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Tesis (Magister en Ciencias Agropecuarias. Mención Producción Animal)--UNC- Facultad de Ciencias Agropecuarias, 2007.

Fil:Pardo, Patricia Susana. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

El objetivo del presente trabajo de Tesis fue caracterizar las células stem tumorales de melanoma cutáneo, en particular si las células obtenidas luego del tratamiento con inhibidores de la vía de MAPK presentan características de células stem tumorales. En primer lugar se analizó la expresión de CD271 y CD133, marcadores de células stem tumorales de melanoma, en líneas celulares de melanoma humano y en biopsias de pacientes de melanoma metastásico y se encontró que la expresión de los mismos no permite identificar una población con características de células stem tumorales. Con el objetivo de enriquecer en células con características stem tumorales, y considerando que entre las propiedades que se le atribuyen a esta población se encuentra la resistencia a drogas, se estudió el efecto del tratamiento prolongado con inhibidores de BRAF (PLX4032) y MEK (GDC-0973) en líneas celulares de melanoma que presentan la mutación BRAF V600 y son sensibles a estos inhibidores. Se encontró que luego del tratamiento in vitro con los inhibidores PLX4032 y GDC-0973 durante varias semanas, la mayoría de las células moría pero algunas permanecían viables y quiescentes. Se denominó a esta población celular SUR. Al discontinuar el tratamiento, las células SUR retomaron su crecimiento y mantuvieron una sensibilidad a los inhibidores similar a las células parentales. Las células SUR presentan elevados niveles de expresión de los marcadores de células stem tumorales CD271 y ABCB5, pero no de CD133, y presentan características asociadas a senescencia, como la actividad de -galactosidasa. Las células SUR retienen su capacidad tumorigénica, ya que son capaces de generar tumores en ratones inmunodeficientes. Para caracterizar a la población de células SUR en profundidad se realizaron experimentos de secuenciación del exoma y del transcriptoma, además de microarreglos de expresión y microarreglos de proteínas. Las células SUR son lisadas de forma eficiente por linfocitos T citotóxicos que reconocen los antígenos de diferenciación melanocítica MART-1 y gp100. Proponemos la adquisición de un fenotipo con características de células stem tumorales como un mecanismo de resistencia plástico a los inhibidores de BRAF y MEK.

El objetivo general de este trabajo fue estudiar diferentes aspectos de la compleja interacción entre genotipos bacterianos definidos y caracterizados como de alta y baja adaptación a la glándula mamaria (GM) con el hospedador, para poder comprender en parte, el establecimiento y cronicidad de las infecciones intramamarias (IIM) causadas por Staphylococcus aureus en bovinos. Se seleccionó la cepa 806 transitoria (T), cap8, icaACD, agrII, fuerte productora de biofilm, pulsotipo D, ST350 y poco invasiva en células epiteliales mamarias (MAC-T); y la cepa 5011 persistente (P), cap5, icaACD, agrI, blaZ, débil productora de biofilm, pulsotipo O, CC188 y altamente invasiva. La cepa P presentó mayor sobrevida intracelular en MAC-T y macrófagos. MAC-T infectadas con ambas cepas murieron por apoptosis, induciendo la cepa P mayores porcentajes de muerte. Los macrófagos infectados con la cepa P mostraron mayor capacidad fagocítica. La producción de especies reactivas de oxígeno y de óxido nítrico (ON) fue similar para ambas cepas. Los resultados de la IIM experimental difirieron entre ambas cepas, la T indujo aumento del recuento de células somáticas (RCS), ON, IL-1β, IL-6 e IgG total en leche a las 48 hs post-infección (pi); en sangre, indujo una disminución de los monocitos, linfocitos T y CD8. La cepa P, indujo un aumento del RCS a los 7 días pi y del ON 14 días pi. La combinación de factores de virulencia de S. aureus podría determinar el inicio de la interacción patógeno-hospedador e influenciar la respuesta inmune de la GM y la evolución del proceso infeccioso.

Fil:Engel, Juan Carlos. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Tesis (MCI Mención Recursos Hídricos)--FCEFN-UNC, 2015

Los receptores acoplados a proteína G (GPCRs) son los mediadores de las respuestas celulares a una gran cantidad de estímulos, así como también el blanco de muchas drogas terapéuticas. El rol clásico de los GPCRs es acoplar la unión de ligandos a la activación de proteínas G heterotriméricas, que a su vez regulan a múltiples proteínas efectoras. Recientemente se ha demostrado que los modos de señalización de los GPCR son mucho más complejos, involucrando también mecanismos independientes de proteínas G y señalización dependiente de la internalización del receptor. La hormona liberadora de corticotropina (CRH) ejerce un rol clave en la respuesta integrada al estrés. Además de regular la activación del eje hipotálamo-pituitario-adrenal (HPA), CRH está ampliamente distribuida en el sistema nervioso central, donde funciona como un neuromodulador, integrando aspectos comportamentales y afectivos de la respuesta a estrés. Se ha demostrado que la desregulación de la acción de CRH a través de su receptor de alta afinidad, CRHR1, se encuentra involucrada en el desarrollo de estadios patológicos asociados al estrés como ansiedad y depresión. CRHR1 es un GPCR de clase B, que al activarse principalmente se acopla a proteína Gs y lleva a un aumento del segundo mensajero AMP cíclico (cAMP) y la activación de múltiples vías de señalización. Es de particular interés la fosforilación de la MAPK ERK1/2, que induce la transcripción de Pomc para activar el eje HPA en corticotrofos, y se dispara en estructuras del cerebro asociadas a aspectos comportamentales de la respuesta a estrés frente a la estimulación con CRH. Habíamos descripto previamente que CRHR1 activa mecanismos de señalización dependientes de proteína G y otros dependientes de la endocitosis del receptor. Estos dos componentes de respuesta pueden evidenciarse como dos fases diferentes de activación de ERK1/2 en la línea celular hipocampal murina HT22 transfectada establemente con CRHR1 (HT22-CRHR1). En este trabajo, nos focalizamos en la respuesta de cAMP mediada por CRHR1, utilizando métodos clásicos de biología molecular en combinación con biosensores basados en la transferencia de energía resonante de Förster (FRET) para estudiar por visualización dinámica de célula única los mecanismos de señalización de CRH. En primer lugar demostramos que al estimular CRHR1, el aumento en los niveles de cAMP no sólo está mediado por las adenilil ciclasas transmembrana (tmACs) sino también por una adenilil ciclasa soluble (sAC) en las células HT22-CRHR1. sAC es una fuente atípica de cAMP ya que es insensible a proteína G y es regulada por calcio y bicarbonato. Además, se ha reportado que sAC está presente en distintas localizaciones subcelulares, formando microdominios de señalización. La respuesta de cAMP a CRH también se encontró mediada tanto por tmAC como por sAC en la línea celular derivada de corticotrofos AtT20, pero no así en las células 3T3L1-CRHR1. Sin embargo, observamos que tanto en células HT22-CRHR1 como en AtT20, sAC no participa en la señalización de otros ligandos de GPCRs, como isoproterenol o PACAP38, respectivamente. Estos resultados indican que el rol de sAC en la transducción de señales de un GPCR depende del contexto celular y del receptor involucrado. La estimulación con CRH genera un aumento en los niveles de calcio intracelular, y al bloquear la respuesta de calcio se observó un patrón de cAMP y ERK1/2 en respuesta a CRH similar al que se obtiene al bloquear sAC. Esto sugiere que calcio es el activador de sAC río abajo de CRHR1. Luego, nos propusimos caracterizar si ambas fuentes de cAMP contribuyen a un pool común de cAMP o si pueden identificarse roles particulares para cada adenilil ciclasa en la respuesta. Observamos que tanto tmACs como sAC participan en la fase aguda de activación de ERK1/2, pero que en la fase sostenida de fosfo-ERK1/2, dependiente de la internalización de CRHR1, sólo sAC está involucrada. Más aún, demostramos que el CRHR1 continúa generando cAMP desde estaciones endocíticas, y que es sAC la responsable de esta producción una vez internalizado CRHR1. En conclusión, a través de la caracterización de los mecanismos moleculares activados por CRHR1, se hallaron nuevas evidencias que refuerzan el modelo emergente de señalización por GPCR en el que la respuesta de cAMP no ocurre exclusivamente a nivel de la membrana plasmática y donde sAC representa una fuente alternativa de cAMP regulada por GPCRs.

A pesar de la importancia del proceso de fertilización, es aún muy escasa la información disponible acerca de las moléculas involucradas. Las evidencias de nuestro laboratorio indican que las proteínas de la familia CRISP, miembro de la superfamilia CAP, serían claros mediadores del proceso de interacción de gametas. Teniendo en cuenta que las CRISP se expresan principalmente en el tracto reproductor masculino, el primer objetivo de esta Tesis ha sido investigar si las mismas también se expresan en el tracto reproductor femenino y cumplen un rol en el proceso de fertilización. Los resultados obtenidos utilizando los modelos de rata y ratón indicaron que mientras CRISP1 se encuentra presente en útero, oviducto, ovario, y células del cúmulus, CRISP2 se detecta sólo en ovario, y CRISP4 no se expresaría en el tracto de la hembra. Ensayos de fertilización in vitro utilizando espermatozoides y COC (complejos ovocito-cúmulus) provenientes de ratones knockout para CRISP1 indicaron que la proteína presente en el cúmulus cumpliría una función en el proceso de fertilización. Estudios posteriores revelaron que CRISP1 exhibe propiedades quimioatractantes hacia los espermatozoides, sugiriendo que éste podría ser el mecanismo por el cual CRISP1 del cúmulus participa en el proceso de fertilización. Dada la gran homología entre las CRISP y las GLIPR1, las cuales constituyen las dos familias mejor caracterizadas de la superfamila CAP, el segundo objetivo de este trabajo consistió en estudiar la presencia de proteínas GLIPR1 en el tracto reproductor masculino y su participación en la fertilización. Los resultados indicaron la expresión de GLIPR1L1 a nivel testicular y de GLIPR1L2 tanto en testículo como en epidídimo de ratón. La generación de ambas proteínas en forma recombinante y de sus correspondientes anticuerpos confirmó la presencia de las mismas en el espermatozoide y su participación específica en la primera etapa de unión a la zona pellucida. La información obtenida acerca del rol de las proteínas CRISP y GLIPR1 contribuirá a una mayor comprensión de los mecanismos moleculares involucrados en la interacción de gametas como así también al desarrollo de futuros métodos de regulación de la fertilidad tanto en animales como en el humano.

Brucella ovis (B. ovis) es el agente causal de la epididimitis contagiosa del carnero (ECC), principal causa de problemas reproductivos en establecimientos de cría ovina. Si bien la cepa atenuada Brucella melitensis Rev.1 se emplea como herramienta preventiva, presenta numerosas desventajas, por lo cual es necesario el desarrollo de vacunas subcelulares que soslayen estos inconvenientes. Además, dado que B. ovis inicia el proceso infeccioso en la superficie mucosa, una respuesta inmunitaria local protectora constituye un desafío interesante en el desarrollo de vacunas. La quimera BLSOmp31 formulada en adyuvante oleoso y administrada vía parenteral como proteína indujo niveles de anticuerpos e interferón gamma elevados y confirió protección significativa contra el desafío con B. ovis (75%). La vacunación en las mucosas genera una respuesta inmunitaria específica de tipo secretoria y de memoria en el sitio de aplicación del inmunógeno, en otras mucosas y a nivel sistémico. Para lograr una eficaz y sólida respuesta inmunitaria en las mucosas, es crítica la vía de administración de la vacuna subcelular y a su vez el empleo de sistemas de liberación o entrega del inmunógeno que sean adecuados, y/o el uso de potentes adyuvantes. En el presente proyecto de Tesis se diseñaron y caracterizaron formulaciones vacunales basadas en el empleo de la quimera BLSOmp31 para su posterior administración en las mucosas nasal y/o conjuntival del macho ovino. Se evaluó la respuesta humoral y celular (in vivo e in vitro) y la protección conferida contra la cepa virulenta de referencia B. ovis PA76250 mediante el análisis bacteriológico de órganos del tracto reproductor y del sistema fagocítico mononuclear. Se emplearon como sistemas de liberación microesferas de quitosano producidas mediante secado por “spray” y geles termosensibles de Poloxamer P407 para la administración por la vía intranasal y por la vía intranasal y conjuntival respectivamente. Los resultados obtenidos demuestran que las estrategias empleadas indujeron una respuesta humoral y celular que protegió parcialmente contra B. ovis, teniendo en cuenta la proporción de órganos infectados y el número de UFC aislado de los órganos muestreados. Cabe destacar que estos sistemas de inmunización redujeron el porcentaje de infección y el número de bacterias por órgano en un nivel similar al grupo control BLSOmp31-AFI.

La interacción entre los complejos inmunes (CI) y los receptores para el fragmento Fc de las inmunoglobulinas G, induce respuestas inmunes regulatorias y efectoras. En este trabajo, nos propusimos investigar el efecto de los CI precipitantes sobre la diferenciación y las funciones biológicas de las células dendríticas (CD) derivadas de monocitos. Demostramos que el agregado de CI al inicio del cultivo altera la normal diferenciación de las CD. Así, las CD-CI diferenciadas durante 6 días en presencia de CI presentaron una baja expresión de los marcadores CD1a, CD1b, y una alta expresión de los marcadores CD14, MHC II y CD68, en comparación con las CD diferenciadas convencionalmente, sin embargo, no observamos diferencias en la expresión del marcador de células dendríticas CD11c. Estas alteraciones en el fenotipo correlacionaron con alteraciones en la morfología de las CD. Asimismo, evaluamos el efecto de CI solubles y observamos que sólo los CI solubles preparados con ligero exceso de antígeno, ejercieron un efecto sobre la diferenciación de las CD similar al observado con CI precipitantes. Demostramos además, que el efecto de los CI es tiempo y dosis dependiente e irreversible. Mediante el uso de anticuerpos bloqueantes específicos para los distintos FcγRs, determinamos que el efecto de los CI, es ejercido principalmente a través del FcγRI y en menor medida a través del FcγRII. Las CD-CI inmaduras mostraron altos niveles de CD83, CD86 y CD40, y el tratamiento con LPS no indujo un aumento en la expresión de las mismas. Esta alteración en la maduración de las CD se encontró asociada con una menor producción de IL-12 en respuesta al LPS, mientras que la producción de IL-10 no se vio alterada. Las CD-CI mostraron un perfil de producción de quimioquinas alterado, con un incremento en la producción de CXCL8, CCL2 y CCL3. Asimismo, las CD-CI mostraron una capacidad reducida para inducir una respuesta T alogénica y una menor capacidad endocítica. Demostramos que el efecto ejercido por los CI es independiente de IL-10 y prostaglandinas, mientras que la inhibición de la p38 MAP quinasa, abolió dicho efecto. Nuestros resultados demuestran que los CI afectan severamente la diferenciación, maduración y las funciones biológicas de las CD. Por esta razón, creemos que este estudio puede contribuir a un mejor entendimiento de los eventos involucrados en la patogénesis de las enfermedades autoinmunes y los desórdenes inflamatorios crónicos como el lupus eritematoso sistémico (LES), la granulomatosis de Wegener, la crioglobulinemia esencial y artritis reumatoidea (AR).