Catálogo de publicaciones

Fil:Rossetti, María Victoria. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Fil:Stella de Rosellini, Ana María Cristina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Fil:Correa García, Susana Raquel. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Los resultados obtenidos al estudiar el posible rol fisiológico y las propiedades cinéticas y estructurales de la enzima málica dependiente de NADP purificada de trigo sugieren la existencia de una única isoforma de 72 kDa en los tejidos de esta especie C3. Esta enzima fue purificada a homogeneidad a partir de tallos y raíces de trigo y con ella se realizaron estudios cinéticos. La enzima no presenta histéresis. Los valores obtenidos de pH óptimo coinciden con los anteriormente descriptos para otras enzimas de plantas C3 y CAM y difieren con el comportamiento de la enzima de plantas C4. La actividad enzimática fue absolutamente dependiente de la presencia de un catión bivalente (Mg2+ o Mn2+), mostrando cinéticas de saturación no hiperbólicas como sucede con la EM-NADP de plantas C4. Por otra parte, las curvas de saturación obtenidas en función da la concentración de NADP y L-malato fueron hiperbólicas. La actividad de EM-NADP fue inducida por tratamiento con celulasa macerosima y glutatión, y este aumento fue asociado con aumentos de proteína determinado a partir de Western blots. Estos resultados sugieren que la EM-NADP de plantas C3 podría estar involucrada en la biosíntesis de lignina relacionada con respuestas de defensa de la planta, proveyendo de NADPH a los dos pasos dependientes de NADPH de la biosíntesis de monolignol. Las EM-NADP de maíz y de trigo se disocian en un medio acidico y bajas temperaturas de manera secuencial siguiendo el orden T-D-M. Las entalpías para los equilibrios fueron negativas, pero el proceso total provoco un cambio de energía libre estándar positiva siendo la entropía del sistema un factor importante en ambos equilibrios. La presencia de Mg2+, NADP y L-malato modifican los equilibrios entre M, D y T dependiendo de la fuente enzimática. El catión indujo la agregación de ambas enzimas hacia la forma tetramerica, mientras que el L-malato no modifico el estado oligomérico de la EM-NADP de ambas fuentes. El NADP no cambio el estado multimérico de la enzima de maíz aunque la enzima de trigo se asoció en presencia de la coenzima. Por último, el glicerol estabilizo la forma tetramerica en ambos sistemas, mientras que un aumento en la fuerza iónica favoreció la disociación de la estructura oligomérica de la EM-NADP. Estos resultados favorecen la idea de que la EM-NADP de maíz y de trigo existiría en varios estados oligoméricos (M, D y T) in vivo y que este proceso de asociación-disociación podría estar mediada por la concentración de metabolitos en el medio, condiciones de luz, fuerza iónica y el pH. La actividad de la enzima málica dependiente de NADP fue inducida por radiación UV-B, al igual que el contenido proteico y el ARNm a casi el mismo nivel que por altos niveles de luz blanca dependiendo de la intensidad de la luz y la duración del tratamiento. El efecto de la radiación UV-B fue también eficaz cuando se administraron pequeñas dosis de UV-B seguidas por un tratamiento de oscuridad. La luz roja fue efectiva en la inducción de EM-NADP, de manera similar a la radiación UV-B, administrada tanto en forma continua como por periodos cortos. Nuestros resultados también muestran también que luego de una exposición corta bajo luz roja lejana aplicada inmediatamente después de los pulsos de luz UV-B o roja el efecto inductivo sobre la enzima málica se reduce significativamente, y el efecto de la luz roja lejana se revierte por un pulso final con luz roja o UV-B. De esta manera proponemos que elevados niveles de EM-NADP podrían proveer a las plantas con mayor cantidad de poder reductor para reparar a la célula y además aumentar el contenido de piruvato y NADPH para la respiración mitocondrial. Las especies C3 de Flaveria poseen baja actividad de EM-NADP, que es principalmente atribuida a la forma de mayor masa molecular de la enzima, mientras que las especies C4 de Flaveria poseen muy altas actividades de EM-NADP en hojas atribuible a la presencia en forma mayoritaria de la isoforma de baja masa molecular. La isoforma de mayor masa molecular en las especies de Flaveria C3 parece poseer una mayor Km para el NADP que la forma de menor masa molecular de las especies de Flaveria C4. Los Western blots realizados con extractos proteicos de hojas de distintas especies C3 muestran que la banda inmunoreactiva mayoritaria es el monómero de 72 kDa y presenta bajos niveles de las formas de menor masa molecular (62 y 64 kDa), mientras que las especies de Flaveria C4 muestran una banda muy reactiva de 62 kDa de la EM-NADP, y bandas menores de 64 y 72 kDa. En las especies C3 y C4 existen hasta tres formas monoméricas de la enzima de 62, 64 y 72 kDa, y la cantidad relativa de cada forma puede variar entre los intermediarios. En hojas de especies similares a C4, existen dos bandas predominantes (62 y 64 kDa), estando la forma de 72 kDa presente en muy bajos niveles. En conjunto, todos estos resultados demuestran la presencia de 3 isoformas de la EM-NADP con diferentes masas moleculares en Flaveria, un aumento en la expresión de las forma de 64 kDa desde las especies C3 hasta las similares a C4, y un aumento en la expresión de la forma de 62 kDa y una disminución de la expresión de la forma de 72 kDa desde las especies C3 hasta las C3-C4, similar a C4 y las C4. La EM-NADP se localiza principalmente en los cloroplastos, tanto en células mesofilicas de las plantas C3 y en ambos tipos de células fotosintéticas en las otras especies siendo mayoritaria la marca en células de la vaina vascular en las especies C4. En especies intermedias, la marca mayoritaria se encontró en los cloroplastos de la vaina vascular mientras que una marca significativa también se observó en cloroplastos mesofilicos. Se observaron tres formas activas de la EM-NADP en hojas de la especie intermediaria C3-C4 F. floridana que se diferencian por masa molecular y puntos isoeléctricos nativos. La EM-NADP se encuentra parcialmente compartamentalizada en los distintos tipos de células fotosintéticas, obteniéndose una mayor actividad específica y una mayor expresión de las formas de 64 y 62 kDa en la fracción correspondiente a los cloroplastos de la vaina vascular. La forma purificada de 62 kDa presenta propiedades cinéticas intermedias entre las enzimas málicas de plantas C3 y C4. La enzima exhibe un máximo de actividad a pH 7,5 de manera similar a lo observado con otras enzimas de plantas C3 y CAM y difiriendo con el comportamiento de la enzima de plantas C4. La actividad enzimática depende de la presencia de un catión bivalente (Mg2+ o Mn2+). Las cinéticas de saturación obtenidas para NADP y L-malato fueron hiperbólicas y no se observó inhibición por L-malato a pH 7,0, difiriendo al comportamiento de plantas C4 e indicando que la enzima presenta características intermedias. En resumen, la forma purificada representa una forma enzimática no descripta hasta el presente.

Tesis (Doctor en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2016

La fotosensibilidad retinal para medir niveles generales de iluminación es una función antiguamente adquirida en términos evolutivos, y probablemente anterior a la visión formal. La retina es un tejido neuronal sensible a la luz capaz de detectar y transmitir información fótica al cerebro. Aunque su función más conocida es permitir la formación de una imagen representativa del mundo (visión formal), la retina tiene una segunda función, menos conocida pero igualmente importante: funcionar como sensor de la intensidad de luz ambiente, con funciones independientes a la formación de imágenes (NIF, del inglés non image forming). Sabiendo que el ambiente en nuestro mundo es cambiante, la óptima supervivencia de los distintos organismos que habitan la tierra depende de anticiparse a los cambios y adaptar su fisiología acorde a los mismos. Esto es logrado a través de un reloj circadiano central ubicado en el hipotálamo de los vertebrados, en los núcleos supraquiasmáticos. Estos núcleos generan un ritmo de aproximadamente 24 horas que coordina temporalmente distintos ritmos fisiológicos y conductuales. Esta actividad endógena requiere un ajuste diario en su relación con el ciclo de luz solar exterior; y es ésta una de las principales funciones de la visión NIF, además del reflejo pupilar, la regulación del sueño, la supresión aguda de melatonina pineal, etc. Estas funciones son radicalmente diferentes de la visión formal clásica en varios aspectos: 1) la visión formal está mediada directamente por los fotorreceptores ?clásicos?, bastones y conos, mientras que la visión NIF depende principalmente de una población de células ganglionares retinales ?intrínsecamente fotosensibles? (CGRif), 2) estos dos tipos generales de neuronas fotosensibles divergieron en una etapa muy temprana de la evolución; los bastones y conos son fotorreceptores de tipo ?ciliado? que responden a la luz a través de una hidrólisis de GMPc catalizada por una fosfodiesterasa específica, que lleva al cierre de canales de cationes y a la hiperpolarización de las membranas, mientras que las CGRif son receptores de tipo ?rabdomérico? que responden a la luz a través de una vía de señalización lipídica de fosfo-inositoles/diacilglicerol con la apertura de canales de Ca2+ que lleva a la despolarización celular. Las CGRif expresan el fotopigmento Melanopsina (Opn4) que sería responsable de la regulación por luz de tales actividades NIF. Dos tipos de melanopsinas han sido encontradas: Opn4X presente en peces, reptiles, aves y anfibios pero ausente en mamíferos, y un segundo tipo de melanopsina, Opn4m presente en peces, reptiles, aves, anfibios y mamíferos. En el pollo encontramos Opn4X no sólo en las CGRif sino también en CHs (desde estadios tempranos de desarrollo, E15).Es en este contexto que describimos a las Células Horizontales, como posibles fotorreceptores. A fin de estudiar su potencial fotosensibilidad y el rol de Opn4X en estas células desarrollamos un método de cultivo primario de CHs. Posteriormente caracterizamos estos cultivos por diversas metodologías.En una segunda etapa nos propusimos determinar la posible fotosensibilidad intrínseca de estas células, y además, la implicancia de Melanopsina X en la misma. Para ello realizamos estudios con una sonda sensible a Ca+2, Fluo4 AM. Comprobamos fehacientemente que las CHs responden a la luz, y mediante la utilización de distintos inhibidores, pudimos proponer a varios de los componentes que participan en la fotocascada.Finalmente, habiendo cumplimentado una descripción mecanística, buscamos acercarnos a proponer el nuevo posible rol fisiológico de estas células, mediante [3H] GABA, pudimos comprobar que las CHs en cultivo liberan GABA como respuesta a un estímulo lumínico.El conjunto de experimentos realizados en la tesis nos permite asegurar que las CHs responden intrínsecamente a la luz y podrían, además de cumplir con las funciones clásicamente reportadas para estas células de inhibición lateral, contribuir al circuito no visual. Muchas inquietudes surgen a partir de estos resultados, pero lo que es seguro es que el circuito retinal en aves, y específicamente la retina interna, presenta un nivel de complejidad y sofisticación mayor al ya conocido.

El Potato virus X (PVX) es un virus de plantas, miembro tipo del género Potexvirus. Su genoma está compuesto por una única molécula de ARN que codifica una replicasa viral, tres proteínas de movimiento (MPs: TGBp1, TGBp2 y TGBp3) y la proteína de la cápside (CP). La proteína TGBp1 es una proteína multifuncional requerida para el movimiento viral de célula a célula en la planta hospedera. Diferentes líneas de investigación sugieren que la fosforilación de las proteínas virales puede regular la replicación y el movimiento viral. En este estudio, se demostró que la proteína TGBp1 es fosforilada por al menos una proteína quinasa, presente en extractos de plantas de Nicotiana tabacum infectadas con PVX y no infectadas, que posee características distintivas de la caseína quinasa 2 (CK2). El análisis en geles bidimensionales de extractos de plantas infectadas permitió determinar que la proteína TGBp1 producida durante la infección viral presenta múltiples isoformas de diferentes puntos isoeléctricos; el tratamiento con fosfatasas de los extractos de plantas infectadas indicó la presencia de isoformas fosforiladas. A través de la combinación de estudios de determinación de aminoácidos fosforilados por espectrometría de masa, comparación de secuencias aminoacídicas de TGBp1 de distintos virus y evaluación de la fosforilación in vitro de mutantes puntuales y de deleción de la proteína TGBp1, se identificaron tres probables sitios de fosforilación por la quinasa CK2 de N. tabacum: S-165, T-193, T-214. Se observó que la simulación de la fosforilación en los residuos T-193 y T-214 regula negativamente la dispersión viral y la capacidad de la proteína TGBp1 de hidrolizar ATP. Los resultados sugieren firmemente que una proteína quinasa de la familia de CK2 estaría involucrada en la fosforilación de TGBp1 durante el curso de la infección viral de N. tabacum. Además, se discute el modo en que la fosforilación podría regular las actividades de la proteína TGBp1 durante la infección viral.

Se expone el problema y se examinan hechos que constituyen antecedentes, así como la literatura. En la parte experimental se investiga la variación de constitución de los líquidos durante la maceración, observándose como es conocido el aumento de concentración de sólidos, la reducción del contenido de S02 y el aumento de la acidez. Esta se inicia cuando el contenido de S02 deja de ser inhibitorio de la multiplicación de bacterias lácticas termofílicas. La acidez máxima titulable (pH 8,3), proveniente del ácido láctico y de substancias acídicas del propio maíz, depende del tipo de maceración. Es verosímil que en un determinado tipo de maceración la acidez máxima sea la limitante de la propia fermentación láctica o del contenido de azúcares fermentescibles. La flora observada es del tipo láctico y puede ser definida — como unibacteriana. Hay cierta diferencia entre las cepas aisladas pero ella no parece ser suficiente para establecer una diferenciación de especies. Se expone la investigación morfológica de las propiedades bioquímicas de las bacterias del "corn steep" comparativamente con varias otras especies de Lactobacillus. La bacteria láctica pertenece al género Lactobacillus y es del tipo termofílico, es productora de ácido inactivo y no puede ser identificada con ninguna de las bacterias descriptas y reconocidas como especies en el Bergey's Manual of Determinative — Bacteriology, 6a. edición del año 1948. Tiene exigencias nutritivas muy peculiares y cultiva mal en los medios de uso habitual para bacterias lácticas. Se describe un medio de cultivo adecuado, el cual es también excelente para las demás especies de Lactobacillus.

Las neoplasias de la glándula mamaria representan el tumor más frecuente en perras enteras, siendo la edad media de aparición entre los 8 y 10 años. Las hormonas esteroides sexuales, principalmente estrógenos y progesterona, representan el principal factor de riesgo para su desarrollo, y la castración antes del segundo celo reduce el riesgo de aparición de esta neoplasia. Se ha demostrado la presencia de receptores a estrógenos (RE) y progesterona (RP) en los tumores mamarios caninos, siendo esta expresión mayor en tumores benignos comparada con tumores malignos. Sin embargo, la asociación de los RE y RP con factores clínico - patológicos, así como su valor pronóstico, se encuentran en discusión. Por otra parte, algunos estudios en humanos han revelado que además de las clásicas hormonas sexuales, otras hormonas parecen estar involucradas en el desarrollo y/o progresión de esta neoplasia. Así, se ha demostrado la presencia de los péptidos oxitocina y vasopresina, así como de sus receptores en líneas celulares de cáncer mamario humano y en carcinomas primarios de mama humanos. En la perra, al momento se desconoce la presencia de receptores a estas hormonas en los tumores mamarios caninos. La extirpación quirúrgica del tumor representa el tratamiento de elección para todas aquellas perras con neoplasias mamarias. Sin embargo, existe un elevado número de pacientes en los que la cirugía no es suficiente para lograr la curación, o pacientes en los que la realización de la cirugía no es posible, por lo que se hace necesaria la búsqueda de terapias adyuvantes a la cirugía o paliativas. Trabajos sobre líneas celulares de cáncer mamario humano, así como estudios in vivo sobre modelos murinos de cáncer mamario, han demostrado que la oxitocina y la desmopresina (análogo sintético de la hormona vasopresina) tienen la capacidad de modular el crecimiento de las células tumorales. En la perra, al momento se desconocen los efectos de estos péptidos sobre líneas de cáncer mamario canino. Por lo tanto, la presente tesis de doctorado tuvo como objetivo general aportar conocimientos acerca de la influencia del componente hormonal sobre el desarrollo de los tumores mamarios caninos, mediante el estudio de la población de receptores a hormonas esteroideas, oxitocina y vasopresina en el tejido mamario tumoral canino y la evaluación de los posibles efectos antitumorales de péptidos en una línea celular de cáncer mamario canino. En la primera parte de la tesis doctoral se realizó una caracterización clínica y patológica de los tumores mamarios caninos recolectados. El estudio reveló una edad promedio de aparición de esta neoplasia de 9,4 años, indicando que ocurre mayormente en perras de edad media a adulta. Asimismo, la mayor parte de las perras se encontraban enteras al momento del diagnóstico, lo cual brinda mayor sustento al rol fundamental que tienen las hormonas esteroides sexuales en el desarrollo de los tumores mamarios. El análisis histológico mostró que el 60% de las neoplasias fue de naturaleza maligna, siendo el carcinoma túbulo-papilar el más frecuentemente diagnosticado. El restante 40% de los tumores fue de naturaleza benigna, siendo el adenoma (simple y complejo) el tipo más comúnmente hallado. El estudio inmunohistoquímico del receptor a estrógenos α (REα) permitió visualizar una mayor expresión en tumores benignos en comparación con malignos. Asimismo, en el grupo de tumores malignos, se observó una mayor expresión en carcinomas del tipo túbulo-papilar, así como en carcinomas de Grado Histológico de Malignidad (GHM) I. Estos resultados dan mayor sustento a la hipótesis de que la presencia del REα se pierde conforme el tumor progresa hacia la malignidad, y que su expresión en tumores malignos se relaciona con características de baja malignidad tumoral. También se estudió la expresión del receptor a estrógenos β (REβ), observándose que su expresión ocurrió de manera similar tanto en tumores mamarios benignos como malignos. Dado que no se observó asociación alguna con los factores de valor pronóstico analizados para tumores malignos, en la presente tesis no se pudo establecer su rol en las neoplasias mamarias en caninos. Además, se estudió la presencia del RP en tumores mamarios benignos y malignos, observándose una baja expresión en ambos tipos tumorales. Cuando se evaluó su asociación con los factores clínico-patológicos, se observó una mayor expresión del RP en perras que se encontraban en estadíos clínicos IV y V, permitiendo sugerir que los agentes antiprogestágenos podrían ser de utilidad en casos de cáncer mamario avanzado. Por otro lado, en la segunda parte de la presente tesis se demostró la presencia del receptor a oxitocina (ROT) en los tumores mamarios caninos analizados, hallazgo que representa el primer reporte acerca de la expresión de este receptor en esta neoplasia en la especia canina. El ROT se expresó tanto en tumores benignos como malignos, y en estos últimos, su expresión fue mayor en carcinomas de GHM I y II, y tendió a ser mayor en los tumores malignos positivos para el REα. Sin bien se necesitan mayores estudios al respecto, se podría especular que, al igual que ocurre con otros receptores a hormonas, la presencia del ROT en el tumor estaría asociada con factores indicadores de buen pronóstico. Del mismo modo, los resultados del estudio inmunohistoquímico para el receptor a vasopresina V2 (RAVP V2) revelaron que el total de los tumores mamarios caninos analizados resultaron positivos a este receptor, siendo su expresión elevada en todos los casos. Para nuestro conocimiento, esta es la primera vez que se reporta la presencia de este receptor en las neoplasias mamarias en caninos, y reviste importancia a la hora de utilizar moléculas como la desmopresina, con efectos antitumorales y antimetastásicos conocidos, cuyas acciones se ejercen a través del RAVP V2. Considerando la necesidad de investigar nuevas y más eficaces alternativas terapéuticas para el tratamiento de los tumores mamarios en caninos, en la tercera parte de la presente tesis se evaluó la capacidad antitumoral de los péptidos oxitocina y desmopresina sobre una línea celular de cáncer mamario canino. De forma previa a la realización de los ensayos in vitro, se evaluó la presencia del receptor a oxitocina y vasopresina V2 en la línea celular CMT-U27 de cáncer mamario canino, ya que son los sitios de unión para ejercer su acción que utilizan la oxitocina y la desmopresina, respectivamente. Las células tumorales mostraron expresión para ambos receptores, lo cual demuestra que esta línea celular es óptima para evaluar el efecto de estos péptidos. En el ensayo in vitro se observó que la administración de oxitocina a dosis 1000 nM inhibió la proliferación de la línea CMT-U27, lo cual coincide con reportes previos en humanos, y permite sugerir que esta hormona ejerce efectos moduladores del crecimiento de las células tumorales. Por último, se demostró que la desmopresina (1000 nM) ejerció un efecto inhibidor del crecimiento de la línea celular CMT-U27. Por tanto, la observación de una alta expresión del ROT y RAVP V2 en los tumores mamarios caninos, sumado al efecto antiproliferativo que ejercieron la oxitocina y desmopresina en una línea celular de cáncer mamario canino, permiten recomendar que se considere a estos compuestos como una opción interesante para el tratamiento de los tumores mamarios caninos, y resulta de utilidad para continuar investigando péptidos análogos a ellos con mayor capacidad antiproliferativa.