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La miel es un alimento natural elaborado por las abejas melíferas y como tal, presenta una microbiota propia al igual que el resto de los alimentos. Las especies bacterianas formadoras de esporas de los géneros Bacillus y Paenibacillus aparecen en forma frecuente, y, dentro de ellas, se cita Bacillus cereus sensu stricto que está asociada a procesos infecciosos humanos como productora de enterotoxinas. En la miel también pueden encontrarse bacterias causantes de enfermedades de las abejas como la loque americana, ocasionada por Paenibacillus larvae, y la loque europea, producida por Melissococcus plutonius. Durante muchos años, estas enfermedades se trataron con el antibiótico oxitetraciclina, generando la aparición de resistencia de los agentes microbianos que se querían controlar con la consiguiente aplicación de dosis cada vez mayores, y la contaminación de la miel con residuos de estas sustancias. El aumento de la prevalencia de la resistencia antimicrobiana en bacterias patógenas, es el resultado de la evolución y la presión selectiva debido a la amplia implementación del uso de antibióticos en medicina humana, medicina veterinaria, alimentación animal y agricultura. Esta adaptación ocurre, no por la mutación de las poblaciones amenazadas, sino mayormente por la adquisición y diseminación de genes simples de resistencia a antibióticos mediante elementos genéticos móviles, tales como plásmidos y transposones. Estos elementos móviles distribuyen eficientemente los determinantes de resistencia a antibióticos, individualmente o en grupos, entre muchos géneros y especies bacterianas. En el caso de las tetraciclinas, la resistencia se debe a la adquisión de genes tet (tetraciclina) y otr (oxitetraciclina); frecuentemente estos genes están asociados con plásmidos y/o transposones conjugativos. Con el objetivo de investigar la presencia de determinantes de resistencia a tetraciclina, oxitetraciclina y minociclina en cepas de B. cereus y P. larvae aisladas de miel y materiales del apiario y su correlación con la presencia de plásmidos salvajes se aplicaron procedimientos de microbiología y biología molecular. Se analizó la presencia de los determinantes de resistencia a tetraciclina: Tet K, Tet L, Tet M, Tet O, Tet Q, Tet S, Tet A (P) y Otr A y se observó una alta correlación entre la presencia de plásmidos y fenotipos resistentes a tetraciclina. Mediante PCR, se detectó la presencia del determinante Tet L empleando como molde ADN plasmídico en un 76% de las cepas de B. cereus estudiadas y del determinante Tet M en la cepa B. cereus m383 con fenotipo resistente a tetraciclina, oxitetraciclina y minociclina cuando se utilizó como molde ADN genómico total, pero no así cuando se utilizó ADN plasmídico. Con respecto al resto de los determinantes de resistencia analizados (Tet K, Tet O, Tet Q, Tet S, Tet A (P) y Otr A), no se observó producto de amplificación alguno en las cepas estudiadas, ni en ADN genómico total ni en ADN plasmídico. Se realizaron ensayos de conjugación entre cepas resistentes y sensibles, y de transformación por electroporación con ADN plasmídico obtenido de cepas resistentes, demostrando una transferencia horizontal de genes de resistencia a tetraciclina entre la cepa de B. cereus m401, resistente a tetraciclina, y las cepas de B. cereus ATCC 11778 NALR y B. pumilus m350 NALR, sensibles a tetraciclina. Se obtuvieron transconjugantes con fenotipo resistentes a tetraciclina para ambas cepas aceptoras, pero no se obtuvieron transformantes en los ensayos de electroporación. Mediante el análisis de los resultados de la secuenciación del genoma completo de la cepa de B. cereus m401 se confirmó la presencia de 3 plásmidos, a los cuales denominamos pBCm401a, pBCm401b y pBCm401, de 8.307 pb, 9.934 pb y 69.591 pb, respectivamente. Luego del análisis de las anotaciones funcionales de los genes codificantes de proteínas obtenidos en estos 3 plásmidos no se encontraron genes que codifiquen funciones relacionadas con resistencia a tetraciclina. Al no encontrar en ninguno de los tres plásmidos genes que codifiquen resistencia a tetraciclina, se efectuó la búsqueda de dichos genes en el resto de los contigs obtenidos del genoma (n=46). Luego del análisis de las anotaciones funcionales se detectó un contig (contig09) de 243.988 pb conteniendo un gen de resistencia a tetraciclina de 1.377 pb (contig09_orf00135) con alta homología a los genes tetK, tetL y tet45, que codifican para proteínas de eflujo. Según el análisis efectuado en la base de datos del servidor GenBank mediante la herramienta BLASTn, este contig se correspondería con secuencias similares pertenecientes a megaplásmidos de B. cereus y B. thuringiensis. Los resultados del análisis del alineamiento de la secuencia correspondiente al gen de resistencia a tetraciclina presente en el contig09 con secuencias correspondientes a los genes de resistencia tetK, tetL y tet45 permitieron concluir que el gen de resistencia a tetraciclina presente en la cepa m401 se correspondería con el gen tet45, ya que muestra mayor homología (93%) con la secuencia de dicho gen, con respecto a los genes tetL (80%) y tetK (64%). Por todo lo expuesto, se puede concluir que este trabajo es el primer registro de la presencia del gen de resistencia tet45 en un posible megaplásmido de B. cereus.

Se describe un método para la síntesis química del ALA 4 14C. Se hace un estudio detallado sobre el aislamiento, purificación y propiedades de la enzima "Delta aminolevúlico dehidrasa". Se logró purificar la delta amino levúlico dehidrasa aislada de hígado vacuno unas 310 veces, resultando ser una enzima soluble. Es una enzima sulfhidrílica, cuya actividad es dependiente de la activación de grupos SH, con agentes tiol reductores, especialmente cuando se la purifica y estrictamente anaeróbico aún en las primeras etapas de su purificación. Presenta un pH óptimo a 6,8 en buffer de fosfato de potasio 0,067 M como en buffer Tris-ClH 0,05 M, aunque en este último buffer, la enzima es 30% menos activo. Es estable al calor y tiene una temperatura óptima de acción a 65°C, habiéndose determinado una energía de activación de 10.600 cal/mol. La formación de PBG resulta función lineal de la concentración de delta aminolevúlico dehidrasa, y del tiempo. Se determinó un PM de 140.000 ± 14.000 por el método de tamices moleculares, obteniéndose además evidencias que sugieren la existencia de subunidades de peso molecular 70.000 ± 7.000. Por electroforesis en gel de poliacrilamida y en gel de almidón a distintos pH, así como por ultracentrifugación se comportó como una única entidad proteica; determinándose un pI = 4,9. Tanto para la enzima previamente activada con cisteína, como para una preparación sin activar, se determinó sólo un grupo -SH funcional catalíticamente en cambio se titularon 3 grupos SH en presencia de urea 8 M. Por estudios comparativos con la delta amino levúlico dehidrasa purificada de callos de semilla de soya se ha propuesto un modelo estructural para ambas enzimas, con respecto a la distribución de los grupos -SH, en base a unidades de PM 140.000. En buffer Tris ClH la enzima presentó una curva de saturación sigmoidea con una [S0,5] = 3 x 10^(-4) M y un "n" de Hill igual 2,2, sin embargo en buffer de fosfato de potasio, el perfil cinético fué Michaeliano con un Km de 1,5 x 10^(-4) M. Se considera el ión fosfato, un efector heterotrópico positivo de la enzima. De los iones estudiados, sólo el Zn(++) produjo una ligera activación. No se determinó requerimiento de metales en especial, aunque la enzima fué inhibida por distintos agentes quelantes. Las bases púricas y nucleótidos de adenina a 10^(-2) M inhibieron marcadamente la actividad de la enzima. La delta amino levúlico dehidrasa de hígado vacuno fué inhibida por bajas concentraciones de Protoporfirina y Hemina. En base a esta inhibición, por producto final, al hecho de que esta enzima se encuentra ubicada en el punto de divergencia en la utilización del ALA, a que cataliza la síntesis del primer intermediario pirrólico exclusivamente utilizado en la biosíntesis de porfirinas a que en ciertas condiciones se comporta cinéticamente como una enzima alostérica, la delta levúlico dehidrasa en hígado vacuno estaría también involucrada en la regulación de la biosíntesis del Hemo en este tejido.

La transición vitrea que se manifiesta macroscópicamente por cambios fisicos(ablandamiento del material) ocurre a una temperatura (Tg) que representa un punto critico para la movilidad de los componentes amorfos a nivel molecular. El objetivo de este trabajo de Tesis fue estudiar el efecto de la transición vitrea sobre la estabilidad enzimática y quimica en alimentos y biomateriales a muybajas humedades. El análisis se llevó a cabo estudiando reacciones susceptibles de estar afectadas por efectos de movilidad/difusión de los reactivos: resistencia térmica enzimática (enzima invertasa (β-fructofuranosidasa)) y pardeamiento no enzimático. Las conclusiones fueron las siguientes: 1. La temperatura de transición vitrea no puede ser utilizada como un umbral absoluto para predecir la inactivación térmica de la enzima invertasa, ni para definir la estabilidad con respecto a las reacciones de pardeamiento no enzimático en sistemas modelo y alimentos deshidratados. 2. Las matriz de trehalosa es superior a las matrices poliméricas en la protección de la enzima invertasa. 3. A altas temperaturas, la temperatura de almacenamiento per se es un factor más importante que T-Tg con respecto a la estabilización de la enzima invertasa y al desarrollo de pardeamiento no enzimático. 4. La estabilidad química de los azúcares frente a la hidrólisis, aun en condiciones de baja humedad, es un factor importante a tener en cuenta en la selección de matrices protectoras de biomateriales. 5. En sistemas de baja humedad los resultados obtenidos sugieren que el azúcar rafinosa podria considerarse como una alternativa de la trehalosa como matriz protectora de biomateriales.

Entre noviembre de 1982 y de 1984 se realizó un estudio longitudinal de la dinámica de transmisión del T. cruzi a niños y perros en 20 viviendas de la población de Amama, Pcia. de Santiago del Estero, en la que nunca se había llevado a cabo una campaña oficial de desinsectación domiciliaria, y que al tiempo de la encuesta de 1984, aún se hallaba fuera de los programas gubernamentales de control. En ambas encuestas se estudió por serologia y xenodiagnóstico a todos los habitantes, incluyendo perros y gatos, y se realizaron capturas de T. infestans por unidad de esfuerzo en los dormitorios de cada una de las casas, siendo los insectos posteriormente examinados para detectar la presencia de T. cruzi en la materia fecal. Los resultados obtenidos indican que: a) la densidad domiciliaria de vectores infectados (DVI) se mantiene en niveles similares en casi todas las casas, aumentando significativamente en aquellas que abandonan sus hábitos de lucha contra el vector, b) aquella caracteristica, en consecuencia, se refleja en que las curvas de prevalencia de T. cruzi en función de la edad de los hospedadores y de la DVI presentan un patrón estable, c) la prevalencia y la incidencia del T. cruzi en la población de niños varía en función de la DVI existente en la vivienda, habiendo casas infestadas de "bajo riesgo" en las cuales no se observó la aparición de casos nuevos entre los niños susceptibles de contraer la infección en 1982 luego de 2 años de seguimiento, d) los perros se hallan expuestos a un mayor riesgo de infección que los niños que cohabitan la vivienda, y por lo tanto, pueden servir como centinelas naturales de la reintroducción del parásito al ciclo doméstico de transmisión una vez que se ha alcanzado la etapa de vigilancia epidemiológica, e) existe una fuerte asociación entre la presencia de perros infectados en la vivienda y prevalencia e incidencia de T. cruzi en niños, señalando a los reservorios caninos como un factor de riesgo para la población humana. Los resultados de los xenodiagnósticos realizados a 121 perros seropositivos del área de estudio entre 1982 y 1986 indican que la parasitemia por T. cruzi en perros naturalmente infectados evaluada por xenodiagnóstico no se halla asociada: a) a la edad; b) a1 sexo; c) a la existencia de reinfecciones mediadas por el vector en el ambito domiciliario, al menos luego de 1 año de interrumpida la transmisión vectorial. En consecuencia, y considerando las altas frecuencias de alimentación sobre perro de las poblaciones naturales de T. infestans de areas endémicas, los reservorios caninos deben considerarse los principales productores de vectores infectados en el ciclo doméstico de transmisión de areas rurales de la región chaqueña argentina. Esta caracteristica, unida a que los perros poseen mayor probabilidad de infección que los niños que cohabitan la vivienda, favorece la hipótesis de que el vínculo entre los casos nuevos infectados y la presencia de perros infectados en la vivienda sea de tipo causal indirecto a través del vector. Los censos de la población canina de Amamá realizados en 1985 y 1986 revelaron que la misma se halla en estado aproximadamente estacionario, con un tamaño estable de 101 individuos. Tanto la edad mediana de la población (2 años) como la expectativa de vida media a partir del destete (3,5 años) señalan una población joven con un fuerte recambio, en la cual el mayor factor de mortalidad hallado radica en la mano del hombre, quien sacrifica al momento del nacimiento el 33 al 50% de los cachorros nacidos vivos, especialmente las hembras, y asi regula la población. Con el objetivo de evaluar cual seria la caida en la prevalencia de T. cruzi en la población canina si se erradicara al vector domiciliario del area, los datos demográficos obtenidos se utilizaron para elaborar un modelo que describiese aquella situación. Este modelo, basado en una población en estado estacionario en la cual no existe transmisión vertical ni inmigración de perros infectados, y en la cual la mortalidad es independiente de T. cruzi, predice que la disminución en la prevalencia será función de la tasa de mortalidad específica por edades, de la estructura de edades y de la tasa de infección asociada a cada una de éstas. Un año después de la desinsectación de Amamá con piretroides de alto poder residual, se evaluó la infestación en la comunidad y la prevalencia de la población canina con el objetivo de validar el modelo construido. La prevalencia observada (59%) se acercó en forma altamente significativa al valor esperado (60%), indicando que el modelo refleja satisfactoriamente la dinámica del proceso, al menos en un corto plazo luego de la intervención contra el vector.

El continuo incremento demográfico, así como la industrialización, demandan grandes cantidades de energía. La bioenergía cumple un rol muy importante en la mitigación de la emisión de gases de efecto invernadero, así como en el reemplazo de los combustibles fósiles (Demirbas & Demirbas, 2010).Los biocombustibles líquidos, como el bioetanol y el biodiesel son importantes para el futuro debido a que reemplazan a los combustibles derivados del petróleo. El bioetanol deriva de recursos naturales renovables, típicamente de plantas como el trigo, remolacha azucarera, maíz, residuos lignocelulósicos y madera (Demirbas, 2009). El biodiesel es obtenido de plantas oleaginosas tales como la soja o colza (Rulli et al., 2016).El uso de cultivos agrícolas como materia prima para la producción de biocombustibles plantea serias dudas sobre su sustentabilidad debido a sus posibles efectos en la seguridad alimentaria y los problemas ambientales relacionados con el cambio en el uso de la tierra, la huella hídrica y la gran dependencia de los fertilizantes sintéticos, entre otras preocupaciones (Tilman et al., 2002; Erisman et al., 2008; Gerbens-Leenes et al., 2009).Las microalgas y las cianobacterias se consideran una alternativa cada vez más prometedora a los cultivos convencionales (y residuos lignocelulósicos), como materia prima para la producción de biocombustibles y suplementos para la alimentación animal, debido principalmente a su mayor productividad fotosintética y a una composición bioquímica más favorable (ausencia de lignina), así como la posibilidad de cultivo en tierras no aptas para la agricultura, entre otras características. Un impedimento para la implementación a gran escala del cultivo de estos organismos es el requerimiento insostenible de fertilizantes N y P, así como también los altos costos asociados a la colecta de la biomasa. Hay un acuerdo generalizado en que la obtención únicamente de biocombustibles a partir de biomasa de microalgas no es rentable económicamente, por lo que se presume que la co-producción de productos de alto valor agregado en el marco de una biorrefinería, incrementaría la rentabilidad de producir aceites o azúcares a partir de microalgas, con un mínimo de residuos y emisiones (Demirbas, 2009).En esta tesis proporcionamos una prueba de concepto para una plataforma de ciclo semi-cerrado de producción de algas y la biorrefinería de la biomasa obtenida, para la producción de etanol y biodiesel a expensas del CO2 y N2 atmosféricos, y del P de harina de huesos. Esta plataforma brinda conceptos de economía circular en el campo de la biorrefinería de biomasa de microalgas. En esta plataforma, el N2 se asimila en la biomasa de una cianobacteria fijadora de N2 (Nostoc sp. cepa M2) que acumula niveles muy altos de biomasa (2 g peso seco.L-1) y proteína (60 % p/p). Esta cepa se seleccionó debido a su rápido crecimiento y a la característica decantación de sus células en períodos muy cortos de tiempo (15-30 min).La extracción acuosa de esta biomasa produjo un fertilizante orgánico, que sostuvo el crecimiento mixotrófico como única fuente de nutrientes, de una amplia diversidad de géneros de microalgas. Se demostró la completa sustitución de fertilizantes nitrogenados químicos mediante el proceso de fijación biológica del N2 con una conversión eficiente de biomasa de la cianobacteria fijadora de nitrógeno en biomasa de microalgas con alto contenido de aceites o azúcares fermentables. Asimismo, se demostró la posibilidad de obtener ficobiliproteínas de alto valor agregado a partir de estos extractos libres de células, de inocuidad aparente.Los rendimientos de producción de aceites de Chlorella sorokiniana (42 % lípidos p/p), en simulaciones en fotobiorreactores ambientales estuvieron en el rango de los rendimientos actuales obtenidos a expensas de fertilizantes sintéticos para microalgas cultivadas en piletas a cielo abierto (10.000-13.000 L-1.ha.año-1) y fueron 20 veces superiores al rendimiento reportado cuando se utilizan cultivos agronómicos (soja) como materia prima.A partir de la bioprospección de microalgas nativas de nuestra colección se seleccionaron 3 cepas con potencial biotecnológico (Desmodesmus sp. cepa FG, Chlorella sp. cepa MI y la cepa SP2-3) para la producción de etanol mediante la evaluación de su capacidad para acumular azúcares fermentables en condiciones de estrés nutricional. Se seleccionó a la microalga Desmodesmus sp. cepa FG debido a que presentó rendimientos muy altos (8 g peso seco.L-1), y un crecimiento robusto que acumuló altos niveles de carbohidratos (60 % p/p). La biomasa de algas se sacarificó y esta condición ácida se utilizó secundariamente para liberar fosfato soluble de diferentes fuentes de P renovables, incluida la harina de huesos. Después de aumentar el pH, la preparación resultante se fermentó con levaduras para producir etanol con valores aproximados al 90 % de su rendimiento teórico. Se pudo demostrar tanto una alta eficiencia de conversión de biomasa a etanol de 0,25 g·g biomasa-1 como una alta concentración de etanol en el caldo de fermentación de 24 g etanol.L hidrolizado-1; así como también se ha obtenido CO2 como una fuente puntual reutilizable a rendimientos cercanos al máximo teórico.La simulación de la productividad de la microalga a expensas del fertilizante orgánico a base de Nostoc en fotobiorreactores ambientales, que imitan las condiciones de estanques abiertos dio como resultado que con la eficiencia de conversión de biomasa a etanol demostrada en esta tesis, esta plataforma podría producir, bajo las condiciones ambientales del Sudeste de la provincia de Buenos Aires, entre 7.600 y 10.800 L de etanol.ha-1.año-1, dependiendo de si Nostoc se cultiva en estanques al aire libre o en fotobiorreactores tubulares, respectivamente. Los rendimientos de producción de etanol fueron 2-3 o 5-7 veces superiores al rendimiento reportado cuando se utilizan como materia prima granos de maíz o residuos lignocelulósicos (Karlen et al., 2011; Pimentel & Patzek, 2005).La vinaza de fermentación resultante, suplementada con P, se recicló eficientemente como única fuente de macronutrientes para el cultivo de la biomasa de la cianobacteria fijadora de N2 para cerrar un ciclo de producción.También se muestra el reciclado de agua y la co-producción de biomasa residual como posible suplemento nutricional para producción animal y yeso, que puede utilizarse como material para la construcción o como una enmienda para suelos.La plataforma de ciclo semi-cerrado de producción de biomasa algal a partir de materias primas económicas y renovables, el reciclado intensivo de nutrientes y la minimización de desechos, introducen conceptos de economía circular a la biotecnología algal. Se espera que diseños de este tipo contribuyan a la seguridad alimentaria y energética a largo plazo.