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Polipéptidos relacionados con la interacción hospedante-patógeno en el sistema trigo-roya de la hoja Un problema central de la fitopatologia es esclarecer los mecanismos de defensa a las enfermedades. Se reconoció la presencia de genes específicos que interactúan determinando el tipo de interacción. Los mecanismosmoleculares que determinan si una interacción es compatible o incompatible no han sido aún suficientemente dilucidados. Se postula que los mRNAs y proteinas especificos codificados por estos genes, se inducirían en una etapa temprana en el reconocimiento de ambos organismos. El sistema trigo-roya de la hoja fue elegido como modelo para el estudio de relaciones hospedante-patógeno altamente específicas. Se utilizaron dos lineas isogénicas de trigo (Triticum aestivum) y tres clones genéticamente relacionados del patógeno (Puccinia recondita tritici). Este material con fondo genético común permite la identificación de polipéptidos y de mRNAs específicos inducidos a causa de la infección con el patógeno. En primer lugar se caracterizaron los cambios polipeptidicos inducidos a lo largo del proceso de infección a través del marcado “in vivo“ con 35S-Metionina de proteínas sintetizadas "de novo“. En segundo lugar se caracterizaron los mRNAs inducidos en las distintas interacciones hospedante-patógeno a través de la síntesis "in vitro” de polipéptidos en un sistema libre de células. Se analizaron los patrones electroforéticos de estos polipéptidos en geles desnaturalizantes de poliacrilamida y posterior fluorografia. Curvas de tiempo mostraron que los primeros cambios polipeptidicos tanto "in vivo“ como “in vitro” se detectaron hacia el tercer día del proceso de infección. La comparación de seis interacciones caracterizadas y sus respectivos controles sin inocular permitió asignar la inducción o disminución de determinadas bandas polipeptidicas a interacciones entre genes/alelos del hospedante y genes del patógeno. En este contexto se detectó: a) inducción específica tanto a nivel de RNA como de proteinas en interacciones compatibles (bandas de 85, 15 y 24 kDa) e incompatibles (bandas de 39 y 21,5 kDa). b) disminución específica de polipéptidos "in vivo” (52 y 37 kDa) e “in vitro" (34 kDa). c) dos mRNAs (20,5 y 32,5 kDa) inducidos especificamente en las interacciones que involucran a la raza F01 independientemente del hospedante. Se concluye la existencia de asociaciones entre mRNAs y proteinas inducidas con interacciones compatibles como incompatibles por lo que el reconocimiento específico para el sistema trigo-roya de la hoja podría estar determinado por unas u otras (o ambas) según los genes interactuantes. Se aislaron clones de cDNA diferenciales correspondientes a RNA mensajeros inducidos en el sistema compatible Gamma 1R-F01 hacia el dia 5 del proceso de infección que codificarían para polipéptidos específicos de interacción o específicos de raza. Estos clones podrán ser utilizados para llegar a aislar los genes que intervienen en el reconocimiento de hospedante y patógeno. Simultáneamente se identificó un marcador génico correspondiente a una secuencia codificante de una proteina de reserva (gliadina) que está ligada a alguno de los genes de reacción a roya de la hoja y que podría utilizarse como vía alternativa para aislar los genes de interés.

La exocitosis de gránulos corticales (EGC) es un tipo de secreción regulada por Calcio que involucra un proceso de fusión de membranas esencial para la fecundación. Luego de la fusión del espermatozoide, los gránulos corticales son exocitados y liberan su contenido al espacio perivitelino. Esta secreción difunde hacia la zona pelúcida, y la transforma en una barrera física, evitando así la poliespermia, y asegurando un desarrollo embrionario normal. El mecanismo molecular que media la fusión de membranas durante la EGC se encuentra escasamente caracterizado y se cree que es mediado por la vía de las SNARE (SNAP receptors). El objetivo principal de este trabajo fue investigar si las SNAP (soluble NSF attachment proteins) y NSF (N-ethilmaleimide sensitive factor), proteínas clave en la vía de las SNARE, median la EGC en ovocito. El análisis de la expresión génica mostró que α SNAP, γ SNAP y NSF se expresan en ovocitos de ratón. Ensayos de Western blot mostraron que la expresión de estas proteínas se mantiene en niveles similares durante la maduración y activación temprana del ovocito. Su localización fue observada principalmente en la región cortical, enriquecida en GC. Para evaluar la función de estas proteínas en la EGC, se perturbó a las SNAP y NSF endógenas previo a la activación de ovocitos en metafase II. La microinyección de α SNAP salvaje y de la mutante dominante negativa L294A de α SNAP inhibió la EGC estimulada por Estroncio. NEM, un inhibidor irreversible de NSF y la microinyección de la mutante dominante negativa D1EQ de NSF inhibieron la EGC. La microinyección de los anticuerpos anti-α SNAP y anti-NSF fueron capaces de inhibir la EGC. Para comprender el rol de α SNAP en la fertilidad femenina, utilizamos la cepa de ratones hyh (hydrocephalus with hop gait), portadora de una mutación puntual (M105I) en el gen de α SNAP. Debido a que el ratón knockout para α SNAP es letal embrionario, los ratones hyh proveen un modelo único para el estudio de su función in vivo. Los resultados obtenidos indicaron que las hembras hyh presentan una severa reducción en su fertilidad debido a una combinación de defectos producidos por la proteína mutada. Nuestros resultados revelan que α SNAP, γ SNAP y NSF son expresados en ovocitos de ratón, que α SNAP y NSF son requeridos para la EGC y que la mutación M105I en α SNAP conduce a defectos multifactoriales en la fertilidad de las hembras hyh. Estos datos demuestran por primera vez que α SNAP y NSF juegan un rol importante en la reproducción femenina.

Tesis (Grado Doctor en Ciencias Biológicas)--Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales. Lugar de Trabajo: Laboratorio de Biología Molecular Aplicada - LaBiMAp-Facultad de Ciencias Exactas, Químicas y Naturales FCEQyN-CONICET- Universidad Nacional de Misiones / Universidad Nacional de Córdoba. 2016. 156 h. con Anexos + CD. tabls.; ils.; grafs; Contiene Referencia Bibliográfica y Publicaciones Derivadas de la Tesis.

La coordinación de la expresión génica entre los genomas nuclear, plastídico y mitocondrial es de importancia crucial para las células vegetales. Un caso particular de la interacción núcleo-plástido está dado por los genes nucleares mutadores de cloroplasto, que inducen un dramático aumento de la tasa de mutación espontánea del plastoma. En esta tesis se estudió molecularmente el plastoma de cuatro mutantes inducidas por el mutador de cloroplastos de cebada en las que no se observaron cambios mayores, ni en el tamaño, ni en el arreglo génico del plastoma. Sin embargo, no debe descartarse en las mismas la presencia de alteraciones menores, como pequeñas deleciones, duplicaciones o sustituciones. Por otro lado, se hicieron estudios de expresión génica en la lámina de la primera hoja de una de ellas, la línea citoplásmica 2 (LC2) caracterizada por presentar retraso en la traducción plastídica durante embriogénesis, afectando el desarrollo temprano de los cloroplastos. En la base y el ápice LC2 presentó: a) incremento en los transcriptos de las ARN polimerasas plastídica (NEP) y mitocondrial; b) incremento en la acumulación de ARN mensajeros para genes transcriptos por NEP; c) menor acumulación de ARN ribosomales plastídicos; d) menor acumulación de proteínas tilacoidales. La acumulación de la ARN polimerasa plastídica (PEP) fue similar al control, al igual que los patrones de sus transcriptos. Se observó expresión diferencial de Rubisco entre células del mesófilo y de la vaina parenquimática del haz vascular en el ápice de LC2. Mediante parámetros de fluorescencia de clorofila se comprobó la alteración temprana y posterior recuperación de la fotosíntesis en LC2. Los resultados aportan nuevas evidencias sobre la relación entre la traducción plastídica y el desarrollo de los cloroplastos y muestran a LC2 como un material experimental útil para el estudio de la traducción plastídica y del efecto de ésta y de los plástidos sobre la expresión concertada de los distintos genomas de la célula vegetal.

El objetivo de este trabajo de Tesis es el estudio de la interacción a nivel molecular entre fosfatos (fosfato inorgánico y ácidos fosfóricos y fosfónicos de cadena larga) y superficies de óxidos dc hierro. El estudio dc la adsorción sobre óxidos de hierro de compuestos que contienen el grupo funcional fosfato es de gran interés en varios campos de la ciencia que van desde la química del suelo y las aguas naturales hasta la protección contra la corrosión. Como óxido de hierro modelo se emplearon superficies de hierro pasivadas en medio alcalino y magnetita (Fe3O4), tanto de origen geológico como artificial. geological and artificial. Para el estudio de la adsorción de fosfatos inorgánicos se emplearon soluciones de ortofosfato de sodio (Na3PO4, Na2HPO4 y NaHgPO4). La adsorción de ácidos fosfóricos y fosfónicos dc cadena larga fue estudiada a partir de soluciones de acido dodecanfosfórico (DPA) y ácido octadecilfosfónico (OPA), respectivamente. La interacción fosfato/óxido de hierro fue estudiada mediante una variedad dc técnicas tales como Espectroscopía de Impedancia Faradaica (ElS), Microbalanza de cristal de cuarzo (QCM), Espectroscopía infrarroja de reflexión-absorción por transformada dc Fourier (FT-IRRAS), Espectroscopía infrarroja in situ por transformada de Fourier (Substractively Nonnalized Interracial Fourier InfraRed Spectroscopy, SNIFTIRS), ángulo de contacto, y Espectroscopia electrónica para el análisis químico (ESCA o XPS). Los experimentos SNIFTIRS y QCM indican que a valores altos de pH y bajo control potenciostático, los fosfosfatos inorgánicos forman un complejo superficial bidentado, aunque no puede descartarse totalmente la formación de complejos monodentados. Los experimentos de FT-IRRAS y QCM muestran que los ácidos DPA y OPA forman una monocapa de complejos superficiales bidentados al adsorberse sobre hierro pasivo y magnetita desde soluciones etanólicas. Estos filmes presentan un nivel de ordenamiento bajo, pero continúan ordenándose con el tiempo. Estos resultados son muy interesantes desde el punto de vista de la mejora de la estabilidad de los recubrimientos poliméricos sobre metales. Una parte importante del trabajo presentado aqui fue realizado bajo la dirección del Prof. Dr. Martin Stratmann at the "Institut für Werkstoffwisscnchaften, Lehrstuhl für Korrosion und Oberflächentechnik (LKO), Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg", Erlangen, Alemania.

El barrenador de los brotes de la soja, Epinotia aporema (Lep. Tortricidae) es una importante plaga de leguminosas en América del sur. En Argentina, este insecto ocasiona reducciones en los rindes de soja de hasta el 40%. Estudios preliminares identificaron a un Granulovirus (EpapGV) como un candidato potencial para el control biológico de Epinotia aporema. En esta tesis se aborda la caracterización molecular de EpapGV. Los análisis de microscopía electrónica (ME) de los cuerpos de inclusión (OBs) de EpapGV indicaron que éstos son ovoides con tamaños de 469 (± 37) nm x 242 (± 22) nm y que contienen un virión con forma de bastón, con una única nucleocápside. El OB está formado mayoritariamente por una proteína de 28,5 ± 0,5 kDa cuya secuencia amino-terminal es muy similar a otras granulinas de los Granulovirus. El mapa de restricción del genoma de EpapGV se determinó a partir del análisis de una biblioteca de fragmentos del DNA de EpapGV mediante digestiones con enzimas de restricción, Southern blot y amplificaciones de PCR con primers que apuntaban hacia afuera de los fragmentos virales. Esta última técnica se empleó para asegurar la contigüidad de los fragmentos. El tamaño del genoma se estimó en 120 kbp y se posicionaron los sitios EcoRI, BamHI, Hindlll y Bglll en el mapa físico. El gen de granulina ubicado en el mapa físico por Southern blot, fue clonado y seCuenciado. Este gen tiene 747 nucleótidos de largo y codifica para una proteína de 29 kDa. La secuencia amino terminal deducida de la secuencia nucleotídica coincidió con la secuencia proteica determinada por degradación de Edman, salvo por la ausencia del residuo de la metionina inicial. El análisis de la secuencia 5' permitió detectar una secuencia promotora tardía característica de este gen (ATAAG) ubicada 29 pb upstream al ATG; además, se describió un posible motivo transcripcional situada entre el promotor y el ATG (WCARNA). El análisis de la presencia de genes inhibidores de apoptosis (iap) mediante Southern blot, identificó una región genómica que codifica para un iap con similitud a los iap-3 de los baculovirus. Este gen codifica para un polipéptido de 256 aminoácidos y su secuencia presenta dos motivos BIR y un motivo RING-Finger característicos de estas proteínas. Por otra parte, un análisis filogenético agrupó a EpapGV IAP-3 con proteínas IAP-3 de baculovirus y de lepidópteros. La caracterización de las secuencias parciales del genoma de EpapGV (aproximadamente un 30% del genoma), reveló la presencia de 36 ORFs con homólogos en otros organismos. Por otra parte, se localizaron seis secuencias repetidas del tipo palíndromes imperfectos, distribuidas en diferentes lugares del genoma y repeticiones pequeñas situadas en regiones 5' no codificantes de varios genes. La presencia de ORFs compartidos por pares de fragmentos se usó, entre otras cosas, para confirmar la contigüidad de fragmentos en el mapa físico. El análisis filogenético de los baculovirus obtenido a partir de apilamientos de proteínas mayoritarias de cuerpo de inclusión coincidió con el árbol filogenético generado a partir del alineamiento de 20 proteínas conservadas en todos los baculovirus de lepidópteros totalmente secuenciados. Los resultados indicaron que EpapGV pertenece al grupo I del género Granulovirus y esta muy relacionado con CpGV, pero posee una organización génica diferente. En otro orden de cosas, se ha puesto a punto un ensayo de ELISA de captura para la detección y cuantificación de rutina de EpapGV, basado en anticuerpos policlonales específicos para granuiina de EpapGV. Este ensayo posee una alta sensibilidad para EpapGV, detectando hasta 0,53 ng/ml de granuiina, equivalentes 1.000 OBs por fosa. El ensayo de ELISA permitió cuantificar OBs de EpapGV en diluciones que contenían hasta 5 x 10³ OB por pg de formulado bioinsecticida. Por otra parte, el ensayo se utilizó para determinar el progreso de la infección en larvas, estableciendo la presencia de granuiina a partir de las 24 h p.i. Los resultados de esta metodología indicaron que la misma es una alternativa rápida y barata para la detección y cuantificación de rutina de EpapGV en mezclas complejas. En conclusión, se ha provisto evidencia sustancial sobre el genoma de EpapGV y de su proteína mayoritaria del cuerpo de inclusión. Estos datos avalan la clasificación tentativa del virus aislado de E. aporema dentro del género Granulovirus de la familia Baculoviridae. Finalmente, estos estudios en conjunto con otros realizados por nuestro equipo de investigación, sientan las bases para el registro comercial de este virus que permitirán en el futuro, su uso en agricultura como agente de control biológico de E. aporema.

Trabajos previos de nuestro laboratorio han permitido caracterizar una fosfoproteína novel (p43), intermediaria en la síntesis de esteroides en la zona fasciculata de la corteza adrenal de rata (Paz C. et al. (1994) Eur. J. Biochem. 224:709-716). En la presente Tesis, se describe la caracterización molecular de p43 asi como también la regulación hormonal del transcripto. Los resultados obtenidos mostraron que p43 es homóloga a una acil-CoA tioesterasa mitocondrial. La secuencia aminoacídica deducida de la proteína presentó sitios consenso de fosforilación para diferentes proteínas quinasas y un motíf para serina Lipasa. Anticuerpos dirigidos contra un péptido sintético que incluye dicho motif y otro contra la región N-terminal de p43, bloquearon la actividad biológica de la proteína. El transcripto de p43 fue detectado en ovario de ratas pseudopreñadas, en zona fasciculata y glomerulosa de adrenal de rata, en una línea tumoral de células de Leydig, en cerebro de ratón y en placenta humana. El tratamiento de ratas con dexametasona (Dx) provoca una disminución en los niveles del ARNm de p43 de manera dosisdependiente en adrenales de rata. El tratamiento posterior con ACTH no sólo revierte el efecto de la Dx, sino que produce un aumento rápido (5 min) en los niveles del mensajero alcanzando un máximo a los 15 min (62%) y retornando a los valores basales a los 30 min posteriores al estímulo. El tratamiento con actinomicina D o cicloheximida antes del estímulo con ACTH provoca una disminución o un aumento en los niveles del ARNm de p43 respectivamente. Estos resultados relacionan por primera vez que una actividad de acil-CoA tioesterasa está involucrada en los procesos esteroidogénicos.

El objetivo principal de este trabajo, consistió en el estudio de la información contenida en el genoma del virus Junín, en relación al fenómeno de atenuación de la virulencia. - Como objetivo secundario, se estudió la filogenia en la familia de los arenavirus y se analizaron las relaciones evolutivas entre los mismos. - Además, se diseñó un método para la detección de nuevos arenavirus a nivel molecular, en base al análisis de secuencias mencionado arriba. - Finalmente, se estudió el papel de la proteína de la nucleocápside en la regulación de los procesos de transcripción y replicación en el virus Junín. Con el fin de organizar el contenido y favorecer la presentación de este estudio resultó conveniente la división en capítulos, a saber: introducción, materiales y métodos, análisis y discusión de los resultados, conclusiones generales y referencias bibliográficas. A continuación, se resume brevemente el contenido de cada capítulo. 1. En el primer capítulo, se realiza una descripción introductoria sobre la estructura del virus Junín y su relación con la fiebre hemorrágica. En particular, se analiza la información disponible y los antecedentes bibliográficos que forman el contexto para el desarrollo de este estudio. 2. En el segundo capítulo se describen los materiales y los métodos utilizados en el transcurso de este estudio. 3. En el tercer capítulo se aborda específicamente, el problema de la atenuación de la virulencia en las cepas relacionadas genealógicamente con el virus vacunal, Junín Candid #1. 4. En el cuarto capítulo, se analiza la filogenia en la familia de los arenavirus y las posibles relaciones evolutivas entre los mismos. 5. En el quinto capítulo, se describe el diseño de un procedimiento experimental que permitió caracterizar un nuevo arenavirus. Este trabajo se realizó en colaboración con el Dr. M.E. Lozano y el Lic. D.M. Posik. 6. En el sexto capítulo, se analiza el control de la transcripción en el virus Junín. Este trabajo se realizó en colaboración con el Dr. R.V. Rivera Pomar y el Dr. M.E. Lozano. 7. En el séptimo capítulo, se establecen las conclusiones generales del presente estudio. 8. En el último capítulo, se listan las referencias bibliográficas relacionadas con los capítulos anteriores.

La fracción flagelar de epimastigotes de Trypanosoma cruzi, enriquecida en flagelos y elementos de membrana, ha mostrado en modelos experimentales murinos las mejores propiedades inmunogénicas, protectivas y no agresivas contra el desafío con el T. cruzi Quizás sólo un pequeño número de los componentes de esta fracción están involucrados en esta inmunidad protectiva en el huésped, en tanto que el resto de ellos podrían actuar en otros procesos esenciales para el parásito. Las señales de calcio juegan un papel preponderante en diversos mecanismos de transducción de señales en parásitos, tanto en relación a la invasión a la célula hospedadora como en los cambios morfo-fisiológicos del mismo a lo largo de su ciclo de vida. Asimismo, la alta conservación de las proteínas moduladoras de calcio en distintos tripanosomátidos, ha sugerido su posible implicancia en dichos procesos de transducción. En este trabajo se describe la caracterización a nivel molecular del gen que codifica para una proteína flagelar ligadora de calcio en T. cruzi, y su versión homóloga en Trypanosoma rangeli. Varios clones de ADN recombinante fueron detectados en una genoteca de expresión construida a partir del ADN total de la forma epimastigote de T. cruzi (clon Miranda/76), en el vector de expresión λgt11 , utilizando suero de conejo anti-fracción flagelar. Dos de esos clones recombinantes fueron seleccionados para la caracterización de sus productos de expresión. La expresión de estos clones recombinantes en bacterias produjo proteínas fusionadas a la enzima g-galactosidasa, las que mostraron poseer epitopes reconocidos por anticuerpos dirigidos contra la fracción flagelar del parásito. La adsorción del suero anti-fracción flagelar por las proteínas expresadas, permitió obtener anticuerpos que identificaron por "inmunoblotting" moléculas de 29 kDa en ambos casos, en homogeneizado total de epimastigotes y fracción flagelar, mientras no reaccionaron con antígenos de Leishmania brasiliensis. Posteriormente, el análisis de la secuencia de bases de ambos fragrnentos confirmaron que los insertos provenientes de ambos clones codifican para una misma proteína de 29 kDa. en T. cruzi. La presencia de este antígeno F29 en la superficie del parásito fue comprobada por inmunofluorescencia. La expresión del gen completo que codifica para la proteína flagelar F29 en el vector pMAL-p2 permitió obtener una proteína recombinante fusionada a proteína de unión a maltosa, que mostró ser ligadora de calcio. Cuando se ensayó la inmunogenicidad del antígeno recombinante F29-MBP, utilizando Bordetella pertussiscomo adyuvante, se observó que esta proteína es capaz de generar una respuesta inmune humoral contra el T. cruzi, demostrada por anticuerpos dirigidos contra la proteína pura y el homogenato total del parásito. Los epitopes generadores de respuesta en F29-MBP fueron reconocidos en un gran número de otras proteínas en el parásito, a igual que se mostraron altamente representados en el T. rangeli. El gen que codifica para la proteína flagelar ligadora de Ca++ F29 mostró encontrarse organizado en al menos 20 copias, altamente conservadas entre cepas pertenecientes a distintos zimodemas, adyacentes una a la otra con una disposición cabeza-cola en el genoma del parásito. Dicho gen se expresa en epimastigotes de T. cruzi transcribiendose a un mensajero policistrónico, el cual podría sufrir un procesamiento post-transcripcional de clivaje y poliadenilación, también observado para otros genes del parásito. El perfil encontrado para diferentes clones y cepas de T. cruzi estudiados por hibridización a cromosomas enteros fraccionados por electroforesis en campo pulsado reveló que el gen que codifica para la proteina flagelar F29 se halla ampliamente representado en T cruzi, mostrando una conservación intraspecífica en las cepas y clones evaluados. Asimismo, estos patrones de hibridización mostraron una alta correlación con la clasificación isoenzimática de las distintas cepas y clones analizadas de acuerdo a su perfil isoenzimático basado en 2, 12, 13 y 19 loci. A su vez, la existencia de al menos dos arreglos de repeticiones de genes, ubicados en un par de cromosomas homólogos fue observada al enfrentar la misma sonda a productos de digestión provenientes de la digestión de cromosomas enteros de distintas cepas, con enzimas sin sitios de corte dentro del inserto. La amplificación por reacción en cadena de la polimerasa sobre ADN genómico total de T. rangeli (aislado LDG) usando como iniciadores de la síntesis oligonucleótidos diseñados a partir de la secuencia completa del gen que codifica en T cruzi para la proteína flagelar ligadora de calcio F29, permitió la obtención de un fragmento de ADN que codifica para una proteína de 23 kDa con alta homología con proteínas flagelares responsables de la unión a Ca2+ en otros tripanosomátidos. La hibridación a ARN de T. rangeli reveló que esta proteína se expresa como un transcripto poliadenilado de 1.6 kb, a raiz, al igual que en T. cruzi, de un procesamiento post-transcripcional. El gen que codifica para TrCaBP en T. rangeli tambien se encontró organizado en al menos 20 copias por célula, en dos cromosomas de gran tamaño en ciertos aislados del T. rangeli, y a dos pequeños en otros aislados. Los resultados presentados demuestran que la información genética que codifica para la proteína flagelar ligadora de Ca2+ F29 del T. cruzi se encuentra altamente conservada en el genoma de otros tripanosomátidos, sin encontrarse presente en el género Leishmania.

El Mal de Rio Cuarto es la principal enfermedad del maíz en la Argentina. Es causado por el Mal de Río Cuarto virus (MRCV) y transmitido por una chicharrita de la especie Delphacodes kuscheli. El MRCV pertenece a la familia Reoviridae, género Fijivirus, y tiene la propiedad de multiplicar tanto en plantas de maíz como en el insecto vector. Las particulas virales consisten en una cápside icosahédrica formada por una doble capa de proteínas y contiene en su interior lO segmentos genómicos de RNA de doble cadena (dsRNA) llamados Sl a SlO, siendo el tamaño del genoma de aproximadamente 29 kbp. En los últimos años, y en muchos casos en paralelo con el desarrollo de éste trabajo, se han reportado las secuencias de algunos segmentos de virus relacionados: el MRDV (Maize rough dwarf virus), el FDV (Fiji disease virus), el ODSV (Oat sterile dwarf virus), el genoma completo del RBSDV (Rice black streaked dwarf virus) y del NLRV (Nilaparvata lugens reovirus). En este trabajo se clonaron, secuenciaron y analizaron los segmentos genómicos Sl, S2, S3, S4, S5, S6, S8 y SlO completos del MRCV. Se determinó que todos los segmentos genómicos analizados poseen secuencias 5’ y 3’ terminales conservadas y características del serogrupo al cual pertenece el MRCV: 5’AAGUUUUU3’ (extremo 5’) y 5’CAGCUnnnGUC3’ (extremo 3’). Adyacente a los extremos conservados se encuentran repeticiones de 7 a 12 nucleótidos invertidas e imperfectas que son segmento específicas. La predicción de la estructura secundaria de las cadenas codificantes de todos los segmentos estudiados, muestra que las regiones terminales son capaces de formar estructuras secundarias determinadas y estables que fueron propuestas como señales de replicación y empaquetamiento en virus del género Rotavirus. Se compararon las secuencias de nucleótidos obtenidas y las secuencias de aminoácidos deducidas con las secuencias de otros reovirus depositadas en las bases de datos, y se identificó la presencia de motivos característicos, a menudo indicativos de función. Se determinó que el MRCV Sl codifica para una proteína básica de 168,4 kDa que contiene motivos conservados en las RNA polimerasas dependientes de RNA y es homóloga a las RNA polimerasas codificadas por los virus RBSDV, FDV y NLRV, asi como a las codificadas por miembros de otros géneros de la familia Reoviridae. El MRCV S2 codifica para una proteína de 134,4 kDa y posee homología con las proteínas codificadas por el RBSDV S4, el FDV S2 y NLRV S2. En este trabajo presentamos evidencias de que la proteína codificada en éste segmento es no estructural. El MRCV S3 codifica para una proteína de 141,7 kDa, y hemos demostrado que es la proteína mayoritaria de la cápside interna o “core” viral y posee una alta homología con las proteínas correspondientes codificadas por el RBSDV S2 y FDV S3. El MRCV S4 codifica para una proteina de 131,7 kDa y su función se desconoce. Presenta una relativamente alta homología con miembros del género Fijivirus como así también con otros miembros de la familia Reoviridae. El MRCV S5 codifica para una proteína de 106,9 kDa cuya función se desconoce. Esta proteína presenta homología con las proteínas codificadas por los segmentos S5 del RBSDV y del FDV. El MRCV S6 codifica para una proteína de 90 kDa cuya función se desconoce. Esta proteína presenta una llamativa baja homología con las proteínas codificadas por los segmentos S6 del RBSDV y del FDV. El MRCV S8 codifica para una proteína de 68,3 kDa que contiene un motivo de unión de ATP/GTP que es característico de helicasa. Además la proteína es homóloga con las proteínas codificadas por el RBSDV S8, el MRDV S7, el OSDV S9 y el NLRV S7, todas con probable función de helicasa. El MRCV SlO codifica para una proteína de 63,5 kDa y su probable función sería la de proteína de cápside externa. Esta proteína presenta una alta homología con las proteínas correspondientes codificadas por los segmentos SlO de los virus RBSDV, MRDV y FDV. El análisis de los valores de homología encontrados entre los distintos segmentos del MRCV y los segmentos de virus relacionados, apoyaría la idea de evolución independiente de cada segmento viral. El análisis filogenético realizado con las secuencias obtenidas del MRCV permitió proponer que a pesar de que el MRCV está relacionado con el MRDV y el RBSDV, debe ser considerado una especie diferente del género Fijivirus (Distéfano y col., 2002) y no una raza geográfica del MRDV, como había sido inicialmente propuesto. El análisis filogenético realizado con las secuencias de aminoácidos de polimerasas representativas de todos los géneros de la familia Reoviridae mostró la existencia de dos grupos evolutivos separados: uno agrupa a los Orthoreovirus, Aquareovirus, Orbivirus y Rotavirus, y otro agrupa a los Fijivirus, Cypovirus, Olyzavirus y Coltivirus. Se expresaron algunos de los segmentos virales en estudio en bacterias obteniéndose proteínas de fusión con un péptido rico en histidinas que facilita su posterior purificación. Se obtuvieron antisueros policlonales contra las proteínas codificadas por los segmentos S2, S3, S4 y S6. El antisuero obtenido contra la proteína codificada por el MRCV S3 fue capaz de reconocer específicamente una de las proteína estructurales presentes en partículas virales purificadas del MRCV en un ensayo de “Western blot”. Esta proteina correspondería a la proteína mayoritaria de la cápside interna o “core” viral. En un experimento complementario, un antisuero obtenido contra las proteínas de la partícula viral fue capaz de reconocer a la proteína del MRCV S3 expresada en bacterias. Asimismo el antisuero obtenido contra la proteína codificada por el MRCV S3 reconoce una proteína de tamaño similar al esperado en extractos de plantas enfermas. Mediante experimentos de inmunomicroscopía electrónica sobre cortes de hojas de maíz infectadas el con MRCV se confirmó que la proteína codificada por el S3 del MRCV es una proteína estructural del virus y se demostró que forma parte del “core” viral El antisuero obtenido contra la proteína codificada por el MRCV 82, reconoció específicamente a una proteína de menor tamaño al esperado en extractos proteicos totales de plantas enfermas. Mediante experimentos de inmunomicroscopía electrónica sobre cortes de hojas de maíz infectadas el con MRCV se confirmó que la proteína codificada por el S2 del MRCV seria una proteína no estructural presente en los viroplasmas. En experimentos de “Far-Western blot” se observó que la proteína codificada por el MRCV S3 era capaz de interactuar consigo misma, con una proteína de 130 kDa que correspondería a la espícula viral de tipo B y con la RNA polimerasa dependiente de RNA codificada por el MRCV Sl. En Rotavirus se demostró que las proteínas equivalentes interaccionan entre sí. Los resultados presentados en este trabajo contribuyeron al avance en el estudio del virus que causa la enfermedad del Mal de Río Cuarto, a la clasificación taxonómica del mismo y al estudio de su origen evolutivo. Además los datos obtenidos permitieron el diseño de una estrategia de resistencia al MRCV en plantas transgénicas de maíz basada en el desencadenamiento del silenciamiento génico post-transcripcional (PTGS).