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Las plantas adaptan su arquitectura de raíz como parte de la respuesta a los cambios en las condiciones ambientales, tales como disponibilidad de agua, nutrientes y estreses de tipo biótico y abiótico. En particular, las plantas leguminosas desarrollan dos tipos de órganos laterales post-embrionarios en sus raíces, las raíces laterales (RLs) y los nódulos fijadores de nitrógeno. Las RLs participan en el anclaje de la planta al suelo y en la incorporación de agua y nutrientes. Los nódulos, los cuales se desarrollan a partir de la interacción simbiótica entre las leguminosas y las bacterias del suelo conocidas como rizobios, proveen compuestos nitrogenados asimilables a la planta. Ambos órganos poseen un fuerte impacto en el crecimiento de la planta, por lo tanto la comprensión de los mecanismos moleculares involucrados en el desarrollo de las RLs y los nódulos contribuiría a mejorar y aumentar el rendimiento de cultivos de importancia agronómica, así como también a recuperar tierras pobres en nitrógeno y reducir el impacto negativo de los fertilizantes químicos sobre la biodiversidad. Los microRNAs (miRNAs) son pequeños RNAs de 21-22 nucleótidos que actúan como reguladores post-transcripcionales de la expresión génica en organismos eucariotas durante el desarrollo de nuevos órganos o en respuesta a estímulos ambientales. En los últimos años, se han descripto miRNAs cuyos niveles se acumulan diferencialmente en diferentes etapas del desarrollo de las RLs o nódulos, sin embargo sólo un número reducido de ellos han sido caracterizados en detalle y asociados con una función en la infección rizobiana y/o la organogénesis y desarrollo del nódulo. En el presente trabajo de tesis doctoral se propuso como objetivo general caracterizar la vía de miR390/TAS3 durante el desarrollo de los órganos laterales en las raíces de la leguminosa modelo M. truncatula. El miR390 se asocia a la proteína ARGONAUTA7 y posee como target al transcripto no codificante TAS3, a partir del cual se generan los trans-acting interference small RNA (tasiRNAs). Estos tasiRNAs regulan mediante un mecanismo de clivaje los niveles de los transcriptos que codifican los Factores de Transcripción Regulados por Auxinas (ARF)2, ARF3 y ARF4, por lo que han sido denominados tasiARFs. Estudios previos en nuestro laboratorio, sugirieron que la vía miR390/TAS3 estaría involucrada en la infección rizobiana y/o en la organogénesis del nódulo. Con el fin de evaluar la acumulación y la expresión espacio-temporal de los transcriptos y los pequeños RNAs que componen esta vía en diferentes estadios de desarrollo de los órganos laterales de la raíz, se llevaron a cabo reacciones de RT-qPCR y fusiones transcripcionales de los promotores a los genes reporteros gfp y uidA (también conocido como gen gus dado que codifica la proteína β-glucuronidasa (GUS)). Estos resultados mostraron que la vía miR390/TAS3 se reprime en etapas tempranas de la interacción entre M. truncatula y S. meliloti, liberando la represión post-transcripcional de ARF2, ARF3 y ARF4. A su vez, hemos identificado y validado una nueva variante del transcripto TAS3 que probablemente actúa como un target mimicry endógeno de miR390 y contribuiría a disminuir los niveles de miR390 en esta etapa. En estadios más avanzados de la interacción, la vía es re-activada quedando restringida a la zona apical del nódulo. Para indagar sobre la función de la vía se generaron raíces transgénicas que sobreexpresaban el precursor de miR390b (OX390) o un target mimicry de miR390 (MIM390) capaz de secuestrar al miR390 y bloquear su acción. Además de la estrategia de expresión target mimicry, se utilizaron líneas mutantes en el gen AGO7, en las cuales la vía miR390/TAS3 se encuentra inactiva. La evaluación del fenotipo asociado a la arquitectura de raíz y a la nodulación en las plantas OX390, MIM390 y ago7 reveló que la vía miR390/TAS3 actúa como un regulador positivo sobre la elongación de las RLs, posiblemente como consecuencia del incremento de la señalización y/o respuesta a auxinas, y como un módulo represor de la infección rizobiana y el desarrollo de nódulos. A su vez, la inactivación de la vía miR390/TAS3, ya sea en las raíces MIM390 o ago7, resultó en el desarrollo de nódulos que presentan una distribución espacial y morfología alterada. El análisis de la acumulación de transcriptos, previamente descriptos como marcadores de la nodulación, en las raíces OX390, MIM390 y ago7 permitió establecer una correlación entre los niveles de ARF2, ARF3 y ARF4 y dos factores de transcripción de la familia GRAS designados NSP (Nodulation Signaling Pathway)1 y NSP2, sugiriendo que ambos factores de transcripción serían los candidatos por medio de los cuales la vía de miR390/TAS3 y la vía de señalización de la nodulación se intersectan. Con el objetivo de identificar genes cuyos niveles de acumulación se encuentran afectados directa o indirectamente por la sobreexpresión de miR390, se caracterizó el transcriptoma de las raíces OX390 en presencia y ausencia del rizobio mediante RNA-seq. El análisis in silico de los datos generados permitió identificar genes con expresión diferencial regulados negativamente o positivamente en respuesta a la sobreexpresión de miR390. Entre estos, se destacan genes marcadores de nodulación, factores de transcripción miembros de la familia LOB, genes involucrados en la respuesta y señalización de hormonas y genes relacionados con la traducción. Los resultados obtenidos en el presente trabajo de tesis doctoral han permitido avanzar en el conocimiento sobre la regulación post-transcripcional de genes durante dos procesos de desarrollo con relevancia ecológica y agronómica. Este conocimiento podría ser aplicado en etapas futuras a la optimización de incorporación de nutrientes y nitrógeno en las plantas, contribuyendo a mejorar y aumentar el rendimiento de los cultivos de leguminosas.

Dado el aumento continuo de la población mundial es necesario incrementar la producción de los cultivos que aseguren la alimentación de esta población. Para lograr este objetivo es fundamental conocer el funcionamiento integral de las plantas y sus mecanismos de respuesta a estímulos de distintos tipos. En estas respuestas intervienen factores de transcripción (FTs), proteínas que regulan la expresión de genes blanco y desencadenan cascadas de señalización que llevan o no a la adaptación de las plantas al medio en el que se encuentran. En este trabajo de tesis, se eligieron como objeto de estudio tres FTs, dos de girasol (HaWRKY76 y HaWRKY10) y uno de arroz (OsWRKY47). HaWRKY76 le confiere a las plantas de Arabidopsis características agronómicas deseables en condiciones de crecimiento normales y mayor tolerancia al estrés por exceso o defecto de agua. Por otro lado, HaWRKY10 está involucrado en la acumulación y el uso de sustancias de reserva y tiene un papel en la germinación de las semillas. Por su parte, OsWRKY47 tiene un papel en la respuesta de las plantas IPT al estrés hídrico y en su mecanismo de respuesta hay al menos dos genes regulados de forma directa por este FT de transcripción. Esta caracterización funcional permitió obtener información relevante para la mejor comprensión de los mecanismos de respuesta de estas especies vegetales frente al estrés por exceso y falta de agua y sobre algunos aspectos del desarrollo. El resultado de estos estudios permitió postular a estas tres proteínas como potenciales herramientas biotecnológicas para el fitomejoramiento.

Los factores de transcripción (FTs) HD-Zip I de Arabidopsis thaliana, AtHB12 y AtHB7, presentan una alta similitud de secuencia con NaHD20 de Nicotiana attenuata. La expresión de NaHD20 se induce por tratamientos relacionados al estrés y se expresa fuertemente en corolas. NaHD20 controla el aumento de los niveles de ABA de las hojas cuando las plantas se encuentran en condiciones de deshidratación y regula la producción y apertura de flores tanto en condiciones normales como de estrés hídrico severo. NaHD20 induce el desarrollo y la apertura de las flores, controlando los niveles de la hormona ABA. Durante la apertura de la corola, este FT induce la emisión del volátil acetona de bencilo, responsable de atraer polinizadores. AtHB12 se expresa en estadios tempranos, controlando el desarrollo foliar y radicular durante el estadio vegetativo. AtHB7 aumenta su expresión en el estadio reproductivo e induce el desarrollo foliar, la producción de clorofila y la fotosíntesis. AtHB12 y AtHB7 se regulan entre sí, afectado la expresión de su parálogo. En estrés hídrico, estos FTs se inducen fuertemente aunque actúan de manera diferente: AtHB12 regula el consumo mientras que AtHB7 controla la pérdida de agua a través del cierre estomático. AtHB12 tiene un efecto positivo en la producción de semillas estrés hídrico leve. Los tres FTs participan en mecanismos del desarrollo vegetal relacionados al estrés hídrico y a la hormona ABA. AtHB12 y AtHB7, considerados duplicaciones génicas, afectan la expresión de su parálogo, coordinando finamente la regulación de los procesos en los que están involucrados.

La reproducción sexual en plantas incluye procesos en donde el movimiento de agua y solutos se encuentra finamente regulado, lo cual sugiere la participación de acuaporinas. La existencia de acuaporinas, facilitando estos flujos, provee una base molecular sólida para la regulación del transporte de agua y solutos a través de las membranas y de esta forma establecen conexiones entre dicho transporte, el desarrollo de las plantas y sus respuestas adaptativas a las condiciones a las que se encuentran expuestas tanto a nivel organismo, como tejido e incluso a nivel intracelular. Este trabajo de tesis se centró principalmente en la identificación y caracterización de las acuaporinas potencialmente involucradas en la reproducción desde los órganos reproductivos masculinos en Arabidopsis thaliana. Primeramente identificamos las tres acuaporinas específicas de granos de polen de Arabidopsis, AtTIP5;1, AtTIP1;3 y AtNIP4;1. En base a experimentos funcionales, utilizando ovocitos de Xenopus laevis como sistema heterólogo, pudimos determinar que AtTIP5;1, AtTIP1;3 y AtNIP4;1 son transportadores de agua. AtTIP5;1 y AtTIP1;3 son también transportadores de urea y solamente AtTIP5;1 se encuentra regulado por pH externo. Estudios de localización subcelular evidenciaron que AtTIP5;1 se expresa en mitocondrias de polen. Por otro lado, AtTIP1;3 se encuentra en estructuras intracelulares no vacuolares del tipo vesículares, pero que no participan de mecanismos de endocitosis ni exocitosis. Finalmente, los experimentos fisiológicos in vitro sugirieron un papel de AtTIP5;1 en germinación del grano de polen actuando como regulador negativo. AtTIP5;1, AtTIP1;3 y AtNIP4;1 se vincularon de forma directa o indirecta con el proceso de elongación del tubo polínico, destacándose los efectos más drásticos para AtTIP1;3. En cuanto a los experimentos fisiológicos in planta, encontramos que solamente AtNIP4;1 tiene afectados los parámetros de fertilidad con una reducción significativa en el número de semillas. En el marco de esta tesis doctoral hemos realizado una revisión de la información disponible de acuaporinas de plantas, evaluando los perfiles de expresión de las mismas en los diversos tejidos. Hemos discutido la nomenclatura utilizada para clasificar esta familia proteica y analizado la posibilidad de establecer relaciones filogenéticas y funcionales entre los distintos subgrupos: PIPs, TIPs, NIPs y SIPs. El conjunto de resultados desarrollados en esta tesis, en concordancia con los trabajos publicados en estos últimos años, nos ha permitido aventurar posibles roles en relación con la actividad de transporte de agua y/o solutos de las acuaporinas de polen; que van desde la migración celular hasta el control del daño y prevención de apoptosis. También nos ha permitido generar un modelo sobre el mecanismo de acción de las acuaporinas en el polen relativo a la actividad como transportadores de urea. Este modelo vincula la actividad de AtTIP5;1 y AtTIP1;3 con el reciclado del nitrógeno descripto en polen.

Los elementos metálicos están involucrados en todas las fases de la existencia microbiana y juegan roles primordiales en el crecimiento celular y el funcionamiento metabólico pero pueden ser tóxicos cuando su concentración supera un umbral determinado. Por ello, las bacterias han desarrollado sistemas que permiten monitorear estas especies y modular la expresión de factores involucrados en la remoción de los mismos para mantener la homeostasis y prevenir el estrés. Salmonella entérica serov. typhimurium, una enterobacteria capaz de sobrevivir tanto en el medio ambiente como en el hospedador dispone de sistemas de detoxificación/resistencia específicos, controlados por reguladores transcripcionales que monitorean la concentración intracelular del metal, como CueR y GolS, que reconocen iones de metales monovalentes. Además, la bacteria dispone de sistemas no específicos que son importantes moduladores de las respuesta global al estrés celular producido por metales, como el sistema de dos componente CpxAR. En este trabajo, utilizamos al sistema gol de resistencia a Au controlado por GolS como plataforma en el desarrollo del primer biosensor bacteriano fluorescente específico para este metal, utilizando como bacteria residente del sistema de detección tanto Salmonella, como cepas no patógenas de Escherichia coli. En condiciones de laboratorio, estos biosensores demostraron ser eficaces para detectar Au específicamente en un rango de concentraciones adecuado para la detección del metal en muestras del ambiente. Este desarrollo tecnológico y variantes no selectivas del sensor GolS previamente desarrolladas en el laboratorio fueron utilizados para la generación de nuevos biosensores bacterianos para la detección de una amplia variedad de metales tóxicos, incluyendo Au, Cu, Ag, Hg, Cd y Pb, metales que son altamente nocivos para el ecosistema. Estos dispositivos, ensayados en condiciones de laboratorio, sirven de prueba de concepto para la utilización de los mismos en monitoreo ambiental de muestras acuosas. Por otro lado, y como parte de la caracterización del sistema de eflujo GesABC, perteneciente al regulón gol de resistencia a Au de S. typhimurium, demostramos la participación del sistema de dos componentes CpxAR de respuesta a estrés periplasmático como co-regulador y evidenciamos la relevancia de esta regulación adicional para la sobrevida en condiciones de estrés.

La formación de partículas lentivirales resulta de la multimerización de la poliproteína Gag, la cual contiene toda la información necesaria para autoensamblarse y brotar al medio extracelular a través de la membrana plasmática. Durante la maduración de los viriones, la proteína cápside (CA), que corresponde al dominio central de Gag, se condensa generando el core viral que preserva la integridad del complejo ribonucleoproteico requerido para iniciar un nuevo ciclo de replicación viral. Los virus de la inmunodeficiencia de simios (SIV) y de felinos (FIV) son dos lentivirus evolutivamente distantes cuyas proteínas CA no han sido aún estudiadas. Con el objeto de establecer la relación funcional entre los dominios CA de SIV y de FIV, construimos SIV quiméricos en los cuales la región codificante para la CA fue parcial o totalmente reemplazada por su equivalente de la CA de FIV. La caracterización fenotípica de las quimeras nos permitió agruparlas en tres categorías: un grupo formado por virus quiméricos capaces de ensamblarse en viriones, pero cuya maduración causa la inestabilidad de la CA de FIV; un segundo grupo representado únicamente por el SIV quimérico llevando el dominio N-terminal (NTD) de la CA de FIV y que exhibe un fenotipo de ensamblado defectivo; y un tercer grupo formado por los virus quiméricos que se ensamblan en viriones exhibiendo una CA de FIV madura estable, que incorporan la glicoproteína de envoltura, y que contienen niveles salvajes del ARN genómico viral y de la transcriptasa reversa. Sin embargo, este último grupo de SIV quiméricos resultó ser no infeccioso debido a defectos en alguna etapa posterior a la entrada viral. Por otra parte, demostramos que el dominio C-terminal (CTD) de la CA de FIV presenta la capacidad intrínseca de dimerizar in vitro y de formar oligómeros de alto peso molecular. Esto, junto con nuestros resultados que muestran que el CTD de la CA de FIV es suficiente para el ensamblado de la poliproteína quimérica Gag de SIV, provee evidencia de que el CTD de la CA exhibe mayor plasticidad funcional que el NTD. En su conjunto, nuestros resultados aportan información relevante sobre la homología funcional entre los dominios CA de las poliproteínas Gag de los lentivirus de primates y de no primates y contribuyen a nuestro conocimiento sobre cómo han evolucionado los requerimientos para el ensamblado de viriones infecciosos en los retrovirus.

En Argentina, el tomate (Solanum lycopersicum) es la quinta hortaliza a nivel de producción, siendo el cinturón hortícola de la ciudad de La Plata uno de los principales productores de tomate fresco para consumo de la Provincia de Buenos Aires. Un aspecto clave para optimizar el aprovechamiento de la producción es mejorar los aspectos ligados a la conservación poscosecha (periodo de almacenamiento del producto previo al consumo en fresco), lo cual requiere de un conocimiento detallado de los procesos metabólicos que ocurren durante la maduración y senescencia. La firmeza, uno de los principales determinantes de la calidad poscosecha y la vida útil de los frutos, está determinada por la resistencia mecánica impuesta por la pared celular. Las expansinas (proteínas sin actividad hidrolítica conocida) están implicadas en el desmantelamiento, no hidrolítico, de las paredes celulares vegetales, particularmente en procesos en los que es necesaria la relajación de la pared, como el desarrollo y la maduración de los frutos. Como muchas proteínas asociadas a carbohidratos, las expansinas tienen un dominio catalítico putativo y un módulo de unión a carbohidratos (CBM). Se cree que el CBM actuaría anclando a la expansina a la superficie de la celulosa, mientras que el dominio catalítico putativo interactuaría con las hemicelulosas en la superficie de las microfibrillas provocando la ruptura de los enlaces no covalentes, principalmente puentes de hidrógeno, existentes entre la celulosa y las hemicelulosas de la matriz. Tomate incluye 38 genes de expansinas pertenecientes a diferentes grupos filogenéticos. Estudios previos han demostrado que existe una expansina específica de fruto, la α-expansina 1 de tomate (SlEXPA1). La determinación de la actividad expansina depende de la medición de la capacidad de extensión de paredes celulares aisladas mediante el uso de extensómetros "ad hoc" poco convencionales, hecho que ha restringido fuertemente su estudio. Esto nos impulsó a adaptar una metodología para medir la extensión de la pared celular y la actividad expansina usando un medidor de textura comercial, equipo común encontrado en laboratorios de ciencia de los alimentos o tecnología poscosecha. Fue posible medir el crecimiento ácido de hipocótilos de pepino y de tomate, así como determinar la actividad expansina sobre extractos de proteínas de hipocótilos de pepino, de frutos frutilla y de frutos de tomate en diferentes estadios de madurez, de manera fiable y reproducible. Por otro lado, haciendo uso de un sistema de expresión heterólogo (Escherichia coli), se sobreexpresaron tanto la proteína completa (SlEXPA1) como sus dominios característicos (CBM-SlEXPA1 y EXP-SlEXPA1), con la finalidad de analizar de manera integral el mecanismo de unión sobre diversos sustratos sintéticos de la pared celular vegetal. Se demostró, a través de ensayos de unión “in vitro”, que tanto la proteína completa como ambos dominios se unen a celulosa microcristalina y xilano de avena. Para el caso de la celulosa la unión es mayor para la proteína completa y el dominio CBM, mientras que para el caso del xilano la unión es mayor para la proteína completa y el dominio catalítico putativo. Asimismo, se demostró que dichas proteínas no poseen afinidad por un sustrato no presente en la pared celular como lo es el almidón. Por último, se sobreexpresó de manera constitutiva el CBM de la expansina 1 de Solanum lycopersicum (CBM-SlEXPA1) en la pared celular de plantas de tomate, siendo ésta la primera vez que un CBM se sobreexpresa en un fruto destinado a controlar la degradación de la pared celular y el ablandamiento del fruto. La sobreexpresión de CBM-SlEXPA1 genera un aumento de la resistencia mecánica de las hojas, un retardo en el proceso de ablandamiento del fruto, una reducción en la susceptibilidad al ataque por Botrytis cinerea y un aumento en su contenido de pared celular; mientras que no modifica el crecimiento de las plantas y el fenotipo general, y no altera los parámetros de calidad característicos del fruto. La presente tesis aborda desde diferentes aproximaciones el estudio de una proteína en particular. Se concluye que, la fácil adaptación metodológica para la determinación de la actividad expansina podría contribuir a facilitar y aumentar el análisis de las propiedades de las expansinas en diferentes sistemas; las α-expansinas, apoyando resultados previos, se unirían a través del dominio CBM a celulosa mientras que el dominio catalítico putativo intervendría en la relajación de la matriz de hemicelulosa con la consecuente relajación de la pared vegetal; la sobreexpresión de un CBM en la pared celular sería una estrategia factible de utilizar para lograr aumentar la vida poscosecha de frutos carnosos, como lo es el tomate, sin alterar el crecimiento de la planta.

Los túbulos colectores corticales (CCD) del riñón de mamífero juegan un papel central en la regulación del transporte de agua-solutos y en el equilibrio ácido-base del organismo. Si bien muchos estudios han sido realizados para tratar de entender los mecanismos implicados en estos procesos, los mismos no han sido completamente aclarados. En la presente tesis hemos utilizado a la línea celular RCCD1 (modelo de CCD) para intentar clarificar los mecanismos por los cuales se produce el movimiento de agua y la regulación del pHi en este segmento del nefrón. En lo referente al movimiento de agua observamos que la línea celular desarrolla importantes flujos en ausencia de fuerzas impulsoras osmóticas e hidrostáticas. Demostramos, además, que los mismos ocurrirían por un mecanismo de cotransporte agua-soluto ya que la línea no expresa acuaporinas. Basalmente predominaría un flujo secretor asociado al movimiento de Cl-, HCO3- y K+. La hormona AVP estimularía, a “corto plazo”, una absorción de fluido acoplada a la de Na+ y, a “largo plazo”, un flujo secretor acoplado al Cl- probablemente mediado por el canal CFTR. En cuanto a la regulación del pHi demostramos funcional y molecularmente que la linea expresa, basolateralmente, las isoformas NHE-1 y NHE-2 del intercambiadores Na+/H+. La NHE-1 sería la encargada de la regulación del pHi ante una carga ácida y la NHE-2 mantendría el pHi basal. En lo que respecta a los intercambiadores Cl-/HCO3- demostramos que la línea celular RCCD1 expresa las isoforrnas AE2, AE3 y AE4. Las dos primeras se localizarían en la membrana basolateral y la AE4 estaría en la membrana apical. Funcionalmente AE3 y AE4 se encargarían de mantener el pHi basal mientras que la AE2 se activaría ante cargas alcalinas. Además proponemos que las células RCCD1 tendrían plasticidad en la expresión de sus intercambiadores Cl-/HCO3-. Finalmente mostramos que la AVP es capaz de modular tanto a los intercambiadores Na+/H+ como a los Cl-/HCO3-. Interesantemente hallamos que esta hormona, tradicionalmente asociada a las células principales, podría también regular a los transportadores Cl-/HCO3- presentes en las células intercalares.

El empleo de leguminosas nativas asociadas a gramíneas constituye un recurso eficiente para mantener el suelo con buenos niveles de fertilidad nitrogenada minimizando el uso de fertilizantes químicos, generalmente costosos y de alto impacto ambiental. En este contexto, las especies de leguminosas forrajeras nativas presentan un gran potencial práctico y un ejemplo de ello es Desmanthus virgatus (L.) Willd. de amplia distribución en el centro norte de Argentina. Hacia el uso sustentable de esta leguminosa, en este trabajo de tesis se presenta la caracterización fenotípica, genotípica y simbiótica de rizobios noduladores del complejo D. virgatus recuperados de suelos argentinos. Para ello, se seleccionaron y colectaron 10 poblaciones de plantas de D. virgatus (sensu lato) en diferentes ambientes y se estableció una colección de más de 170 aislamientos de rizobios noduladores. La caracterización fenotípica de los simbiontes permitió reconocer rizobios de crecimiento rápido con capacidad de crecer en condiciones que se consideran adversas y que sugieren una mayor flexibilidad fisiológica y capacidad de adaptación al ambiente. Los perfiles de amplificación de ADN genómico (fingerprints) evidenciaron una marcada diversidad genética entre los aislamientos. Con respecto a las características simbióticas, se hallaron rizobios con muy buena capacidad potencial de fijación biológica de nitrógeno y competencia por el nicho simbiótico. Los resultados presentados enfatizan la importancia de la inoculación con cepas eficientes y adaptadas a nuestras condiciones edafoclimáticas para lograr un establecimiento exitoso y crecimiento inicial adecuado de las plántulas de D. virgatus en condiciones de campo.

Fil:Prélat, Daniel. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.