo lo expuesto, el objetivo general de este trabajo de tesis fue examinar la contribución del NBCe1 y de la AC a las alteraciones miocárdicas y mitocondriales producidas por I/R, analizando las vías de señalización involucradas. Específicamente, nuestro estudio se abocó a determinar los efectos de bloqueantes de NBCe1 y AC sobre el tamaño de infarto, la función miocárdica post-isquémica, la capacidad de retención de Ca2+ mitocondrial, la sensibilidad del PPTM al Ca2+ y el potencial de la membrana mitocondrial (Δψm). Otro de los objetivos de esta investigación fue analizar la participación de la p38MAPK en los efectos observados en las distintas intervenciones. Para cumplir con estos objetivos corazones aislados de rata Wistar de 4 a 5 meses de edad, perfundidos por el sistema de Langendorff, fueron sometidos a una isquemia global normotérmica de 30 minutos y luego reperfundidos durante 1 hora. Otros corazones fueron tratados durante los primeros 10 minutos de la reperfusión con un anticuerpo contra el bucle 3 del NBCe1 (a-L3) o con benzolamida (BZ, inhibidor de AC). En otro grupo experimental los corazones fueron tratados durante los 10 minutos previos a la isquemia y los primeros 10 minutos de la reperfusión con 6-etoxozolamida (ETX, inhibidor de AC). Para el protocolo de RA, los corazones fueron perfundidos durante los primeros 3 minutos de la reperfusión con una solución de pH = 6.4. En este grupo la reperfusión se completó hasta alcanzar los 60 min con la solución de pH = 7.4. La aplicación de 30 minutos de isquemia global y 60 minutos de reperfusión produjo un tamaño de infarto de aproximadamente 32 %. Este valor disminuyó significativamente con los tratamientos aplicados, llegando a aproximadamente 10, 6, 11 y 9 % en los grupos a-L3, BZ, ETX y RA, respectivamente. La función sistólica miocárdica disminuyó aproximadamente un 80 % al final del período de reperfusión. El tratamiento con a-L3, BZ, ETX y RA mejoró la recuperación post-isquémica del miocardio y los parámetros evaluados alcanzaron valores mayores a los obtenidos en el CI y S (62, 71, 62 y 55 % respectivamente vs. 20 %). La función diastólica también mejoró con todos los tratamientos. El aumento de la presión diastólica final observado durante la reperfusión fue significativamente menor en los corazones tratados con a-L3, BZ, ETX y RA. Las alteraciones mitocondriales detectadas en la reperfusión fueron significativamente atenuadas por los tratamientos. Así, la despolarización mitocondrial (Δψm aproximadamente -95 mV) observada en el grupo no tratado fue revertida totalmente, adquiriendo en los grupos tratados con a-L3, BZ, ETX y RA valores aproximados a -140 mV, que fueron similares a los obtenidos en corazones no isquémicos. Las muestras mitocondriales procedentes de los corazones tratados también mostraron una recuperación de la capacidad de retención de Ca2+ y de la respuesta a dicho ion asociada a una menor apertura del PPTM. Con respecto a la p38MAPK, su expresión disminuyó a 41 % en los corazones sometidos a I/R pero aumentó significativamente en presencia de a-L3, BZ, ETX y RA, adquiriendo valores de alrededor de un 135 %. Con el objeto de determinar una posible vía de activación de p38MAPK y un posible blanco de dicha quinasa, evaluamos la expresión de calcineurina (fosfatasa dependiente de Ca2+) y la proteína de choque térmico 27 (en inglés Heat Shock Protein 27, HSP27) en todos los grupos experimentales. Nuestros datos muestran que la expresión de calcineurina aumentó mientras que la de HSP27 disminuyó en los corazones no tratados. El bloqueo del NBCe1, la inhibición de AC y la RA disminuyeron el contenido de calcineurina y aumentaron el de HSP27. Los datos de este trabajo de tesis también muestran que la administración de SB202190, inhibidor de p38MAPK, anula todos los efectos beneficiosos observados en los corazones tratados con a-L3, BZ, ETX y RA. Por lo tanto, los resultados obtenidos en este trabajo de tesis muestran que el bloqueo del bucle extracelular 3 del NBCe1 con a-L3, la inhibición de AC con BZ o ETX y la RA: 1- Disminuyen el tamaño del infarto y aumentan la recuperación post-isquémica de la función sistólica y diastólica miocárdicas. 2- Mejoran el estado mitocondrial, atenuando la despolarización y recuperando la capacidad de retención y de respuesta al Ca2+. 3- Promueven una disminución de la expresión de calcineurina Aβ y un aumento del contenido de P-p38MAPK y P-HSP27. Estos datos indican que una reducción en la sobrecarga de Ca2+, consecuente a una actividad reducida de los mecanismos alcalinizantes, podría producir una menor activación de calcineurina y una activación de la vía p38MAPK-HSP27 que llevaría a la mejora mitocondrial, blanco final de la cardioprotección. Además, estos resultados sugieren que los tratamientos aquí ensayados podrían servir como posibles herramientas terapéuticas para atenuar los daños miocárdicos y mitocondriales producidos por la I/R.

Trabajo final de posgrado (Especialización en Contabilidad Superior y Auditoría) -- Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Económicas; Argentina, 2017.