Catálogo de publicaciones

El objetivo de esta tesis es diseñar sistemas multifuncionales que combinen funciones de diagnóstico y terapia, o teranósticos, a base de nanopartículas magnéticas (NPMs) de óxido de hierro (magnetita/maghemita) para su potencial aplicación en patologías oncológicas.Para ello se realizó un trabajo experimental que involucró la optimización de las metodologías de síntesis de las NPMs y la posterior incorporación secuencial de los distintos componentes, en conjunto con las caracterizaciones y ensayos tendientes a evaluar su funcionalidad en cada etapa. En primer término, se estudiaron las vías de síntesis de NPMs de manera de conseguir un control sobre las propiedades fisicoquímicas, y de la estabilidad de NPMs en suspensión acuosa.Se modificó la superficie de las NPMs con ácido fólico (AF) de manera de proporcionar a las NPMs selectividad para acumularse en células tumorales debido a que el receptor de folatos se encuentra sobreexpresado en células de varios tipos de cáncer. En una etapa posterior, se cargaron las NPMs modificadas con AF con fármacos oncológicos para impartir la función terapéutica. La Doxorubicina (Doxo) es uno de los agentes quimioterapéuticos más efectivos usados en el tratamiento de varios tipos de cáncer. A pesar de su gran uso, varios efectos secundarios se encuentran asociados a la distribución sistémica de este fármaco una vez administrado. Estos efectos secundarios están relacionados con la necesidad de administrar dosis elevadas del fármaco debido a la escasa selectividad y eficacia asociada con su distribución no específica en el cuerpo.Las siguientes instancias del desarrollo de este trabajo de tesis se dedicaron a evaluar las potencialidades de los agentes teranósticos para :(i) direccionamiento mediado por un campo magnético; (ii) actuar como medio de contraste en diagnóstico por imagen mediante resonancia magnética (RMI), (iii) ejercer su acción terapéutica.En el Capítulo I se introducen los conceptos básicos sobre nanotecnología, nanociencia y nanomateriales. Se describen en mayor detalle las razones por las cuales se seleccionaron las NPMs para el desarrollo de este trabajo de tesis.Dentro del conjunto de NPMs se puntualiza en las de óxido de hierro, en particular, magnetita (MAG, Fe3O4). Los métodos de síntesis de este óxido de hierro son brevemente reseñados, profundizando en la técnica de co-precipitación. Además se describen las diferentes estrategias de estabilización y funcionalización del núcleo magnético.Se resumen las aplicaciones de las NPMs en biomedicina. En este sentido, se describen las ventajas de las mismas como herramientas de diagnóstico, al actuar como agentes de contraste en RMI. También se muestran las formas de vectorización de fármacos mediante el empleo de NPMs y se enuncian las habilidades de las nanoformulaciones descriptas para actuar como agentes teranósticos.Finalmente se enumeran el objetivo general y los objetivos específicos, así como la hipótesis planteada en esta tesis.En el Capítulo II se describen los reactivos empleados y las técnicas de caracterización aplicadas a las diferentes nanoformulaciones junto con el tratamiento necesario de las muestras en cada caso.En el Capítulo III se dedicó al estudio de las metodologías de síntesis, estabilización y control de la estabilidad de las NPMs de MAG. Se describen los resultados obtenidos al emplear dos métodos de síntesis: co-precipitación y su variante reducción-precipitación con el fin de seleccionar una metodología adecuada para la obtención de NPMs de MAG en función de las aplicaciones propuestas. En base a los resultados, se seleccionó la técnica de co-precipitación como la más adecuada, y se incluyó un estudio exhaustivo de las variables experimentales asociadas a dicha técnica con el propósito de conseguir un control de las propiedades fisicoquímicas. Este análisis involucró el estudio de los mecanismos que conducen a la formación de las NPMs de MAG así como una completa caracterización y los ensayos necesarios para evaluar la estabilidad, en términos de la evolución del diámetro hidrodinámico (DH) en función del tiempo de almacenamiento en suspensión acuosa. En el Anexo I se informan los resultados que complementan a este capítulo.En el Capítulo IV se estudió la incorporación de un ligando selectivo, la vitamina B9 ó AF, a la superficie de MAG, previamente funcionalizadas con 3-aminopropiltrietoxisilano (APTS). Para ello se evaluaron dos metodologías: la adsorción simple del AF y el anclaje covalente mediado por carbodiimida. Se combinaron los datos experimentales obtenidos con estudios teóricos. Esto permitió adquirir conocimientos acerca del mecanismo de interacción AF- MAG@APTS y corroborar la disponibilidad del grupo selectivo del AF posterior a su incorporación a la superficie de MAG@APTS. En una segunda instancia, se estudió la estabilidad de las nanoformulaciones obtenidas de acuerdo a dos criterios: (i) evolución del DH en función del tiempo de almacenamiento en dispersión acuosa y (ii) estudio de la capacidad de retención del AF incorporado. Finalmente, se incluye un estudio tendiente a predecir el comportamiento de las nanoformulaciones en un medio que simula el plasma sanguíneo en términos de osmolaridad, pH y contenido de proteína.En el Capítulo V se presentan y discuten los ensayos realizados para proveer a las nanoformulaciones de la acción terapéutica necesaria para constituir un agente teranóstico. La carga de la droga se realizó mediante adsorción superficial, explorando la influencia de diferentes parámetros asociados a dicho procedimiento. Se evaluó la liberación de Doxo in vitro mediante la implementación de una metodología que intenta simular la ruta que debería atravesar la nanoformulación una vez inyectada, vía intravenosa, en el torrente sanguíneo hasta su acumulación en el tumor.En el Capítulo VI se investigó la habilidad de las NPMs, presentadas en los Capítulos IV y V, para ser guiadas magnéticamente al exponerlas a un campo magnético externo mediante ensayos in vitro. Se propuso el empleo de un sistema de flujo continuo acoplado a un espectrofotómetro Uv-Visible, con el objetivo de monitorear la disminución del contenido de NPMs de la dispersión estudiada como consecuencia de la retención de las mismas por acción de un imán de neodimio colocado en el sitio blanco. En este capítulo, se analizó además, la capacidad de las nanoformulaciones como agentes de contraste. Se determinó la eficiencia de contraste de cada formulación, comparando los valores obtenidos con los correspondientes a agentes de contrastes comerciales.En el Capítulo VII se incluyen ensayos in vitro, empleando una línea celular de cáncer colorrectal (CCR), con el fin de evaluar la capacidad del nanoteranóstico preparado de inhibir el crecimiento celular, a través de la internalización y la posterior liberación de droga en forma intracelular. En este mismo capítulo, se presentan, como complemento, los resultados correspondientes al estudio de la biocompatibilidad de las mismas nanoformulaciones utilizando un modelo animal de zebrafish. En el Anexo II se informan los resultados que complementan a este capítulo.Finalmente, en el Capítulo VIII, se puntualizan las conclusiones generales abordadas a partir de los resultados obtenidos y analizados en cada uno de los capítulos. Se definen además, los lineamientos de la proyección de futuros trabajos.

Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2016

Los macrófagos son células involucradas en la inmunidad innata y el mantenimiento de la homeostasis tisular. Tanto durante la activación de macrófagos por la exposición a patógenos como en la transición macrófago-célula espumosa en el contexto de la formación de la placa aterogénica se produce un aumento en la cantidad de gotas de lípido intracelulares. Los mecanismos por los cuales se acumulan estos lípidos y la relevancia que éstos poseen para la funcionalidad del macrófago no se conocen por completo. Por lo tanto, el objetivo general de este trabajo fue determinar la contribución de la síntesis de novo de glicerolípidos a la acumulación de gotas de lípido durante procesos de transición de macrófagos y en particular, evaluar el rol que cumple la enzima limitante de este proceso, la glicerol-3-fosfato aciltransferasa (GPAT). Se demostró que la inducción de la síntesis de novo de glicerolípidos (triacilgliceroles y fosfolípidos) contribuye al aumento en la masa de lípidos en la línea celular de macrófagos murinos RAW 264.7 y en macrófagos primarios derivados de médula ósea tratados con KLA (componente activo del LPS bacteriano) o con LDL oxidadas. Particularmente se comprobó que hay un incremento en la actividad GPAT correspondiente a las isoformas que se expresan en retículo endoplásmico GPAT3 y GPAT4. Mediante la utilización de modelos de silenciamiento de estas dos isoformas se demostró que ambas contribuyen a la activación de la síntesis de glicerolípidos observada. En cuanto a la relevancia funcional de estos lípidos, se comprobó que se requiere de la movilización de glicerolípidos mediante la actividad de lipasas para que se produzca el proceso de fagocitosis en forma eficiente. Estos lípidos liberados contribuyen no sólo energéticamente proveyendo de ácidos grasos para la β-oxidación, sino que también son requeridos presumiblemente para la producción de señales que inicien el proceso. La ausencia de GPAT3 o GPAT4 disminuye la eficiencia de la fagocitosis y en particular la carencia de GPAT4 exacerba la liberación de citoquinas pro-inflamatorias, sugiriendo para esta isoforma un rol en la atenuación de las señales infamatorias lo que la posiciona como un potencial blanco terapéutico.

La síntesis de nucleósidos carbocíclicos es un tema de gran interés que ha sido muy desarrollado durante los últimos años debido a la importancia de estos compuestos como agentes antivirales y antitumorales. La idea original en la que se basó el diseño de esta familia de compuestos es el aumento de la estabilidad de la unión glicosídica C-N produciendo los menores cambios estructurales posibles. Es sabido que la conformación juega un papel muy importante en la modulación de la actividad biológica de una droga. Debido a la ausencia del átomo de oxígeno del anillo furanósico, la conformación de los carbanucleósidos suele diferir de la que presentan los nucleósidos convencionales en solución y, por este motivo, en general son menos efectivos. lnspirados en la estructura cristalina del nucleósido carbocíclico natural neplanocina C (147), se sintetizaron carbanucleósidos conformacionalmente restringidos con un sistema bicíclico[3.1.0]hexano como unidad de pseudoazúcar los cuales eran capaces de imitar a la conformación de los nucleósidos convencionales. En esta tesis se sintetizaron por primera vez nucleósidos carbocíclicos conformacionalmente restringidos construidos con un sistema 6-oxabicíclico[3.1.0]hexano como unidad de pseudoazúcar. Se presenta la sintesis de 5'-nor-2',3'-didesoxiderivados de neplanocina C diseñados como inhibidores de la enzima S-adenosil-L-homocisteína hidrolasa. Se presenta también la primera síntesis enantioselectiva de neplanocina C (147) y del isómero no natural de neplanocina F (207), otro componente de la familia de nucleósidos carbocíclicos naturales conocida con el nombre de neplanocinas. Por otro lado, (N)-metano-carba-timidina (7) es un nucleósido carbocíclico muy potente como agente antiherpético, más efectivo en ensayos in vitro que las drogas utilizadas en la actualidad para el tratamiento de estas infecciones. Se realizó la sintesis enantioselectiva de 2'-desoxiderivados de neplanocina C con el objeto de evaluar su efectividad como agentes antivirales y como bloques de construcción de oligonucleótidos modificados. Por último. se presenta la primer síntesis enantioselectiva de (1R,2R,5S)-1{5-(Hidroximetil)biciclo[3.1.0]hex-3-en-2-il}-5-metil-1,3-dihidropirimidina-2,4-diona (310) y de (1R,2R,5S)-1-{ 5-(Hidroximetil)biciclo[3.1.0]hex-2-il}-5-metil-5,3-dihidropirimidina-2,4-diona ((—)-156) diseñados como análogos de d4T (311) y 2'-desoxitimidina (145) y como herramientas para el estudio de la preferencia conformacional de las enzimas involucradas en la activación in vivo de 7. En todos los casos se utilizó una estrategia convergente a través de una reacción de tipo Mitsunobu como método de acoplamiento del anillo carbocíclico y la base purinica o pirimidínica.

En esta tesis se presenta la síntesis de nuevos derivados de hidratos de carbono, utilizando la reacción de reordenamiento de Ferrier sobre 2-haloglicales, al igual que hidrogenación catalítica heterogénea (con Pd/C, Ni/C y PdFe/C) sobre O-arilglicósidos, permitiendo la obtención de nuevas sustancias no registradas en bibliografía hasta el momento. También se realiza la síntesis de un producto natural (gastrodina) utilizando el sistema catalítico PdFe/C, no utilizando, hasta el momento, en la química de carbohidratos.

El principio de “desarrollo sustentable” ha promovido grandes cambios en el avance de la química. El esfuerzo por encontrar alternativas a los solventes orgánicos convencionales y el desarrollo de metodologías para optimizar el uso de los recursos son sólo algunas de ellos. La síntesis de nuevos materiales iónicos y su aplicación en procesos extractivos, empleando fuentes de energía alternativas, es un claro ejemplo de esta búsqueda. Por lo mencionado, los resultados presentados en esta memoria constituyen un aporte muy significativo tanto a la química orgánica como a la analítica. La presente Tesis está organizada en cuatro capítulos y versa sobre la síntesis, caracterización y estudio teórico de nuevos materiales iónicos provenientes de la S-alquilación de tiofenos y su empleo en métodos de extracción sólido-líquido de analitos de interés ambiental, utilizando en cada caso energía de ultrasonidos o microondas para llevar a cabo el objetivo. En el capítulo 1 se describe la síntesis promovida por ultrasonido del bromuro de Sbutiltiofenio en medio acuoso. Si bien el compuesto no pudo ser aislado debido a su inestabilidad fuera de disolución acuosa, el mismo fue obtenido con muy buenos rendimientos y se lo ha caracterizado por RMN. Además, se llevó a cabo una polimerización química de tiofeno empleando energía de ultrasonidos, no pudiendo lograrse satisfactoriamente la cuaternización del politiofeno obtenido. El capítulo 2 detalla la síntesis, asistida por microondas, de 17 líquidos iónicos que implican la S-alquilación de diferentes tiofenos con sales de plata como fuente de aniones. Todos los productos aislados se han caracterizado completamente por RMN y DSC, y todos los productos se han cuantificado mediante espectroscopia UV-vis. Las condiciones de reacción optimizadas mediante diseño de experimentos permitieron alcanzar rendimientos del 96%. Por otro lado, mediante el uso de herramientas computacionales (DFT, NBO, QTAIM), se llevó a cabo un estudio teórico sobre la S-alquilación de tiofenos con yodoalcanos, en presencia de sales de plata. En el capítulo 3, se analiza la función del anión en el mecanismo de reacción, así como el efecto de los sustituyentes en el anillo de tiofeno y de la longitud de la cadena alquílica. Además, se examina la estabilidad de las sales frente a la solvólisis en distintos medios. Este trabajo fue realizado en el marco de una estancia predoctoral en colaboración con el Dr. Juan García de la Concepción, bajo la supervisión del Prof. Pedro Cintas Moreno (UEx, España). Finalmente, el capítulo 4 se divide en dos secciones. En la primera, se describe el empleo del bromuro de S-butilitofenio en la extracción, asistida por ultrasonidos, de hidrocarburos aromáticos policíclicos en sedimentos; mientras que, en la segunda, se describe la síntesis de líquidos iónicos estables de cadena larga, provenientes de la S-alquilación de benzotiofeno y su empleo en la extracción de cadmio en sedimentos, asistida por ultrasonidos. En el transcurso de esta Tesis se ha publicado un capítulo de libro y dos artículos en revistas internacionales, contando con otros dos en etapa de redacción. Además, los resultados obtenidos han sido presentados en tres reuniones científicas.

Este trabajo de Tesis consta de dos partes. En la primera parte, se estudiaron reacciones de adición conjugada a aldehídos y cetonas α,β-insaturados, utilizando como sustratos órgano-cupratos preparados a partir de heterociclos aromáticos. Se examinaron posibles precursores y condiciones para mejorar la formación de los cupratos y se investigaron técnicas de metalación de heterociclos. El estudio frente a compuestos carbonílicos mostró que con los derivados de furano y tiofeno la reactividad tiene una dependencia importante del tipo de sustrato utilizado, mientras que en el caso de los derivados de piridina y n-metilpirrol la reacción es más compleja. Se examinaron diversas formas de optimización de la reactividad, encontrándose que el agregado de aditivos como TMSCl resulta en una mejora importante. También se condujeron estudios sobre la estructura de estos cupratos en fase gaseosa y en solución, utilizando métodos de modelado molecular. En la segunda parte del trabajo de Tesis se estudió la reacción de carbolitiación intramolecular para formar derivados 2,3-dihidrobenzofuranos con un par de centros estereogénicos vecinos, a partir de un sustrato especialmente diseñado en nuestro laboratorio. Se analizaron diversos aspectos de la reacción, tales como efectos de la temperatura y tiempos de reacción, así como efectos de solventes (con distintas propiedades coordinantes y polares) sobre la distribución de productos y se logró aislar intermediarios que permiten respaldar los mecanismos que se proponen. Un aspecto intrigante de esta reacción es una inesperada diastereoselectividad, por lo que se llevaron a cabo estudios de modelado molecular de distintas estructuras y de posibles estados de transición, para tratar de esclarecer las razones de la estereoquímica observada. Los cálculos, integrados a los resultados experimentales, permiten delinear las posibles rutas de formación de los diasterómeros.

La glicobiología de Ia galactofuranosa (Galf) es un tema de creciente interés. Dicho monosacárido es constituyente de glicoconjugados de bacterias, protozoarios y hongos, pero el mamífero huésped aparentemente no biosintetiza glicoconjugados con Galf . Recientemente se han identificado oligosacáridos de diferente tamaño, los cuales se liberan de glicoproteínas de T. cruzi por reacciones de β-eliminación. Todos estos oligosacáridos se encuentran ligados O-glicosídicamente a la proteína a través del disacárido β-D-GaIf-(1—>4)-GlcNAc(9). Dicho disacárido aparece luego ramificado con un número variable de unidades de Galp, que convierten a la cadena de azúcares en aceptora de ácido siálico a través de una reacción de trans-sialidación. En particular, el trisacárido β-D-GaIf-(1—>4)—[β-D-GaIp-(1->6)]-GlcNAc (23) representa el oligosacárido más simple de esta serie que puede ser aceptor de ácido siálico. Tanto 9 como 23 no habían sido sintetizados previamente y sólo se habían obtenido como los alditoles correspondientes por β-eliminación reductiva de las glicoproteínas. Por otra parte, aunque la galactofuranosa se encuentra generalmente como extremo terminal, se ha identificado una serie de glicoconjugados en donde la Galf se encuentra interna. Por ejemplo, el “core” del lipofosfoglicano (LPG) de especies de Leishmania así como los GIPLs del tipo 2 de L. majory L. mexicana presentan la unidad a-D-Galp-(1—>3)-D-Galf. Esta misma unidad es contituyente de bacterias patógenas. mientras que la unidad β-D-Galp-(1—>3)-D-Galf se encontró en polisacáridos capsulares de Streptoccocus neumoniae. Sintones para la introducción de estos dos disacáridos no habían sido sintetizados. En este trabajo se presentan: 1. Una revisión de la distribución de galactofuranosa en tripanosomatídeos 2. Un resumen del método de glicosidación por tricloroacetamidatos. 3. Una descripción detallada de las reacciones que se realizaron en este trabajo de investigación y la discusión de los resultados obtenidos. 4. Una descripción del trabajo experimental desarrollado. Para la sintesis de β-D-Galf-(1—>4)-GlcNAc (9), el compuesto de partida de la secuencia desarrollada fue el bencil 2-acetamido-2-desoxi-a-D-glucopiranósido (2), el cual se benzoiló regioselectivamente en HO-3 y HO-6 con N-benzoilimidazol para dar 3 (70 % rendimiento). El derivado perbenzoilado 4 se obtuvo como subproducto minoritario (9 % rendimiento). La condensación promovida por SnCl4 de la penta-Obenzoil- D-galactofuranosa (5) con 3 condujo al disacárido 6 (85% rendimiento) con formación altamente diasteroselectiva del enlace anomérico (configuración β). A efectos de obtener el disacárido libre, se procedió a eliminar los grupos protectores. Inicialmente, se intentó eliminar el grupo bencilo por hidrogenación catalítica bajo distintas condiciones y el mejor resultado se obtuvo cuando se utilizó Pd(OH)2 como catalizador a 1 atmósfera de H2 por 10 días. Se lograba así una hidrogenólisis parcial conduciendo a 7 con 77 % de rendimiento y se recuperaba un 11 % de 6 sin reaccionar. Cuando se trató de desbenzoilar 7 con NaOMe en MeOH se descomponía el material de partida por lo cual se optó por el camino inverso para la desprotección total de 6. Por desbenzoilación de 6 con metóxido de sodio en metanol se obtuvo el bencil glicósido del disacárido deseado (8) con 97 % de rendimiento. Así como ocurrió con 6, la desbencilación de 8 por hidrogenación catalítica con Pd/C o Pd(OH)2/C como catalizadores, resultaba extremadamente lenta y no se conseguía completar la reacción. Sin embargo 8 experimentó hidrogenólisis cuantitativa por transferencia catalítica heterogénea (Pd/C) de hidrógeno, utilizando formiato de amonio en metanol caliente obteniéndose el disacárido libre β-D-Galf(1—>4)GlcNAc(9), cristalino con excelente rendimiento (55 % de rendimiento total a partir de 2). La reducción de 9 con NaBH4 condujo al alditol cristalino (10) que mostró señales diagnósticas (C-anomérico 109,0 ppm, C-1 y C-4 de GlcNAc 61,8 y 78,8 respectivamente) casi idénticas a las informadas para el "disacárido alditol" aislado de glicoproteínas de T. cruzi. De esta manera se confirmó por síntesis la estructura de este disacárido natural, interesante desde el punto de vista biológico. Paralasíntesis de β-D-GaIf-(1—>4)-[β-D-Galp-(1—>6)]-GlcNAc (23) el compuesto de partida de la secuencia desarrollada fue el bencil 2-acetamido-3-Obenzoil- 2-desoxi-a-D-glucopiranósido (14), que se preparó fácilmente a partir de un procedimiento que aumentó el rendimiento total (68 %) con respecto al anteriormente descripto (36 %). Para ello, se trató 2 con α,α-dimetoxitolueno según el procedimiento de Evans obteniéndose 12 con 88 % de rendimiento, que luego se benzoiló con cloruro de benzoílo en piridina para dar 13 con 95 % de rendimiento. La remoción del bencilidén según la técnica descripta condujo a 14 con 81 % de rendimiento. Por benzoilación de D-galactosa con cloruro de benzoilo en piridina a alta temperatura se obtuvo la mezcla de anómeros de la perbenzoil-α,β-[3-Dgalactofuranosa (5) informada, y además se aisló la perbenzoil-β-D-galactopiranosa (15) que no había sido descripta. La condensación promovida por SnCl4 del compuesto 14 con 1,2 equivalentes de penta-O-benzoil-β-D-galactopiranosa (15) condujo al disacárido 16 (80 % rendimiento) con formación altamente diasteroselectiva del enlace anomérico (configuración β). La estructura de 16 se confirmó inequívocamente por desprotección total. Por desbenzoilación de 16 con NaOMe en MeOH se obtuvo el bencil glicósido 17 cristalino (98 %). La hidrogenólisis catalítica heterogénea de 17 con formiato de amonio y 10 % Pd/C condujo al disacárido libre 18 que presentó el mismo [α]D que el descripto en literatura y en este caso cristalino. La alta regioselectividad en favor del HO-6 era esperable, debido a que este hidroxilo primario se encuentra menos impedido que el HO-4 secundario. Además, se encontró que el HO-4 no podía ser glicosidado cuando se trataba tanto 14 como 16 con un exceso de 15 en presencia de SnCl4. Sin embargo, la glicosidación del HO-4 del disacárido 16 con un exceso de penta-O-benzoil-α,β-D-galactofuranosa (5) condujo al trisacárido protegido 19 con 41 % de rendimiento. En esta reacción también se aisló otro compuesto correspondiente al producto de transglicosidación, es decir, el derivado perbenzoilado de β-D-GaIf-(1->4)-[β-D-Galf-(1—>6)]-GlcNAc (20). La estructura de 20 se confirmó por una síntesis directa e independiente. Por glicosidación de 14 con un exceso de 5 utilizando SnCl4 como promotor se obtuvo 20 con 63 % de rendimiento y presentó las mismas características físicas y espectroscópicas que el producto obtenido previamente. También se aisló el disacárido 21 con 27 % de rendimiento. El compuesto 21 se obtuvo con mayor rendimiento (66 %) por tratamiento de 14 con 1,1 equivalentes de 5 en presencia de SnCl4. Dado que tanto la conversión de 14 al disacárido 16 y de 16 al trisacárido 19 eran promovidas por SnCl4 en las mismas condiciones de reacción, se simplificó la síntesis de 19 mediante un procedimiento en un solo paso (“one-pot"). Así, a partir de 14 por adición secuencial de 15 y 5 se obtuvo 19 con formación altamente diasteroselectiva de los dos centros anoméricos de configuración β con 34 % de rendimiento. Este procedimiento, a pesar de que no significó un aumento en el rendimiento total de 19, resulta directo y sencillo, ya que conduce a 19 utilizando galactosas perbenzoiladas como precursores, evitando la purificación de los productos intermedios. Otra ventaja es que las galactosas perbenzoiladas, 5 y 15, se obtienen de manera sencilla en la misma reacción por cristalización fraccionada. A efectos de obtener el trisacárido libre β-D-Galf(1—>4)[β-DGalp(1—>6)]GlcNAc(23), objetivo de la síntesis, se procedió a eliminar los grupos protectores teniendo en cuenta que, para la desprotección del disacárido 6, se había encontrado que convenía primero desbenzoilar y luego desbencilar. La desbenzoilación de 19 con NaOMe en MeOH condujo al bencil glicósido del trisacárido deseado 22 con 99 % de rendimiento. Por hidrogenólisis del grupo bencilo de 22 utilizando formiato de amonio-10% Pd/C en metanol caliente se obtuvo el trisacárido libre 23 (99%). El trisacárido 23 representa una nueva estructura de oligosacáridos unidos a proteína por residuos de treonina o serina encontrados únicamente en glicoproteinas de T. cruzi. La reducción de 23 con NaBH4 condujo al alditol 24 (97 %) cuyos RMN 13C y ¹H mostraron ser idénticos a los informados para el alditol disubstituido liberado por β-eliminación reductiva de las mucinas de la cepa G de T. cruzi. Dado que el tipo de unión a proteína por GlcNAc ylapresencia de Galf resultaban novedosos y teniendo en cuenta que se obtuvieron por síntesis los productos secundarios 20 y 21, resultaba interesante su conversión a los alditoles correspondientes. Estos resultaban útiles en estudios sobre la influencia de la Galf en la cromatografía liquida de intercambio aniónico (Dionex) que forma parte de otro proyecto del laboratorio sobre determinación de estructuras de mucinas de T. cruzi. Se procedió pues a la desbenzoilación de 20 con NaOMe en MeOH obteniéndose 25 como producto cristalino con 98 % rendimiento. La desbencilación de 25 con formiato de amonio-10% Pd/C en metanol caliente condujo a 26 como una mezcla de anómeros α,β. La reducción de 26 con borohidruro de sodio dio 27 con 98 % de rendimiento. Siguiendo la misma secuencia de desprotección descripta, se obtuvieron los compuestos 28, 29 y 30. Para realizar la primera síntesis de sintones de los disacáridos β-D-Galp( 1-)3)-D-Galf y α-D-GaIp-(1—>3)-D-Galf para la introducción de Galf interna en la construcción de oligosacáridos de glicoconjugados, la estrategia fue utilizar como precursor de galactofuranosa un derivado de D-galactono-1,4-lactona con el OH-3 libre, que luego sería glicosidado con un derivado conveniente de Galp. Teniendo en cuenta que los grupos acilos son muy estables a las condiciones de glicosidación generales, y que sería conveniente obtener este derivado en un solo paso de reacción, se procedió a estudiar la acilación parcial de la D-galactono-1,4-lactona con cloruro de pivaloilo. Por tratamiento de esta lactona con un exceso de cloruro de pivaloilo en piridina se obtuvo el perpivaloil derivado 31 con 82 % de rendimiento. Asimismo, cuando se realizó la reacción con 2,2 equivalentes del reactivo acilante, se obtuvo el 2,6-di-O-pivaloil derivado 32, pues estas posiciones son las más reactivas debido a que el OH-6 es primario y el OH-2 se encuentra activado por efecto inductivo del carbonilo. Una vez sintetizados los dos testigos 31 y 32, se procedió a realizar la protección parcial de la D-galactono-1,4-lactona con 3,3 equivalentes de cloruro de pivaloilo. Se obtuvo una mezcla de 31; 2,3,6-tri-O-pivaloil (33) y 2,5,6-tri-O-pivaloil (34) derivados; y 32 con 21,6; 2,6; 9,6 y 30 % de rendimiento, respectivamente. La pobre selectividad enlaacilación parcial, aun con un grupo protector voluminoso como el pivaloilo, se debe a que el OH-3 se encuentra pseudo-ecuatorial y en una relación trans respecto del OH-2 y de la cadena lateral en el C-4. El bajo rendimiento obtenido para 34 sumado a la tediosa purificación demostraron que este método de protección parcial no resultaba conveniente y era necesario desarrollar una ruta alternativa. Sin embargo, se continuó el estudio de pivaloilación parcial de lactonas que presentaran una relación cis entre OH-2 y OH-3. La pivaloilación de D-gulono-1,4-lactona con 3,6 equivalentes de cloruro de pivaloilo resultó altamente regioselectiva en favor del 2,5,6-tri-Opivaloil derivado (35, 85 %) lo cual confirmaba la influencia de la configuración relativa de OH-2 y OH-3. También se aisló el perpivaloil derivado 36 como producto minoritario (2,6 %). A partir de D-manono-1,4-lactona en las mismas condiciones de reacción, cristalizó del crudo de reacción el 2,5,6-tri-O-pivaloil derivado 37 con 50 % de rendimiento. Se aisló además una pequeña cantidad del producto perpivaloilado 38. Considerando que la acilación selectiva de D-galactono-1,4-lactona conducía al 2,5,6-tri-O-acil derivado con bajo rendimiento. se pivaloiló selectivamente el OH-2 de la 5,6-O-isopropilidén-D-galactono-1,4-lactona (39) para obtener 5,6-O-isopropilidén- 2-O-pivaloil-D-galactono-1,4-lactona (40) cristalina con 79 % de rendimiento Una vez obtenido el aceptor deseado 40, era necesario efectuar la glicosidación con un derivado de galactosa piranósica. Dada la labilidad del isopropilidén frente al SnCl4. y teniendo en cuenta que se querían obtener los enlaces glicosídicos en las configuraciones α y β, se decidió utilizar el procedimiento del tricloroacetamidato para la activación del oxígeno anomérico de la galactosa convenientemente protegida. Para la síntesis del sintón de β-D-Galp-(1—>3)-D-Galf se trató 2,3,4,6-tetra-Oacetil- a,β-D-galactopiranosa con Cl3CCN y un equivalente de DBU por 30 minutos y se obtuvo el β-tricloroacetamidato 43 como un compuesto cristalino con 80% de rendimiento. Para formar el enlace glicosídico β, se condensó el aceptor 40 con el tricloroacetamidato 43, utilizando triflato de trimetilsililo(TMSOTf) como catalizador y se obtuvo el disacárido lactónico β 44 como un sólido amorfo con 84 % de rendimiento. La reacción fue altamente estereoselectiva como era de esperar debido a la asistencia anquimérica del acilo en C-2 de 40. La reducción de 44 con disiamilborano condujo a 45 como un sólido amorfo con 92 % de rendimiento. El rendimiento total del sintón de Galf interna 45, objeto de síntesis fue del 55 %. Debido a que la ruta desarrollada para la obtención de 45 era simple y teniendo en cuenta que la remoción de su isopropilidén conduciría al derivado en la configuración piranósica, se esbozó la posibilidad de que 45 fuera precursor también de β-D-Galp-(1—>3)-D-Galp. Por hidrólisis de 45 con AcOH acuoso. se obtuvo 46 como un sólido amorfo con 94 % de rendimiento. Se peracetiló 46 con anhídrido acético en piridina a 5°C , obteniéndose una mezcla de los derivados β-furanósico 47, α-furanósico 48; β-piranósico 49 y α-piranósico 50, en relación 12:8:33:47, respectivamente,y un 80 % en favor de la configuración piranósica, por lo tanto, esta mezcla podría utilizarse sin purificar para la introducción de β-D-Galp-(1—>3)-D-Galp en síntesis de oligosacáridos. Esta sintesis, por su simplicidad y rendimiento, se compara favorablemente con los metodos descriptos. Se aislaron y caracterizaron los compuestos 47, 49 y 50. Por otra parte, el compuesto 44 se redujo con NaBH4 y por posterior agregado de NaOMe en MeOH, se obtuvo β-D-galactopiranosiI-(1—>3)—D-galactitol (51) como un sólido cristalino con 98 % de rendimiento. Para la sintesis del sintón de α-D-Galp-(1—>3)-D-Galf se empleó un derivado de galactopiranosa que posee un grupo no participante en C-2 como el tricloroacetamidato de O-(2,3,4,6-tetra-O-bencil-β-D-galactopiranosilo) (52) que se obtuvo cristalino con 69 % de rendimiento siguiendo el procedimiento descripto. La condensación de la lactona 40 con el β-tricloroacetamidato 52 utilizando triflato de trimetilsililo como catalizador y éter como solvente a 0°C condujo al disacárido lactónico α 53 como un sólido amorfo con 74 % de rendimiento. Por hidrogenación catalítica de 53, tratamiento con ácido acético acuoso y posterior acetilación con anhídrido acético en piridina, se obtuvo 2,3,4,6-tetra-O-acetil-α-Dgalactopiranosil-( 1->3)-5,6-di-O-acetil-2-O-pivaloil-D-galactono-1,4-lactona (54) confirmando la configuración anomérica de su precursor 53. Una vez comprobada la alta diastereoselectividad de la glicosidación que condujo al disacárido lactónico α 53, se procedió a reducir lactona y así obtener el sintón objeto de síntesis. Por tratamiento de 53 con diisoamilborano se obtuvo 55 como un sólido amorfo con 88 % de rendimiento. La obtención del disacárido lactónico 44 no se pudo realizar utilizando SnCl4 como promotor y penta-O-benzoiI-β-D-galactopiranosa (15). Sin embargo, en las mismas condiciones, en presencia de SnCl4 y penta-O-benzoil-a,β-D-galactofuranosa, se obtuvo 56 cristalino con 58 % de rendimiento. Con el fin de confirmar la posición en donde ocurrió la glicosidación, se benzoiló 56 con cloruro de benzoilo en piridina y se obtuvo 2,3,5,6-tetra-O-benzoil-β-D-galactofuranosil-(1—>3)5,6- di-O-benzoil-2-O-pivaloil-D-galactono-1,4-lactona (57), confirmando la estructura de su precursor. Por tratamiento de 56 con NaBH4y posterior agregado de NaOMe en MeOH. se obtuvo β-D-galactofuranosil-(1—>3)-D-ga|actitol(58) como un sólido cristalino con 95 % de rendimiento. En este trabajo de tesis se han sintetizado 57 compuestos, de los cuales 46 (3, 4, 6-11, 15-17, 19-38, 40. 44-47, 49-51, 53-58) no se encontraban descriptos en literatura.

Los péptidos son polímeros que contienen entre dos y pocas docenas de aminoácidos, unidos por enlaces peptídicos entre el grupo carboxilo de uno de ellos y el grupo α-amino del siguiente, con límite de masa molecular de 6.000 Da y de relevancia para el cuidado de la salud y la nutrición. El mercado mundial de péptidos está orientado principalmente a la industria farmacéutica, y se estima que alcanzará US $ 23.70 millones en 2020, lo que significa una tasa de crecimiento anual compuesta de 2,8 % para el período 2014 a 2020. En contraste, la producción de péptidos bioactivos para uso alimenticio (nutracéuticos, alimentos funcionales y conservantes) es escasa, aunque es un ámbito de intensa investigación. El objetivo general de este trabajo es aplicar proteasas pre-purificadas de Asclepias curassavica L. (Asclepiadaceae), una planta superior que crece en Argentina, en forma soluble o inmovilizada y en sistemas acuoso-orgánicos, como un nuevo catalizador de la síntesis de péptidos con potencial actividad antihipertensiva in vitro.La originalidad de este trabajo está centrada tanto en la síntesis de péptidos con potencial actividad antihipertensiva in vitro utilizando fitoproteasas autóctonas, como en su potencial aplicación en la formulación de alimentos funcionales. Para seleccionar los medios de reacción más promisorios de las síntesis de péptidos, se estudió el efecto de los solventes orgánicos sobre la actividad proteolítica y la estabilidad operacional de asclepaína en sistemas homogéneos y macroheterogéneos, utilizando la enzima libre e inmovilizada en diferentes soportes. Los medios de reacción más promisorios fueron el sistema homogéneo formado por metanol 30 % v/v en buffer Tris-HCl 0,1 M pH 8, y el sistema macroheterogéneo formado por 50 % v/v de acetato de etilo en buffer Tris-HCl 0,1 M pH 8. En ellos, asclepaína expresó tiempos de vida media de 7,21 y 11,07 h, respectivamente.El efecto de los de los solventes orgánicos sobre la estructura secundaria de asclepaína cI se estudió por FTIR y se evaluó mediante el coeficiente de similitud espectral (r), tomando como referencia la estructura secundaria obtenida en buffer Tris-HCl 0,1 M pH 8. Asclepaína cI no mostró diferencias significativas de r en buffer, metanol 30 % v/v o DMS 70 % v/v, en concordancia con el hecho de que en dichos medios miscibles se obtuvieron los mayores tiempos de vida media de asclepaína. Por el contrario, asclepaína cI en los sistemas bifásicos formados por 1-octanol 30 % v/v, hexano 50 % v/v, acetato de etilo 50 % v/v en buffer Tris-HCl 0,1 M pH 8, presentó diferencias espectrales significativas. Sin embargo, y a pesar de su menor similitud, asclepaína cI mostró mayor estabilidad en los sistemas bifásicos que en los sistemas miscibles seleccionados. La selección del donador de acilo (sustrato limitante) para las reacciones de síntesis se realizó mediante un estudio de las preferencias de asclepaína por diversos derivados aminoacídicos sintéticos, en los medios de reacción previamente seleccionados.Asclepaína en buffer Tris-HCl 0,1 M pH 8 y en metanol 30 % v/v exhibió amplia preferencia por los derivados aminoacídicos no polares, especialmente por Val; mientras que en acetato de etilo 50 % v/v mostró preferencia por los aminoácidos polares, especialmente por Gln y Tyr.A partir de la base de datos BIOPEP (2012) y de bibliografía, tomando como base las preferencias de asclepaína, se seleccionaron los péptidos Val-Gly (VG), Gln-Gly (QG) y Tyr-Gln (YQ), con actividad antihipertensiva in vitro con el objeto de sintetizarlos por vía enzimática. Se obtuvieron con éxito los péptidos Z-VG, análogo de VG, Z-QG, análogo de QG y Z-YQQ, análogo de YQ. El péptido Z-VG fue sintetizado por vía enzimática bajo control cinético y termodinámico, en metanol al 30 % v/v en buffer Tris-HCl 0,1M pH 8, utilizando asclepaína en forma soluble e inmovilizada. El rendimiento en producto de la reacción de síntesis bajo control cinético y termodinámico, utilizando asclepaína soluble, fue de 19 % y 13,5 %; pero se logró una maximización de 95 % de rendimiento empleando asclepaína inmovilizada en OGS bajo control cinético. El péptido Z-QG fue obtenido mediante síntesis bajo control cinética y no así bajo control termodinámico; el rendimiento máximo alcanzado fue de 76,43 %.El péptido Z-YQQ fue sintetizado por vía enzimática bajo control cinético en acetato de etilo 50 % (v/v) y buffer Tris-HCl 0,1M (pH 8), con un rendimiento de 100 % utilizando asclepaína soluble como catalizador.La actividad antihipertensiva de los péptidos Z-YQQ y Z-VG se evaluó como actividad inhibitoria de ECA en ensayos in vitro. El péptido de síntesis enzimática Z-YQQ-OH mostró un porcentaje de inhibición 35,5 % mayor al expresado por el péptido modelo YQ (Shamloo y col., 2015). Por el contrario, la actividad antihipertensiva del péptido Z-VG fue 37,3 % inferior a la del péptido análogo VG (Cheung y col., 1980). No obstante, en ambos casos los valores de IC50 obtenidos son notablemente mayores que el valor correspondiente al del inhibidor comercial captopril (IC50 de 0,21 x 10-4 mM), dicha diferencia puede deberse a que no existe un método estandarizado para medir la actividad antihipertensiva in vitro como actividad inhibitoria de ECA; por lo que éstos valores serán corroborados por una nueva metodología.Los resultados del párrafo anterior demuestran que Z-YQQ y Z-VG son promisorios agentes antihipertensivos, el primero en mayor medida. Por ello fue seleccionado para realizar estudios de toxicidad, estabilidad y otras actividades biológicas del mismo. Al evaluar la actividad antimicrobiana de Z-YQQ en un cultivo batch a escala de laboratorio frente a una cepa Gram positiva (S. aureus ATCC 25923) y frente a una cepa Gram negativa (E. coli ATCC 25922) no se observó inhibición del crecimiento microbiano.Por otra parte, se determinó la actividad anticoagulante del péptido Z-YQQ mediante Wiener Lab Test. El péptido sintetizado por vía enzimática Z-YQQ actuó sobre la vía general y sobre la vía extrínseca de la cascada de coagulación sanguínea, aumentando el tiempo de coagulación y retrasando el tiempo de polimerización de fibrinógeno a fibrina y la formación del coágulo, de manera similar a heparina. Dichos resultados pusieron de manifiesto su potencial, no solo como agente antihipertensivo, sino también como agente anticoagulante. Además, se demostró que el péptido Z-YQQ retuvo el 82 % de su actividad anticoagulante durante 15 min en un pool de plasma humano de individuos sanos, demostrando la alta estabilidad del péptido sintetizado en el rango de tiempo estudiado.La toxicidad aguda del péptido Z-YQQ se determinó como porcentaje de viabilidad celular después de exponer, durante 4 h a 37 °C, la línea celular humana 293 FT a diferentes concentraciones del péptido mencionado. Se empleó el método estadístico Kruskall-Wallis ANOVA para evaluar las diferencias significativas en los valores de viabilidad celular y se determinó que Z-YQQ no fue citotóxico en ensayos in vitro a las concentraciones analizadas.En general, esta tesis doctoral aporta nuevas estrategias y productos de interés para la industria alimenticia y farmacéutica, que implican una expansión del mercado actual y la potencial transferencia de resultados al sector socio-productivo interesado en los mismos. Además, contribuye al aprovechamiento de los recursos naturales renovables autóctonos de nuestro país, como son las fuentes vegetales de enzimas proteolíticas que han sido escasamente exploradas y no poseen patentes que dificulten su explotación.

Los sistemas binarios de rayos X de alta masa (en inglés denominados high mass X-ray binaries, HMXBs) son sistemas compuestos por un objeto compacto, ya sea un agujero negro o una estrella de neutrones, y una estrella compañera masiva (≥ 3Mʘ). En estos sistemas, el objeto compacto acreta materia de su estrella compañera, convirtiendo parte de la energía liberada en radiación electromagnética en el rango de los rayos X (0.1 − 100 keV). En la última década, distintos resultados observacionales y teóricos afirman que los sistemas HMXB serían más numerosos y luminosos cuando las estrellas progenitoras son de baja metalicidad. El camino libre medio largo de los fotones emitidos, junto con la dependencia química, sugieren que las HMXBs podrían jugar un rol importante como fuentes de inyección de energía al medio intergaláctico, principalmente en las primeras etapas de la formación de galaxias. Otros resultados también sugieren que podrían afectar al entorno de las HMXBs, proveyendo una cantidad significativa de energía térmica. La presente Tesis explora dos aspectos importantes en relación a las HMXBs. Por un lado, se investiga el rol de la metalicidad en la luminosidad y abundancia de fuentes HMXB en galaxias de alta formación estelar. Para ello, se utilizan catálogos pertenecientes a simulaciones numéricas de formación de galaxias, que describen de manera autoconsistente la evolución química y la formación estelar. Los resultados se comparan con los datos obsevacionales existentes a la fecha, hasta corrimientos al rojo de z ~ 4.0, encontrándose evidencia que apoya la hipótesis de la dependencia de las propiedades de estas fuentes con la metalicidad. El segundo aspecto estudiado, son los efectos de las HMXBs como fuentes de energía al medio. En este caso se consideran además, que su dependencia con las propiedades químicas harían de las mismas una fuente importante de energía que regularía la formación estelar de las primeras galaxias. Para llevar a cabo dicho estudio, se han incluído modelos semianalíticos dentro de las simulaciones hidrodinámicas cosmológicas de formación de galaxias. Las simulaciones incluyen además la inyección química y de energía al medio por supernovas tipo II y Ia. Los resultados muestran que la inyección de energía térmica al medio interestelar por las HMXBs, permite describir la tasa de formación estelar cósmica observada y retrasa la formación estelar en halos de baja masa (≤10¹ºMʘ). Por último, se estudia cómo la energía depositada por las HMXBs al medio, puede afectar las distintas propiedades de las galaxias simuladas. Estas propiedades se comparan con datos observacionales y otros resultados numéricos previos.