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Las señales de calcio son utilizadas por una enorme variedad de células para regular procesos tan distintos como la fertilización o la muerte celular, entre muchos otros. La versatilidad del ión calcio como agente señalizador se basa en la gran diversidad de comportamientos que su concentración puede desplegar dentro de las células. Desentrañar la compleja trama de mecanismos que determinan dichos comportamientos es un enorme desafío que requiere la combinación de estrategias múltiples tanto experimentales como de modelado. En particular, el amplio rango de escalas espaciales y temporales involucradas no puede ser abarcado con un unico tipo de experimentos y es entonces que la elaboración de modelos que permitan conectar observaciones dispares se vuelve indispensable. Por otro lado, para que los modelos puedan cumplir este rol es necesario contar con estimaciones confiables, idealmente obtenidas in situ, de algunas de las cantidades que caracterizan a los fenómenos físicos y químicos involucrados en las señales. El objetivo de esta Tesis ha sido avanzar en la obtención de estas estimaciones realistas realizando experimentos opticos y desarrollando el marco teórico necesario para extraer información cuantitativa de los mismos. Una de las propiedades pobremente caracterizadas es la tasa a la que el calcio se transporta dentro de las células. Existen distintas técnicas opticas para estimar coeficientes de difusión, entre las que se encuentran la espectroscopía de correlación de fluorescencia (FCS) o la recuperación de fluorescencia tras fotoblanqueo (FRAP). La aplicación de las mismas al caso del calcio no es totalmente directa, ya que este ión no sólo difunde al entrar al citosol a través de canales específicos, sino que también reacciona con distintas sustancias (“buffers”) que poseen las células. Para describir este tipo de transporte es posible definir coeficientes efectivos, que contienen información sobre la difusión y las reacciones. Estudios preliminares habrán mostrado la existencia de más de un coeficiente de este tipo. Una de las contribuciones de esta Tesis ha sido estudiar de forma detallada la información que es posible extraer a partir de experimentos de FCS en donde la sustancia observada difunde y reacciona. En particular, se demostró que las técnicas de FCS y FRAP brindan información sobre coeficientes distintos, que puede ser combinada para inferir tasas de reacción yo de difusión libre. Se realizó este estudio teórico para el caso en que la sustancia de interés está marcada fluorescentemente y cuando existen moléculas marcadas y no marcadas en el mismo sistema. Parte de los resultados fueron aplicados para explicar las diferencias observadas en experimentos de FCS y FRAP, realizados para deter minar el coeficiente de difusión del producto del gen bicoid en embriones de moscas Drosophila melanogaster, una sustancia fundamental para el establecimiento del eje dorsoventral en este organismo. La aplicación de técnicas opticas para estudiar el transporte de calcio en células presenta dificultades adicionales. En primer lugar, la observación de la distribución del calcio se hace de modo indirecto, mediante fluoróforos que reaccionan con este ión y cambian sus propiedades espectrales como por ejemplo, aumentar notablemen te la fluorescencia al ligar calcio. Es decir, la sustancia observable (indicador ligado a calcio) está permanentemente transformándose en otra. Por otro lado, para poder inferir a partir de ella la distribución de calcio libre es necesario conocer propiedades del indicador que típicamente no son provistas por quienes lo comercializan, como por ejemplo, los coeficientes de difusión. Otra de las contribuciones de esta Tesis ha sido establecer las bases para la determinación de los coeficientes de difusión y tasas de reacción del calcio y sus fluoróforos, en células. Para tal fin se hicieron, en primer lugar, experimentos de FCS en distintos tipos de soluciones conteniendo calcio e indicador. Se trabajó simultáneamente en los desarrollos teóricos necesarios para el análisis de los mismos. De su aplicación se pudieron determinar coeficientes de difusión y parámetros de reacción en solución. Entre los experimentos se realizó un subconjunto conteniendo calcio, indicador y un “buffer” adicional. A partir del estudio detallado de estos ultimos se elaboró una propuesta de cómo obtener estos coeficientes en células intactas donde las propiedades de los “buffers” presentes son desconocidas. La versatilidad de las señales intracelulares de calcio depende, entre otras cosas, de la distribución espacial y de la cinética de los canales a través de los cuales los iones ingresan al citosol. Entre estos, los receptores de inositol (1,4,5)-trifosfato (IP3 R) constituyen una de las vías más importantes para este ingreso. Estos canales se encuentran en la membrana del retículo endoplasmático organizados en cúmulos que se supone son de unos 100 nm de lado y que están, a su vez, separados por algunos milímetros entre sí. Los canales se abren cuando ligan calcio e IP3 R el que, en condiciones fisiológicas, es sintetizado a partir de elementos presentes en la membrana plasmática cuando la célula recibe una señal. La distribución inhomogénea de los canales junto con el efecto del calcio liberado sobre la probabilidad de aper- tura se combinan para dar lugar a una jerarquía de señales que van desde las muy localizadas hasta las ondas que viajan por toda la célula. Contar con información cuantitativa sobre la geometría de los cúmulos y sobre la cinética de los canales in situ es fundamental para entender la variedad de señales que pueden evocarse. Experimentalmente es posible observar las señales usando los fluoróforos antes mencionados e induciendo la apertura de los canales con IP3 , que es introducido en la célula en forma enjaulada y posteriormente fotoliberado con luz ultravioleta. Otra de las contribuciones del presente trabajo de Tesis ha sido el diseño e implementación de una adaptación relativamente barata de un microscopio confocal Olympus FV1000 para realizar este tipo de experimentos. La habilidad del sistema para fotolizar compuestos enjaulados fue comprobada en distintas situaciones experimentales. Por otro lado, la potencia que llega a la muestra y el tamaño de la zona iluminada fueron cuantificados. Finalmente, en el trabajo se ha mostrado también que con esta adaptación es posible generar un est ́mulo preciso y controlado de IP3 simultáneamente a la obtención de imágenes confocales de señales de calcio, registrando y caracterizando a las mismas en ovocitos de Xenopus Laevis.

El trigo es considerado actualmente el principal cultivo a escala mundial. Es una de las especies vegetales más consumidas del mundo junto con el arroz, el maíz y la papa. Una de las enfermedades que afecta a este cultivo es producida por Pyrenophora tritici-repentis (Died.) Drechs. se la conoce como “mancha amarilla” considerada internacionalmente como la enfermedad del trigo que más se relaciona con las prácticas de laboreo que dejan los restos culturales en la superficie del suelo.El objetivo de este trabajo fue aportar información acerca del patosistema Triticum aestivum - P. tritici-repentis, en cuanto a conocer la composición de aislamientos del patógeno asociados a cultivos de trigo locales, su caracterización morfobiométrica y bioquímica, su variabilidad patogénica y la respuesta de cultivares frente a la infección del hongo. En este estudio se generó una colección de 155 aislamientos nativos de Pyrenophora triticirepentis, los cuales fueron caracterizados morfoculturalmente en 44 morfotipos los que se agruparon en ocho grupos a una distancia de similitud del 50%. Para evaluar el espectro de virulencia del total de los aislamientos se realizaron dos pruebas de patogenicidad una en el año 2003 y una en el 2004 sobre cultivares nacionales y extranjeros, determinándose especialización fisiológica para 19 y 33 aislamientos respectivamente. Por otra parte se llevaron a cabo estudios con marcadores de tipo isoenzimáticos, se revelaron el total de los aislamientos bajo el sistema de estearasas, fosfatasas y peroxidasas. Para el primero de ellos se observaron dos alelos con cinco variantes cada uno y para los otros dos un alelo con cinco y cuatro variantes respectivamente. Del análisis de los genotipos se obtuvieron 12 grupos para una distancia genética del 50%. En ninguno de los estudios se observó correlación entre el comportamiento propio de cada aislamiento y el origen geográfico o de cultivar. Tampoco se observó asociación entre los diferentes caracteres evaluados. Si se observó que 31 grupos de aislamientos a pesar de ser de origen diferente se comportaron de manera similar independientemente del estudio realizado.

Tesis de doctorado para obtener el grado de Doctora en Ciencias Biológicas, presentada en la Universidad Nacional de Tucumán, Facultad de Agronomía y Zootecnia en diciembre de 2018

Tomato spotted wilt virus (TSWV) (Tospovirus, Bunyaviridae), agente etiológico de la enfermedad ‘peste negra’, se encuentra entre los diez virus más devastadores, ocasionando considerables pérdidas económicas en cultivos hortícolas del mundo. Su genoma está compuesto por tres segmentos de RNA de cadena simple: ¨Small¨ (S), ¨Medium¨ (M) y ¨Large¨ (L). El RNA S es ambisense y codifica dos proteínas: la NSs, proteína no estructural y supresora del silenciamiento génico, y la nucleocápside (N). El RNA M también es ambisense y codifica las proteínas NSm, proteína de movimiento célula a célula del virus y el precursor de las glicoproteínas Gn y Gc de la envoltura. El RNA L es de polaridad negativa y contiene un único ORF que codifica la polimerasa (RdRp). El control de la ‘peste negra’ es muy complejo principalmente debido al amplio rango de hospedantes tanto del TSWV como del vector, diferentes especies de trips (Thysanoptera, Thripidae), y a la inefectividad de los insecticidas para el control del mismo. La utilización de cultivos resistentes, es la estrategia de manejo más adecuada y más sustentable, la cual se ha aplicado tanto para pimiento como para tomate. En pimiento la resistencia a TSWV ha sido adquirida mediante el gen Tsw de Capsicum chinensis, el cual se introgresó a pimientos comerciales (pimientos Tsw+). En tomate, la fuente de resistencia está dada por el gen Sw-5b, proveniente de la especie silvestre Solanum peruvianum L. Este gen también ha sido incorporado por mejoramiento clásico, obteniéndose los cultivares de tomate Sw-5b+. En el Cinturón hortícola platense (CHP) se incorporaron variedades de pimiento Tsw+ y de tomate Sw-5b+, controlando la enfermedad durante varios años, pero en 2008 comenzaron a observarse plantas de pimiento Tsw+ con sintomatología de ‘peste negra’. Esto sugería la emergencia de una nueva población viral, capaz de quebrar la resistencia. En este trabajo de tesis, se realizó una caracterización genotípica y biológica de 6 aislamientos provenientes de pimientos Tsw+, y 5 aislamientos de tomates Sw-5b-. Así, se determinó que la única especie de tospovirus presente en el CHP es TSWV, se estudió el rango de hospedantes de los aislamientos y su comportamiento en distintos cultivares de pimientos Tsw+ y Tsw-, y de tomate Sw-5b+ y Sw-5b-. Estos estudios confirmaron la capacidad de los aislamientos de quebrar la resistencia conferida por el gen Tsw en pimiento, caracterizándose como aislamientos RB (resistance-breaking). Estos aislamientos RB, además, tienen la capacidad de infectar pimientos Tsw- y tomates Sw-5b-, no infectando tomates Sw-5b+. Esto indica que no se observa un quiebre de resistencia en tomate, en ensayos de invernáculo. Con los aislamientos encontrados tanto en pimiento como en tomate, se realizaron análisis filogenéticos en base a la secuencia del gen N, encontrándose que los mismos provienen de una misma población ancestral y se hallan filogenéticamente relacionados a aislamientos del clado asiático (China y Corea del Sur). Mediante el análisis de mutaciones en la secuencia de la proteína NSs de los RB de pimiento, asociadas al quiebre de la resistencia, de nuestros aislamientos y otros aislamientos RB, no se observó un patrón de sustituciones aminoacídicas que se conserve entre todos los RB anotados en el GenBank. Por tanto, no se puede inferir el tipo de aislamiento de TSWV mediante la secuencia del gen NSs. La adaptación de los aislamientos RB a pimientos Tsw+ podría significar un costo en el fitness en hospedantes Tsw-. Por lo tanto, se realizaron ensayos que permitieron determinar el fitness de un aislamiento representativo, en pimientos Tsw+ y Tsw-, donde se cuantificó el título viral (mediante la optimización de un protocolo de RT-qPCR específico). Los resultados mostraron que existe una mayor diferencia en el fitness entre los cultivares Tsw+ que la observada con el cultivar Tsw-. Esto sugiere que la presencia del gen Tsw no sería el único factor que interviene en el fitness de los aislamientos y que la adaptación de los RB a pimientos Tsw+, no significó un costo en el fitness en cultivares Tsw-. En cuanto a los 5 aislamientos de tomate, se determinó la secuencia del gen NSm, con el fin de conocer la presencia de sustituciones aminoacídicas características de aislamientos RB de tomate. Los análisis mostraron que estos aislamientos son WT (wild-type) para tomate, lo cual concuerda con los resultados de los ensayos biológicos, que muestran que estos 5 aislamientos no son capaces de infectar tomates portadores del gen Sw-5b.

La Fusariosis de la espiga de trigo o Fusarium Head Blight en trigo es una enfermedad severa a nivel mundial, en Argentina al menos 20 epidemias de variable intensidad se han registrado en los últimos 50 años. Fusarium graminearum sensu stricto es el principal agente etiológico de la enfermedad para esta región. Como resultado de la infección, los granos de trigo ven modificada tanto su composición química como sus propiedades físicas con la consiguiente alteración de características de calidad en los productos de panificación. Los daños ocasionados por la infección se agravan por la presencia de micotoxinas, las cuales son perjudiciales tanto para la salud humana como animal. La constitución física de los granos se relaciona con su textura y dureza, y su composición química, define el valor nutricional y las propiedades tecnológicas de las harinas. Los mercados son cada vez más exigentes y se interesan por el contenido de proteínas, aminoácidos, almidón, aceites, lípidos y demás componentes, y paulatinamente se reduce la tolerancia a sustancias contaminantes y/o micotoxinas. Dentro de los principales criterios para la determinación de la calidad de los granos se encuentran: el contenido y constitución de las proteínas, variables de rendimiento como ser la pérdida de peso en los granos por espiga y el peso de mil granos, y presencia de micotoxinas. La calidad el gluten de las harinas de trigo depende de la constitución genética de la planta así como de diversos factores ambientales e interacciones con microorganismos. La variación alélica en las fracciones de gluteninas de alto peso molecular (HMW-GS) está directamente relacionada con las propiedades físicas de la masa elaborada a partir de estas harinas. La micotoxina deoxinivalenol (DON) es la que se relaciona en primer término con la enfermedad, por lo cual se la considera una toxina indicadora de infección. Esta Tesis Doctoral aporta conocimientos relacionados con la diversidad genética de la especie Fusarium graminearum y el daño producido en granos de trigo, en cuanto a cambios composicionales y presencia de toxinas, en relación a cambios de calidad.

El Virus de la Diarrea Viral Bovina (BVDV) pertenece al género Pestivirus de la familia Flaviviridae y es causante de importantes pérdidas económicas en la industria ganadera regional y mundial. Las manifestaciones clinicas de la infección son variadas y las pérdidas en la producción ganadera se deben principalmente a la disminución en la producción de leche, retraso en el crecimiento, aumento de infecciones secundarias y aumento de la mortalidad en animales jóvenes. El control epidemiológico de BVDV se realiza a través de programas de vacunación masiva y eliminación de animales persistentemente infectados, principales diseminadores del virus en los rebaños. Los bajos títulos virales obtenidos en cultivo de tejidos constituyen una dificultad importante en la elaboración industrial de vacunas inactivadas. La utilización de cepas atenuadas como vacunas anti BVDV es, por otra parte, un riesgo mayor ya que la aparición de revertantes en un animal pre-infectado con BVDV podría desencadenar la “enfermedad de las mucosas”, que es fatal y en vacas preñadas podría dar origen a una camada de terneros persistentemente infectados. El diagnóstico de las infecciones con BVDV, realizada a través de la detección de anticuerpos en suero bovino por seroneutralización y/o inmunoensayo enzimática (ELISA) también presenta dificultades debidas, entre otras, a la necesidad de contar con infraestructuras adecuadas para el cultivo de células y a los desafios técnicos que presenta la obtención de antígeno purificado. En este trabajo se expresó en sistemas recombinantes y se caracterizó bioquímica e inmunológicamente al principal inmunógeno de BVDV, la glicoproteína E2. La proteína fue expresada en células de mamífero y de insecto, en su forma entera (rE2) y delecionada en su extremo carboxilo terminal de anclaje a membrana (ΔrE2) y se ensayó su desempeño como vacuna y como antígeno para diagnóstico. La proteína recombinante E2 (rE2) presento características electroforéticas e inmunoquímicas idénticas a la E2 viral y resultó ser un potente inmunógeno en bovinos. La incorporación del gen de rE2 en el genoma de un Virus de la estomatitis vesicular (VSV) recombinante permitió, también , la creación de un virus atenuado de VSV (VSV-E2) capaz de inducir una excelente respuesta humoral anti BVDV en ratones y óptima producción de E2 recombinante en células de BHK en cultivo. En este trabajo también se demostró que la proteína ΔrE2 es expresada y liberada al sobrenadante del cultivo de células de Drosophila melanogaster lo que permitió contar con una preparación rápida y relativamente pura de antígeno. Este fue utilizado en un test de ELISA de captura (a través de un anticuerpo monoclonal anti rE2, también desarrollado en el curso de este trabajo de Tesis) que presenta alta sensibilidad y especificidad para la detección de anticuerpos anti BVDV en sueros bovinos.

La mayor parte de la literatura sobre análisis de rendimiento de programas paralelos está orientada a la optimización a cargo del programador. Por lo tanto, supone conocimiento de los algoritmos empleados, su orden de complejidad, su forma de implementación, y en definitiva, asume acceso a los fuentes de esos programas. El instrumental disponible de análisis de rendimiento se basa mayormente, entonces, en propiedades estructurales de los programas, que sólo se hacen evidentes a partir del código fuente. Sin embargo, en ocasiones el analista de rendimiento en Cómputo de Altas Prestaciones se enfrenta al problema de optimizar la ejecución de aplicaciones en cuyo desarrollo no ha intervenido, y de las cuales sólo se tiene la versión final ejecutable. Otras veces se dispone de los fuentes, pero su interpretación es de todos modos costosa, debido a la complejidad de estudiar código escrito por terceros, o debido a la dificultad de comprender el dominio del problema. Si se dispone únicamente de los programas en su versión binaria, las técnicas de predicción de prestaciones que se apoyan en el conocimiento de los fuentes no pueden ser aplicadas, y el analista debe normalmente proceder por ensayo y error. El trabajo que se propone intenta identificar una metodología conveniente para obtener conocimiento acerca de las aplicaciones, en ausencia del código fuente, que permita hacer inferencias sobre su rendimiento en diferentes plataformas, existentes o hipotéticas, con el fin de seleccionar las mejores plataformas para cada aplicación.

La presencia de Mn en aguas subterráneas para consumo humano causa problemas de orden estético y de aceptabilidad, organolépticos, operativos y sanitarios. Los métodos empleados para la remoción de Mn en el agua subterránea se pueden clasificar en: fisico-químicos y biológicos. En estos últimos, el Mn contenido en el agua es oxidado y precipitado con la ayuda de bacterias ambientales que suelen aparecer en forma natural en las aguas subterráneas que contienen Mn. Sin embargo, en estos procesos se alcanza una óptima remoción de Mn únicamente cuando los sistemas contienen comunidades bacteriana apropiadas, es decir, bacterias oxidantes de Mn y formadoras de biofilm.En este trabajo, se evaluaron los microbiomas de dos plantas de tratamiento biológico de aguas subterráneas que actualmente eliminan Mn(II) con alta eficiencia. Por otro lado, se cultivó un gran número de MOB conocidos y varios aislamientos que nunca antes se habían informado como MOB. La cepa MOB-181 del género Pseudomonas, se destacó de las demás por mostrar características de interés. La misma estuvo presente en el sistema de filtración de LT representando alrededor del 4 % del total de las Pseudomonas y pudo cultivarse con facilidad en el laboratorio. Asimismo, demostró buena capacidad de oxidación de Mn(II) en diferentes medios de crecimiento analizados; a diferentes temperaturas; y en presencia de metales inhibidores como el Fe y el propio Mn en altas concentraciones. Resultó ser una excelente formadora de biofilms y pudo oxidar Mn(II) presente en agua cruda mientras estuvo inmovilizada sobre arena. El estudio del rendimiento de la oxidación de Mn(II) de diferentes MOB aisladas en este trabajo permitió postular a MOB-181 como el mejor candidato con potencial para el desarrollo de un inóculo bacteriano aplicable para mejorar el proceso de eliminación de Mn(II) de aguas subterráneas.La oxidación de Mn y la formación de biofilms son dos características deseables para la elección de cepas con potencial uso en los procesos de remoción de Mn de aguas. A fin de determinar si estos dos procesos están relacionados en las MOB, se aplicaron ensayos de morfología de macrocolonia en agar y crioseccionamiento/microscopía para tratar de comprender la oxidación de Mn y la producción de EPS in situ en el modelo de biofilm de macrocolonia. Mediante el simple modelo de biofilm de macrocolonia, se pudo visualizar a los biofilms como sistemas biológicos complejos, donde los distintos grupos celulares están influenciados por un montón de factores, resultando en grupos de células diferentes dependiendo del entorno en el cual se encuentran.Finalmente, se construyó un sistema de filtros a escala laboratorio donde se evaluó la funcionalidad de la inoculación de filtros con MOB-181 en la remoción de Mn del agua. Se demostró que un ensayo de bioaumentación con esta bacteria fue capaz de acelerar el inicio de la remoción de Mn en aguas naturales. Asimismo, se observó que los tiempos requeridos para alcanzar la fase estacionaria de la remocion estaban fuertemente influenciados por las temperaturas, alcanzando más rapido la mayor eficiencia a temperaturas más altas. Estos resultados se utilizarán para optimizar los procesos de remoción de Mn de aguas y para el diseño de mejores tecnologías.

La exposición a contaminantes ambientales conocidos como perturbadores endocrinos altera el desarrollo y función del sistema endocrino afectando a diversas especies. Ciertos perturbadores endocrinos imitan las acciones de estrógenos y se denominan xenoestrógenos. En nuestro trabajo estudiamos los xenoestrógenos, bisfenol A, endosulfán y atrazina. Para el monitoreo de la contaminación ambiental y la evaluación de los efectos de los contaminantes, es importante una adecuada selección de especies centinelas y biomarcadores. El Caiman latirostris (yacaré overo) se encuentra ampliamente distribuido en el noroeste argentino y se utiliza en programas de rancheo. El yacaré posee características ecológicas y fisiológicas que lo convierten en potencial organismo centinela de exposición a xenoestrógenos. Dichas características permiten identificar y seleccionar posibles biomarcadores de exposición a contaminantes con actividad estrogénica. Los xenoestrógenos pueden alterar el desarrollo e histoarquitectura de gónadas, y los perfiles hormonales, aportando potenciales biomarcadores para evaluar en los yacarés. La vitelogenina es una proteína precursora sintetizada en hígado de vertebrados no mamíferos e inducida por acción de estrógenos. La detección de vitelogenina en plasma de yacarés macho podría se utilizada como una herramienta muy importante para el monitoreo de exposición a xenoestrógenos ambientales. Los biomarcadores evaluados en esta tesis resultaron herramientas útiles para determinar actividad estrogénica in vivo. Los estudios realizados permiten mejorar el conocimiento de la biología reproductiva del yacaré y caracterizar biomarcadores para monitorear exposición a xenoestrógenos en diferentes momentos de la vida de los caimanes. Las evidencias obtenidas apoyan la utilidad de Caiman latirostris como centinela de contaminación por xenoestrógenos.