Catálogo de publicaciones

Fil:Vazquez, Mónica Hebe. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

- Se detalla un método enzimático para la obtención de PBG. - Se describen los métodos de aislamiento y purificación de "Porfobilinogenasa", que logró purificarse 110 veces, de "Porfobilinógeno Deaminasa", purificada 310 veces y de "Uroporfirinógeno III Cosintetasa", que se obtuvo libre de "PBG-D". - Las enzimas fueron igualmente activas en anaerobiosis y en aerobiosis. - Tanto la "PBG-asa" como la "PBG-D" presentaron un pH óptimo a 7,4 en buffer Tris-ClH 0,05 M, observándose que con "PBG-asa" menos purificada si bien la formación total de porfirinógenos fué inferior a pH más ácidos o alcalinos, se estimuló el porcentaje de Urógeno III, indicando o bien una menos sensibilidad de la fracción "I" a variaciones de pH, respecto a la fracción "PBG-D" o que se favorecería cierto estado de asociación-disociación entre subunidades necesario para una mayor actividad. - Las formaciones de Urógeno fueron función lineal tanto en la concentración de "PBG-asa" como de "PBG-D" así como del tiempo; además el agregado de "I" a un sistema con "PBG-D" no varió la velocidad de formación de Urógenos, ni los Urógenos totales, sólo modificó el tipo isomérico. - En gel de almidón, a distinto pH, las tres fracciones se comportaron como entidades proteicas únicas, siendo casi idénticas las movilidades electroforéticas de "PBG-asa" y "PBG-D" en tanto que la de "I" fué relativamente mucho mayor. - Se determinó un P.M. de 40.000 para "PBG-D", 50.000 ± 5.000 para "PBG-asa" y 210.000 ± 21.000 para "I" aunque disminuyendo la fuerza iónica del medio lograron determinarse en este último caso un P.M. 70.000 ± 7.000 y aún menor, indicando que estaría formada por subunidades. - La diálisis prolongada contra agua destiladda mantuvo casi intacta la actividad de "PBG-D" en tanto que convirtió la actividad de "PBG-asa" en "PBG-D" y precipitó la fracción "I". - Por ultrafiltración la "PBG-asa" demostró la presencia de un factor débilmente unido a la enzima y necesario para su actividad. - La "PBG-D" fué estable a calentamientos prolongados a 70°C, pero a esa temperatura se inactiva la "I"; la adición de PBG protegió a ésta última de la inactivación por calor, efecto también ejercido en parte por la "PBG-D" e "I", y además que el PBG se uniría a la fracción "I", explicando así su protección, sugiriendo además ésto, una unión del PBG o el intermediario polipirrólico a la fracción "I" durante la catálisis. - Por calentamiento a tiempos breves se obtuvo una marcada estimulación de la actividad de "PBG-asa" y se sugiere que es debida a la destrucción de un inhibidor termolábil fuertemente unido a la enzima. - Las "PBG-asa" y "PBG-D" se comportaron como enzimas sulfhidrílicas. - Se postula que la formación de Urógenos se produciría en dos etapas, en la segunda intervendrían los -SH y sería la más sensible a los iones amonio. - El efecto estimulante de varios cationes, se atribuyó a un posible fenómeno de asociación-disociación de las enzimas. - Se postuló la unión del PBG a la "PBG-D" por sus restos carboxilatos en base a inhibiciones producidas por varios diácidos. - La "PBG-D" presentó una cinética "Michaeliana", con un Km aparente de 5 x 10^(-6) M y fué inhibida no competitivamente por iones amonio, presentando un Ki = 0,172 M. - La "PBG-asa" presentó una curva de saturación sigmoidea, con una [S0,5] que osciló entre 10-14^(-6) M y un "n" de Hill igual a 2. El perfil de la curva se convirtió en hiperbólico por presencia de iones amonio que transformaron además la actividad de "PBG-asa" en actividad de "PBG-D" variando la [S0,5] a 5 x 10^(-6) M y el "n" = 1, los resultados también obtenidos por diálisis y contra agua destilada y por calentamiento. - Los iones metil, dimetil y trimetil amonio inhibieron la "PBG-asa" en forma similar al ión amonio. - Los nucleótidos de adenina inhibieron a 10^(-2) M en tanto que mostraron ligera activación entre 10^(-3) y 10^(-4) M. - ATP y ADP a concentraciones que inhibieron la formación de Urógeno III modificaron el perfil de la curva de saturación de sigmoideo a hiperbólico, disminuyendo la [S0,5] y tendiendo el "n" de Hill a 1. - Se postula que la "PBG-asa" se comportaría como una enzima alostérica y tendría al menos dos sitios activos que interactuarían positivamente y que los nucleótidos ADP y ATP actuarían como efectores alostéricos.

Fil:Rossetti, María Victoria. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Fil:Stella de Rosellini, Ana María Cristina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Fil:Correa García, Susana Raquel. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Los resultados obtenidos al estudiar el posible rol fisiológico y las propiedades cinéticas y estructurales de la enzima málica dependiente de NADP purificada de trigo sugieren la existencia de una única isoforma de 72 kDa en los tejidos de esta especie C3. Esta enzima fue purificada a homogeneidad a partir de tallos y raíces de trigo y con ella se realizaron estudios cinéticos. La enzima no presenta histéresis. Los valores obtenidos de pH óptimo coinciden con los anteriormente descriptos para otras enzimas de plantas C3 y CAM y difieren con el comportamiento de la enzima de plantas C4. La actividad enzimática fue absolutamente dependiente de la presencia de un catión bivalente (Mg2+ o Mn2+), mostrando cinéticas de saturación no hiperbólicas como sucede con la EM-NADP de plantas C4. Por otra parte, las curvas de saturación obtenidas en función da la concentración de NADP y L-malato fueron hiperbólicas. La actividad de EM-NADP fue inducida por tratamiento con celulasa macerosima y glutatión, y este aumento fue asociado con aumentos de proteína determinado a partir de Western blots. Estos resultados sugieren que la EM-NADP de plantas C3 podría estar involucrada en la biosíntesis de lignina relacionada con respuestas de defensa de la planta, proveyendo de NADPH a los dos pasos dependientes de NADPH de la biosíntesis de monolignol. Las EM-NADP de maíz y de trigo se disocian en un medio acidico y bajas temperaturas de manera secuencial siguiendo el orden T-D-M. Las entalpías para los equilibrios fueron negativas, pero el proceso total provoco un cambio de energía libre estándar positiva siendo la entropía del sistema un factor importante en ambos equilibrios. La presencia de Mg2+, NADP y L-malato modifican los equilibrios entre M, D y T dependiendo de la fuente enzimática. El catión indujo la agregación de ambas enzimas hacia la forma tetramerica, mientras que el L-malato no modifico el estado oligomérico de la EM-NADP de ambas fuentes. El NADP no cambio el estado multimérico de la enzima de maíz aunque la enzima de trigo se asoció en presencia de la coenzima. Por último, el glicerol estabilizo la forma tetramerica en ambos sistemas, mientras que un aumento en la fuerza iónica favoreció la disociación de la estructura oligomérica de la EM-NADP. Estos resultados favorecen la idea de que la EM-NADP de maíz y de trigo existiría en varios estados oligoméricos (M, D y T) in vivo y que este proceso de asociación-disociación podría estar mediada por la concentración de metabolitos en el medio, condiciones de luz, fuerza iónica y el pH. La actividad de la enzima málica dependiente de NADP fue inducida por radiación UV-B, al igual que el contenido proteico y el ARNm a casi el mismo nivel que por altos niveles de luz blanca dependiendo de la intensidad de la luz y la duración del tratamiento. El efecto de la radiación UV-B fue también eficaz cuando se administraron pequeñas dosis de UV-B seguidas por un tratamiento de oscuridad. La luz roja fue efectiva en la inducción de EM-NADP, de manera similar a la radiación UV-B, administrada tanto en forma continua como por periodos cortos. Nuestros resultados también muestran también que luego de una exposición corta bajo luz roja lejana aplicada inmediatamente después de los pulsos de luz UV-B o roja el efecto inductivo sobre la enzima málica se reduce significativamente, y el efecto de la luz roja lejana se revierte por un pulso final con luz roja o UV-B. De esta manera proponemos que elevados niveles de EM-NADP podrían proveer a las plantas con mayor cantidad de poder reductor para reparar a la célula y además aumentar el contenido de piruvato y NADPH para la respiración mitocondrial. Las especies C3 de Flaveria poseen baja actividad de EM-NADP, que es principalmente atribuida a la forma de mayor masa molecular de la enzima, mientras que las especies C4 de Flaveria poseen muy altas actividades de EM-NADP en hojas atribuible a la presencia en forma mayoritaria de la isoforma de baja masa molecular. La isoforma de mayor masa molecular en las especies de Flaveria C3 parece poseer una mayor Km para el NADP que la forma de menor masa molecular de las especies de Flaveria C4. Los Western blots realizados con extractos proteicos de hojas de distintas especies C3 muestran que la banda inmunoreactiva mayoritaria es el monómero de 72 kDa y presenta bajos niveles de las formas de menor masa molecular (62 y 64 kDa), mientras que las especies de Flaveria C4 muestran una banda muy reactiva de 62 kDa de la EM-NADP, y bandas menores de 64 y 72 kDa. En las especies C3 y C4 existen hasta tres formas monoméricas de la enzima de 62, 64 y 72 kDa, y la cantidad relativa de cada forma puede variar entre los intermediarios. En hojas de especies similares a C4, existen dos bandas predominantes (62 y 64 kDa), estando la forma de 72 kDa presente en muy bajos niveles. En conjunto, todos estos resultados demuestran la presencia de 3 isoformas de la EM-NADP con diferentes masas moleculares en Flaveria, un aumento en la expresión de las forma de 64 kDa desde las especies C3 hasta las similares a C4, y un aumento en la expresión de la forma de 62 kDa y una disminución de la expresión de la forma de 72 kDa desde las especies C3 hasta las C3-C4, similar a C4 y las C4. La EM-NADP se localiza principalmente en los cloroplastos, tanto en células mesofilicas de las plantas C3 y en ambos tipos de células fotosintéticas en las otras especies siendo mayoritaria la marca en células de la vaina vascular en las especies C4. En especies intermedias, la marca mayoritaria se encontró en los cloroplastos de la vaina vascular mientras que una marca significativa también se observó en cloroplastos mesofilicos. Se observaron tres formas activas de la EM-NADP en hojas de la especie intermediaria C3-C4 F. floridana que se diferencian por masa molecular y puntos isoeléctricos nativos. La EM-NADP se encuentra parcialmente compartamentalizada en los distintos tipos de células fotosintéticas, obteniéndose una mayor actividad específica y una mayor expresión de las formas de 64 y 62 kDa en la fracción correspondiente a los cloroplastos de la vaina vascular. La forma purificada de 62 kDa presenta propiedades cinéticas intermedias entre las enzimas málicas de plantas C3 y C4. La enzima exhibe un máximo de actividad a pH 7,5 de manera similar a lo observado con otras enzimas de plantas C3 y CAM y difiriendo con el comportamiento de la enzima de plantas C4. La actividad enzimática depende de la presencia de un catión bivalente (Mg2+ o Mn2+). Las cinéticas de saturación obtenidas para NADP y L-malato fueron hiperbólicas y no se observó inhibición por L-malato a pH 7,0, difiriendo al comportamiento de plantas C4 e indicando que la enzima presenta características intermedias. En resumen, la forma purificada representa una forma enzimática no descripta hasta el presente.

Tesis (Doctor en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2016

La fotosensibilidad retinal para medir niveles generales de iluminación es una función antiguamente adquirida en términos evolutivos, y probablemente anterior a la visión formal. La retina es un tejido neuronal sensible a la luz capaz de detectar y transmitir información fótica al cerebro. Aunque su función más conocida es permitir la formación de una imagen representativa del mundo (visión formal), la retina tiene una segunda función, menos conocida pero igualmente importante: funcionar como sensor de la intensidad de luz ambiente, con funciones independientes a la formación de imágenes (NIF, del inglés non image forming). Sabiendo que el ambiente en nuestro mundo es cambiante, la óptima supervivencia de los distintos organismos que habitan la tierra depende de anticiparse a los cambios y adaptar su fisiología acorde a los mismos. Esto es logrado a través de un reloj circadiano central ubicado en el hipotálamo de los vertebrados, en los núcleos supraquiasmáticos. Estos núcleos generan un ritmo de aproximadamente 24 horas que coordina temporalmente distintos ritmos fisiológicos y conductuales. Esta actividad endógena requiere un ajuste diario en su relación con el ciclo de luz solar exterior; y es ésta una de las principales funciones de la visión NIF, además del reflejo pupilar, la regulación del sueño, la supresión aguda de melatonina pineal, etc. Estas funciones son radicalmente diferentes de la visión formal clásica en varios aspectos: 1) la visión formal está mediada directamente por los fotorreceptores ?clásicos?, bastones y conos, mientras que la visión NIF depende principalmente de una población de células ganglionares retinales ?intrínsecamente fotosensibles? (CGRif), 2) estos dos tipos generales de neuronas fotosensibles divergieron en una etapa muy temprana de la evolución; los bastones y conos son fotorreceptores de tipo ?ciliado? que responden a la luz a través de una hidrólisis de GMPc catalizada por una fosfodiesterasa específica, que lleva al cierre de canales de cationes y a la hiperpolarización de las membranas, mientras que las CGRif son receptores de tipo ?rabdomérico? que responden a la luz a través de una vía de señalización lipídica de fosfo-inositoles/diacilglicerol con la apertura de canales de Ca2+ que lleva a la despolarización celular. Las CGRif expresan el fotopigmento Melanopsina (Opn4) que sería responsable de la regulación por luz de tales actividades NIF. Dos tipos de melanopsinas han sido encontradas: Opn4X presente en peces, reptiles, aves y anfibios pero ausente en mamíferos, y un segundo tipo de melanopsina, Opn4m presente en peces, reptiles, aves, anfibios y mamíferos. En el pollo encontramos Opn4X no sólo en las CGRif sino también en CHs (desde estadios tempranos de desarrollo, E15).Es en este contexto que describimos a las Células Horizontales, como posibles fotorreceptores. A fin de estudiar su potencial fotosensibilidad y el rol de Opn4X en estas células desarrollamos un método de cultivo primario de CHs. Posteriormente caracterizamos estos cultivos por diversas metodologías.En una segunda etapa nos propusimos determinar la posible fotosensibilidad intrínseca de estas células, y además, la implicancia de Melanopsina X en la misma. Para ello realizamos estudios con una sonda sensible a Ca+2, Fluo4 AM. Comprobamos fehacientemente que las CHs responden a la luz, y mediante la utilización de distintos inhibidores, pudimos proponer a varios de los componentes que participan en la fotocascada.Finalmente, habiendo cumplimentado una descripción mecanística, buscamos acercarnos a proponer el nuevo posible rol fisiológico de estas células, mediante [3H] GABA, pudimos comprobar que las CHs en cultivo liberan GABA como respuesta a un estímulo lumínico.El conjunto de experimentos realizados en la tesis nos permite asegurar que las CHs responden intrínsecamente a la luz y podrían, además de cumplir con las funciones clásicamente reportadas para estas células de inhibición lateral, contribuir al circuito no visual. Muchas inquietudes surgen a partir de estos resultados, pero lo que es seguro es que el circuito retinal en aves, y específicamente la retina interna, presenta un nivel de complejidad y sofisticación mayor al ya conocido.

El Potato virus X (PVX) es un virus de plantas, miembro tipo del género Potexvirus. Su genoma está compuesto por una única molécula de ARN que codifica una replicasa viral, tres proteínas de movimiento (MPs: TGBp1, TGBp2 y TGBp3) y la proteína de la cápside (CP). La proteína TGBp1 es una proteína multifuncional requerida para el movimiento viral de célula a célula en la planta hospedera. Diferentes líneas de investigación sugieren que la fosforilación de las proteínas virales puede regular la replicación y el movimiento viral. En este estudio, se demostró que la proteína TGBp1 es fosforilada por al menos una proteína quinasa, presente en extractos de plantas de Nicotiana tabacum infectadas con PVX y no infectadas, que posee características distintivas de la caseína quinasa 2 (CK2). El análisis en geles bidimensionales de extractos de plantas infectadas permitió determinar que la proteína TGBp1 producida durante la infección viral presenta múltiples isoformas de diferentes puntos isoeléctricos; el tratamiento con fosfatasas de los extractos de plantas infectadas indicó la presencia de isoformas fosforiladas. A través de la combinación de estudios de determinación de aminoácidos fosforilados por espectrometría de masa, comparación de secuencias aminoacídicas de TGBp1 de distintos virus y evaluación de la fosforilación in vitro de mutantes puntuales y de deleción de la proteína TGBp1, se identificaron tres probables sitios de fosforilación por la quinasa CK2 de N. tabacum: S-165, T-193, T-214. Se observó que la simulación de la fosforilación en los residuos T-193 y T-214 regula negativamente la dispersión viral y la capacidad de la proteína TGBp1 de hidrolizar ATP. Los resultados sugieren firmemente que una proteína quinasa de la familia de CK2 estaría involucrada en la fosforilación de TGBp1 durante el curso de la infección viral de N. tabacum. Además, se discute el modo en que la fosforilación podría regular las actividades de la proteína TGBp1 durante la infección viral.