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Fusarium graminearum es considerado el principal agente causal de la Fusariosis de la espiga de trigo (FET) en Argentina. Se trata de una enfermedad de infección floral, que se presenta esporádicamente y es dependiente de las condiciones ambientales; especialmente de la alta humedad relativa y de las temperaturas medias. Produce pérdidas de rendimiento y también afecta la calidad comercial y panadera, por la presencia de micotoxinas, fundamentalmente tricotecenos del tipo B. En este estudio se evaluó una población de 120 RILs, 2 parentales (ProINTA Granar y BioINTA 1005) y 4 testigos (2 susceptibles y 2 moderadamente resistentes a la FET) en 3 ambientes diferentes de evaluación. Para generar la infección en las espigas se empleó una mezcla de 9 cepas de F. graminearum con efectivas patogenicidad y agresividad. Los individuos fueron caracterizados según los distintos tipos de resistencia genética (Tipo I y Tipo II). En invernáculo se registraron los valores de severidad en 4 momentos (7, 14, 21 y 28 días después de la inoculación) para poder calcular los valores de área bajo la curva del progreso de la enfermedad. A partir de los análisis estadísticos de Conglomerado y ANOVA se pudo identificar líneas con distintos niveles de resistencia, permitiendo seleccionar líneas de interés en las cuales los granos producidos se les realizaron determinaciones por cromatografía gaseosa (CG) para evaluar las concentraciones de micotoxinas. Mediante el estudio por electroforesis de SDS-PAGE se analizó la segregación de las subunidades de las gluteninas de alto peso molecular (GAMP) y se utilizó el software GelAnalyzer2010 para estudiar la relación entre la señal de las bandas proteicas de las subunidades de GAPM y los niveles de infección de la enfermedad en las espigas. A través de la técnica de cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC) se midieron los picos proteicos de la GAMP en muestras que presentaban valores contrastante para los niveles de severidad de las espigas y la producción de micotoxinas en granos. Finalmente, los estudios realizados permitieron identificar un grupo de líneas moderadamente resistentes a la FET, donde algunas de ellas se destacaron en sus perfiles proteicos demostrando tener una buena calidad de grano.

El locus multialélico Ahasl1 determina el nivel de resistencia/susceptibilidad a herbicidas inhibidores de la enzima acetohidroxiácido sintasa (AHAS) en girasol. Recientemente se ha encontrado un alelo que confiere resistencia cruzada a distintas familias químicas de inhibidores de AHAS: imidazolinonas (IMI), sulfonilureas (SU), triazolopirimidinas (TP) y pirimidiniltio (u oxi) benzoatos (POB), denominado Ahasl1-4, que se corresponde con la sustitución Trp574Leu. La evaluación en las etapas de germinación y la caracterización bioquímica de Ahasl1-4, así como las relaciones de dominancia con otros alelos del locus Ahasl1 no se han realizado hasta el momento. Los objetivos de este trabajo fueron caracterizar el crecimiento de plántulas y la actividad enzimática AHAS en respuesta a los herbicidas imazapir y metsulfurón metil de genotipos de girasol que portan diferentes combinaciones de los alelos Ahasl1-1, Ahasl1-4 y ahasl1 y determinar las relaciones de dominancia entre los alelos mencionados en respuesta a diferentes concentraciones de imazapir y metsulfurón metil. Dentro de los ensayos de germinación, en presencia del herbicida imazapir, los genotipos Ahasl1-4/Ahasl1-4 y Ahasl1-1/Ahasl1-4 presentaron los mayores valores de GR50 para las variables longitud de raíz principal (LP), longitud de raíz principal con raíces laterales mayores a 5 mm (LPb), longitud de raíz lateral más larga (LL), área foliar total (AF) y longitud promedio del primer par de hojas (LF), hasta 6000 veces superior al genotipo susceptible ahasl1/ahasl1 y hasta 15 veces superior al genotipo Ahasl1-1/Ahasl1-1 que confiere resistencia sólo a IMI. Al realizar la comparación dentro de cada variable y entre los genotipos evaluados se encontraron diferencias significativas excepto al comparar los genotipos Ahasl1-4/Ahasl1-4 y Ahasl1-1/Ahasl1-4. Con el herbicida metsulfurón metil se observó que los genotipos que portaban al menos un alelo Ahasl1-4 presentaron los mayores GR50 dentro de las variables radicales evaluadas. Sin embargo, dentro de las variables foliares el genotipo Ahasl1-4/Ahasl1-4 mostró un GR50 seis veces superior para área foliar total y cuatro veces superior para longitud promedio del primer par de hojas respecto al genotipo Ahasl1-1/Ahasl1-4. A nivel de actividad enzimática, con ambos herbicidas, el genotipo Ahasl1-4/Ahasl1-4 presentó el mayor valor de I50 y en la comparación con el resto de los genotipos las diferencias fueron significativas. Respecto a las relaciones de dominancia, tomando dos alelos, tanto para resistencia a imazapir como a metsulfurón metil, las mismas varían desde sobredominancia a recesividad dentro de cada variable evaluada y concentración de herbicida aplicada. En base 2 a los resultados obtenidos se concluye que el alelo Ahasl1-4 confiere resistencia al herbicida metsulfurón metil y resistencia superior a la conferida por el alelo Ahasl1-1 al herbicida imazapir y que la relación de dominancia entre dos alelos puede variar dependiendo del tipo de herbicida presente, de la concentración de herbicida y de la variable evaluada.

El tizón común (TC) es una enfermedad foliar del cultivo del maíz causada por el patógeno fúngico hemibiótrofo Exserohilum turcicum, que puede provocar pérdidas de rendimiento de más del 50 por ciento, disminución en la calidad del grano y una mayor predisposición a pudriciones de tallo. Disponer de información sobre fuentes genéticas de resistencia al TC en materiales públicos adaptados a la región productiva de nuestro país sería de gran valor para el mejoramiento de la resistencia a la enfermedad. El objetivo de este proyecto fue caracterizar la variabilidad fenotípica y genética para el comportamiento frente al TC de un panel diverso de 216 líneas endocriadas desarrolladas por el programa de Mejoramiento de Maíz Templado de la EEA INTA Pergamino. Las líneas fueron genotipadas con 56.110 SPPs y su respuesta frente al TC (RTC) fue evaluada con una escala de 1 (muy resitente) a 9 (muy susceptible) en ensayos a campo, bajo inoculación artificial con el patógeno, en cuatro ambientes durante los ciclos agrícolas 2014/15 y 2015/16. La aplicación de diversas técnicas multivariadas en base a la información genotípica permitió identificar dos niveles de estructura poblacional en el panel estudiado: un nivel de estructura primaria de tres subgrupos, del que deriva un segundo nivel con nueve subgrupos. La caída del desequilibrio de ligamentos fue de 1.397.492 pb, sugiriendo buena potencia para estudios de mapeo por asociación (MA) utilizando esta información genotípica. El rango de la variación en los valores de RTC observados indican que la presión del patógeno en todas ellas fue discriminante y que la variabilidad fenotípica para el carácter en el panel de líneas estudiado fue alta. Los coeficientes de correlación de Pearson para la RTC entre pares de ambientes presentaron valores altos (>0,8) y fueron estadísticamente significativos en todos los casos (p<0,001), señalando consistencia en la RTC de las líneas evaluadas a través de los ambientes. La heredabilidad en sentido amplio para la RTC a través de los ambientes calculada a partir de las variancias resultantes de la implementación de un modelo lineal mixto fue de 0,96. Las variancias resultantes del modelo fueron 75,5 % 0,5 %, 3,9 % y 19,9 % del total de la variación observada para los efectos de genotipos, ambiente, interacción genotipo por ambiente y error experimental, respectivamente. El efecto de la interacción genotipo por ambiente fue estadísticamente significativo (p<0,001). La media ajustada para la RTC (RTCaj) a través de ambientes, calculada a partir de los BLUPs resultantes del modelo, presentó una distribución continua y osciló entre 1,25 y 7,34, demostrando una extensa variabilidad genética para el carácter en el panel de líneas estudiado. Treinta dos líneas mostraron un excelente comportamiento frente a la enfermedad, con RTCaj por debajo de 3. Las diferencias en la RTCaj a través de ambientes entre los subgrupos establecidos mediante el análisis de estructura poblacional fueron estadísticamente significativas (p<0.001). Mediante el análisis de MA se identificaron 91 SNPs a lo largo de los 10 cromosomas que presentaron asociaciones significativas (p<0,001) con la RTCaj a través de ambientes, para un ambiente individual o simultáneamente con dos o más de estas variables. Estos 91 SNPs fueron agrupados en 59 QTL, de los cuales 16 fueron identificados como estables por ser detectados para la RTCaj través de ambientes y para dos o más ambientes. Los valores de efecto de sustitución alélica absoluto para estos 16 QTL fueron de 0,85 a 2,01. Doce de estos 16 QTL se ubican en posiciones que se superponen con regiones cromosómicas reportadas para QTL y genes mayores identificados en estudios previos de mapeo por ligamiento o MA para la RTC, mientras que las regiones cromosómicas asociadas a los QTL que hemos denominado qTC 7.02.1, qTC 8.03.3, qTC 8.03.5 y qTC 10.04.1 estarían siendo reportadas por primera vez en el presente trabajo. Un estudio más exhaustivo será necesario para determinar los genes candidatos asociados a estos QTL. Al analizar los estados alélicos para los 16 QTL mencionados anteriormente, hemos observado que las líneas evaluadas fueron un mosaico de loci de susceptibiliad y resitencia. La implemetación de técnicas como la selección asistida por marcadores o la retrocruza asistida por marcadores para la selección indirecta de estos QTL en poblaciones segregantes o durante introgresión a materiales elite en retrocruzas presenta un gran potencial en la mejora de la resistencia al TC en el germoplasma de la República Argentina, ya sea perteneciente al sector público o privado.

El arroz (Oryza sativa L.) es el cultivo regional más importante del litoral argentino, especialmente en Corrientes y Entre Ríos. La siembra directa y el monocultivo favorecen el desarrollo de enfermedades de tallo y vaina (ETV), principalmente de la Pudrición del Tallo (Sclerotium oryzae) y del complejo de Manchado de Vainas (Rhizoctonia oryzae, R. oryzae-sativae y R. solani). Estos patógenos sobreviven como esclerocios en el suelo. Las herramientas de control existentes son limitadas, porque los genotipos no presentan resistencia genética y los fungicidas disponibles producen un control parcial generando una amenaza ambiental. Un manejo sustentable con herramientas más inocuas es demandado. El objetivo de este trabajo fue caracterizar seis aislamientos nativos de Pseudomonas fluorescentes, con potencial de biocontrol sobre R. oryzae, R. solani y S. oryzae. Los aislamientos fueron caracterizados por producción de metabolitos difusibles, volátiles, HCN, sideróforos y proteasas, como potenciales mecanismos de acción. Posteriormente, fueron identificados a nivel de cepa y especie con técnicas moleculares. Además, se evaluó el efecto de su aplicación sobre la germinación de esclerocios de los patógenos y su aplicación en semillas in vitro. Todos los aislamientos produjeron más de un mecanismo, aunque el aislamiento denominado M1C se destacó por la efectividad de sus metabolitos para biocontrol. Todos fueron identificados como Pseudomonas fluorescens y tres cepas fueron diferenciadas molecularmente. Todas las cepas redujeron entre 80-100% la germinación de esclerocios de R. oryzae, M1C redujo 40% la germinación de esclerocios de S. oryzae y ninguna afectó la germinación de esclerocios de R. solani. Todas disminuyeron el crecimiento de hongos en semillas, sin mejorar el porcentaje de germinación. Por los atributos de la M1C, es propuesta como candidata con potencial biocontrol para investigaciones futuras. Este trabajo brinda información muy valiosa sobre la posibilidad de utilizar a P. fluorescens para el control de ETV, en Argentina

Campylobacter fetus subsp. venerealis y Campylobacter fetus subsp. fetus son agentes causales de la campylobacteriosis genital bovina (CGB), una de las enfermedades reproductivas más importantes en los rodeos bovinos de Argentina. Hasta la actualidad, se han realizado escasos estudios sobre el comportamiento de ambas subespecies de C. fetus en los rodeos bovinos. Lo antedicho, probablemente se deba a que el diagnóstico de rutina de la CGB se realiza por inmunofluorescencia directa (IFD) a partir de muestras de esmegma prepucial por su rapidez, bajo costo, sensibilidad y especificidad, pero sin la identificación microbiológica de las cepas. Además, los conjugados que se emplean en esta técnica, no diferencian entre C. fetus subsp. fetus y C. fetus subsp. venerealis. Por lo tanto, se carece de información sobre la presencia de ambas subespecies a nivel regional. El cultivo microbiológico sigue siendo la técnica de referencia, sin embargo la alta contaminación de algunas muestras clínicas, sumado al costo de un equipamiento adecuado y el tiempo que requiere el cultivo y la posterior caracterización por pruebas bioquímicas, determinan que el diagnóstico microbiológico no se realice en forma rutinaria. En las últimas décadas se han desarrollado y puesto a punto técnicas de biología molecular para optimizar la identificación y la caracterización de C. fetus. La aplicación de nuevas técnicas permitirá complementar los resultados obtenidos por las pruebas tradicionales, caracterizar los perfiles fenotípicos y genotípicos de las cepas, determinar su influencia en la patogenia de la enfermedad, el grado de homología entre ellas y finalmente, contribuir con estudios epidemiológicos que analicen el comportamiento de las cepas en los rodeos a través de los años. El objetivo de la presente tesis doctoral fue caracterizar parámetros fenotípicos y genotípicos de cepas de C. fetus aisladas del tracto reproductor y de abortos bovinos de la provincia de Buenos Aires. El documento se divide en cuatro capítulos, correspondiendo cada uno de los objetivos particulares propuestos. En el Capítulo I se realiza la identificación de las cepas de C. fetus del cepario constituido a partir de los ceparios de C. fetus pertenecientes a los laboratorios de Bacteriología (EEA-INTA Balcarce) y Microbiología Clínica y Experimental de la Facultad de Ciencias Veterinarias (UNCPBA) conformados por primoaislamientos de muestras de esmegma prepucial, mucus cérvico vaginal y abortos, conservados a -80 °C. La identificación de C. fetus se realizó mediante IFD y pruebas bioquímicas convencionales. De un total de 159 aislamientos registrados en ambas instituciones entre los años 1999 y 2014, se seleccionaron 95 cepas indígenas de C. fetus de los ceparios citados. Los criterios de selección considerados fueron: año de aislamiento, muestras clínicas de origen y localización geográfica, los cuales permitieron los estudios de distribución temporal y espacial que se desarrollaron en los capítulos siguientes. Para la identificación bioquímica de género, especie y subespecie bacteriana, las cepas fueron descongeladas y cultivadas. Posteriormente, se realizó la descripción de la morfología de colonias y bacteriana mediante tinciones y observación en fresco por microscopía de campo oscuro. La inmunomarcación de las cepas se realizó por IFD. La identificación de especie y subespecie bacteriana se realizó mediante pruebas bioquímicas de rutina de nuestro laboratorio. Conjuntamente, se utilizó un sistema comercial miniaturizado de identificación para bacterias del género Campylobacter, Arcobacter y Helicobacter de origen humano. La morfología de las colonias y bacteriana de todas las cepas, fueron compatibles con las descriptas para las especies de Campylobacter. La IFD y las pruebas bioquímicas de rutina permitieron clasificar todas las cepas dentro de la especie C. fetus. Por pruebas bioquímicas, se diferenciaron ambas subespecies. La totalidad de las cepas analizapositiva. Las pruebas de producción de SH2 en sustratos sensibilizados y de tolerancia a la glicina, fueron definitorias en la determinación de la subespecie bacteriana y para el biotipo intermedius de C. fetus subsp. venerealis. Por pruebas bioquímicas convencionales, 50 cepas (52,6%) fueron clasificadas como C. fetus subsp. fetus, 40 (42,1%) como C. fetus subsp. venerealis y 5 (5,3%) como C. fetus subsp. venerealis biotipo intermedius. El sistema miniaturizado comercial no permitió la diferenciación de algunas cepas de ambas subespecies: seis cepas (6,3%) no pudieron ser caracterizadas. Sesenta y ocho (76,4%) fueron identificadas como C. fetus subsp. venerealis y 21 (23,6%) clasificadas como C. fetus subsp. venerealis/C. fetus subsp. fetus. Los resultados de la identificación de especie y subespecie bacteriana por pruebas bioquímicas y el sistema comercial, fueron comparables para 89 cepas. Se registraron coincidencias para 32 cepas identificadas como C. fetus subsp. venerealis por ambas metodologías. De las 21 cepas clasificadas como C. fetus subsp. venerealis/C. fetus subsp. fetus por el sistema comercial, 15 se correspondieron con C. fetus subsp. fetus y seis con C. fetus subsp. venerealis por pruebas bioquímicas. La limitante del sistema comercial para identificar cepas de C. fetus subsp. fetus, no permitió comparar los resultados para esta subespecie.das presentaron fluorescencia En el Capítulo II, se caracterizan los parámetros de patogenicidad de C. fetus mediante la capacidad de adherencia y citopatogenicidad. Como modelos de estudio se utilizaron cultivos celulares primarios de útero y vagina bovina y la línea celular MDBK. Las monocapas con semiconfluencia celular, fueron desafiadas con las cepas. Para los cultivos primarios se seleccionaron 35 cepas (13 cepas de C. fetus subsp. venerealis, dos de C. fetus subsp. venerealis biotipo intermedius y 20 de C. fetus subsp. fetus) en base a: el año de aislamiento, la muestra clínica de origen, la localidad geográfica y la subespecie bacteriana. Los cultivos de células MDBK fueron desafiados con la totalidad de las cepas. El inóculo fue establecido en una DO610 de 0,8. La incubación se realizó de acuerdo al objetivo del ensayo: evaluación de la capacidad de adherencia (3 h) y efecto citopatogénico (48-72 h). La adherencia bacteriana se observó por tinción de Giemsa y fueron puestas a punto las técnicas de inmunocitoquímica y microscopía electrónica de barrido para confirmar y caracterizar la adherencia de C. fetus. Se calcularon los indicadores: porcentaje de adherencia a células y número de bacterias adheridas por célula. Para la comparación de los cultivos primarios y células MDBK, las cepas fueron utilizadas como bloques para las variables observadas. El efecto de los cultivos se evaluó mediante un análisis de variancia (ANOVA) con un diseño en bloques. Los resultados permitieron confirmar la capacidad de adherencia de C. fetus a las células uterinas, vaginales y MDBK como así también la aplicabilidad de las técnicas empleadas. El 100% de las cepas fueron adherentes. Los porcentajes de adherencia fueron significativamente mayores para los cultivos primarios en relación a la línea MDBK. Contrariamente, el número de C. fetus por célula fue significativamente mayor para las células MDBK. La aplicación de las técnicas de inmunocitoquímica y microscopía electrónica de barrido permitieron confirmar y caracterizar la adherencia de C. fetus. Para la evaluación del efecto citopatogénico de C. fetus en células uterinas, vaginales bovinas y MDBK, se registraron alteraciones citoplasmáticas, nucleares y muerte celular. Las alteraciones citoplasmáticas fueron evaluadas mediante la observación en fresco y tinción de Giemsa. El coeficiente de distensión celular ((F<1,3) en células desafiadas y controles, se determinó con la aplicación del programa Image Pro. La actividad mitótica y las alteraciones nucleares mediante tinción DAPI. La observación de los cultivos celulares en fresco y por tinción de Giemsa, permitió establecer una secuencia de hallazgos: granulación del citoplasma, vacuolización citoplasmática, redondeamiento y distensión celular, condensación nuclear y muerte celular con desprendimiento de la monocapa. Las alteraciones se observaron en el 100% de las cepas analizadas para ambos cultivos. La distensión celular fue significativamente mayor en cultivos primarios y la citopatogenicidad en células uterinas. La evaluación de la actividad mitótica en los cultivos de células MDBK, permitió identificar los distintos estadios del ciclo celular, con detenimiento en interfase y profase en los cultivos desafiados respecto a los controles. En los núcleos de células MDBK desafiadas con 17 cepas, se registraron modificaciones compatibles con efectos apoptóticos. El desarrollo y la implementación de los modelos de estudio in vitro permitieron profundizar los conocimientos referentes a la adherencia y el efecto citopatogénico de C. fetus, considerando la importancia de los aspectos éticos, económicos, de bienestar animal y de practicidad. Para evaluar la asociación lineal entre los parámetros de patogenicidad de C. fetus en los cultivos celulares, se calculó el coeficiente de correlación de Pearson y de Spearman, utilizando el procedimiento PROC CORR del SAS V9.3 (SAS Institute, Cary, NC, USA). Se consideraron como relevantes aquellas correlaciones ≥ 0,5. El análisis de las correlaciones de los parámetros de patogenicidad evaluados en cultivos primarios y células MDBK, permitió obtener resultados similares por ambos métodos. Las correlaciones entre los parámetros de patogenicidad fueron positivas, significativas y de distinta magnitud. La mayor correlación en los tres cultivos se registró entre el porcentaje de adherencia y de citopatogenicidad. En el Capítulo III se caracterizaron los perfiles moleculares de C. fetus. La caracterización de los perfiles proteicos de las cepas se realizó mediante electroforesis en geles de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE). Los extractos bacterianos de las 95 cepas fueron obtenidos según la metodología de Laemmli (1970). Las corridas se realizaron en un sistema homogéneo en gel de poliacrilamida al 10% (Brooks et al., 1996). Los perfiles moleculares proteicos fueron visualizados por coloración con Coomassie Blue. El análisis proteico se basó en la detección del polipéptido mayor que se correspondería con la microcápsula. Ochenta y siete (91,6%) cepas de C. fetus presentaron bandas del polipéptido mayor con variabilidad de pesos moleculares que se ubicaron en un rango de 100 a 117 kDa. La variabilidad para las cepas de casos intrarodeo fue menor. La tipificación genotípica de las cepas de C. fetus, mediante una reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La puesta a punto, se realizó teniendo en cuenta el protocolo descripto por Schulze et al. (2006) basado en el trabajo de Hum et al. (1997) modificando las condiciones de reacción y termociclado (Henegariu et al., 1997). Se emplearon los primers MG3F - MG4R para la detección de la especie C. fetus y los primers VenSF - VenSR para la diferenciación de la subespecie de C. fetus subsp. venerealis (Hum et al., 1997). A partir de los cultivos puros de las cepas en estudio, se realizaron suspensiones bacterianas con una DO610 0,1. La extracción de ADN se realizó por ebullición. Como controles negativos se utilizaron cepas de C. jejuni, C. coli, C. hyointestinalis, C. bubulus y E. coli. La PCR permitió tipificar la totalidad de las cepas en estudio, dentro de la especie C. fetus y diferenciar ambas subespecies: C. fetus subsp. venerealis 49 (51,6%) y C. fetus subsp. fetus 46 (48,4%). Las cepas de casos intrarodeo fueron tipificadas dentro de la misma subespecie. No se observaron amplificaciones inespecíficas ni resultados positivos para microorganismos estrechamente relacionados. La caracterización y subtipificación de las cepas de C. fetus, se realizó por análisis de polimorfismos genéticos a partir de la aplicación de electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE - SmaI). Para la implementación de la técnica, se seleccionaron 28 cepas en base a los parámetros descriptos anteriormente. Se aplicó el protocolo para la subtipificación molecular de C. jejuni elaborado por el Centro para el Control y la Prevención de las Enfermedades (CDC) en el marco de la Red PulseNet América Latina y el Caribe para la subtipificación de Campylobacter spp. La interpretación de los resultados se realizó de acuerdo a lo descripto por Tenover et al. (1995). La observación y el registro fotográfico de los geles se realizaron en el fotodocumentador BioRad Gel DOC EQ System y software Quantity One. La comparación de los perfiles de PFGE (PFPs) se realizó visualmente. Para la interpretación de los datos y la elaboración de los dendogramas, se utilizó el programa informático Bionumerics v.5.1 (Applied Maths). Con el objetivo de determinar la relación genética entre las cepas de C. fetus seleccionadas en esta tesis y cepas de C. fetus, C. coli y C. jejuni, se seleccionaron aislamientos pertenecientes a la Red PulseNet. Los perfiles de PFGE obtenidos para C. fetus presentaron fragmentos incluidos en un amplio rango de tamaño y con una distribución homogénea. La homología interespecie entre C. fetus, C. coli y C. jejuni fue 40 - 50% e intraespecie para C. fetus > 70%. La PFGE – SmaI permitió identificar 19 PFPs para las 28 cepas de C. fetus. En el Capítulo IV se relacionaron los parámetros fenotípicos y genotípicos analizados en los capítulos anteriores, con los datos de origen de las cepas de C. fetus y entre sí. La distribución temporal y por muestra clínica de origen de las subespecies de C. fetus fueron analizadas mediante las herramientas de gráfico en el programa Excel. La distribución espacial se evaluó mediante el programa SatScan V9.3 tomando como unidad de localización geográfica al centroide del partido de origen de las cepas. La visualización espacial de las cepas se realizó mediante mapas gráficos utilizando el software QGis 2.10.1. Para la visualización de la distribución espacial de los parámetros de patogenicidad se consideraron los mayores y menores porcentajes de adherencia y de citopatogenicidad para cada subespecie bacteriana. El efecto del origen y de la subespecie de C. fetus sobre los parámetros de patogenicidad, se analizó mediante un ANOVA. Para evaluar la asociación lineal entre los parámetros observados en los distintos cultivos celulares en relación a la muestra clínica de origen y las subespecies, se calculó el coeficiente de correlación de Pearson y de Spearman. En el período de tiempo analizado se registró la presencia de ambas subespecies de C. fetus con un predominio de C. fetus subsp. fetus en siete años. El mayor número de cepas de C. fetus subsp. fetus fueron aisladas de fetos y de C. fetus subsp. venerealis de hembras y toros. Se observa una distribución temporal homogénea para el porcentaje de adherencia de las cepas en los diferentes cultivos. En células MDBK, los porcentajes fueron menores en relación a los cultivos primarios. La distribución del número de C. fetus por célula fue homogénea, si bien en la mayoría de los años los mayores valores se registraron en los cultivos de células MDBK. Los porcentajes de citopatogenicidad de las cepas fueron superiores al 50% y el F > 1,3 en todos los años de estudio. La subespecie bacteriana no tuvo efecto significativo sobre los parámetros de patogenicidad evaluados. La mayor patogenicidad se observó en las cepas de origen fetal y la menor en las aisladas de toros. Las correlaciones entre los parámetros de patogenicidad fueron positivas y significativas. La adherencia y el efecto citopatogénico se correlacionaron independientemente del número de bacterias adheridas por célula, principalmente para las cepas aisladas de fetos y hembras. La presencia del polipéptido mayor fue independiente de los datos de origen de las cepas. La distribución temporal de las cepas con el polipéptido mayor fue homogénea en todos los años. Al evaluar la distribución espacial, no se observó ninguna tendencia de distribución definida. El polipéptido se observó en 46 cepas aisladas de fetos, 30 de hembras y 11 de toros. En cambio, las cepas que no presentaron el polipéptido fueron aisladas de muestras de fetos (3) y hembras (5). La subespecie bacteriana no tuvo asociación significativa sobre los parámetros de patogenicidad. La mayor patogenicidad se observó en las cepas de origen fetal y la menor en las aisladas de toros. Las subespecies bacterianas, los parámetros de patogenicidad y la presencia del polipéptido mayor de las cepas no registraron tendencias de distribución temporal ni geográfica. Los resultados de la distribución temporal, espacial y por muestra clínica de origen para las cepas caracterizadas por PCR, fueron similares a los obtenidos por pruebas bioquímicas. Los PFPs de C. fetus no se relacionaron con el año de aislamiento, la localización geográfica y la muestra clínica de origen de las cepas en estudio. El porcentaje de similitud para la especie C. fetus fue > 70%. El porcentaje intrasubespecie para C. fetus subsp. venerealis (13 cepas) fue > 80% y sólo tres fueron 100% homólogas y para C. fetus subsp. fetus (15 cepas) > 70%, ocho fueron indistinguibles bajo esta metodología. Los resultados confirman la utilidad de la PFGE – SmaI como una herramienta molecular de alto poder discriminatorio a nivel de subespecie para C. fetus. Para C. fetus subsp. venerealis, sólo dos cepas aisladas de mucus cérvico vaginal fueron indiferenciables bajo esta metodología. En las cepas aisladas de toros las homologías registradas fueron < 75% y para los fetos < 70%. Para C. fetus subsp. fetus, tres cepas aisladas de feto fueron indistinguibles. En las cepas aisladas de hembras las homologías fueron < 70% y en toros <75%. Los PFPs registrados para ambas subespecies en los casos intrarodeo se correspondieron tanto con cepas homólogas como heterólogas. Para evaluar el grado de concordancia entre los resultados obtenidos por pruebas bioquímicas y la PCR para caracterizar las subespecies, se realizó el test de Mc Nemar y se estimó el coeficiente Kappa mediante el procedimiento PROC FREQ del SAS V.9.12 (SAS, Institute Inc., Cary, NC, USA). Para la subespecie C. fetus subsp. venerealis, fueron identificadas por pruebas bioquímicas 45 cepas (47,4%) y por PCR 49 (51,6%). Para C. fetus subsp. fetus por pruebas bioquímicas 50 cepas (52,6%) y por PCR 46 (48,4%). El test de Mc Nemar no detectó diferencias significativas (p=0,1573) y el coeficiente Kappa fue de 0,8319 indicando una alta concordancia entre ambas técnicas. El bajo número de cepas procesadas por PFGE limitó la asociación de los PFPs con la presencia del polipéptido mayor. Los parámetros fenotípicos y genotípicos considerados en la presente tesis, no se relacionaron entre sí. Finalmente, se concluye que las cepas de C. fetus actuantes en los rodeos bovinos poseen diferencias fenotípicas y genotípicas.

Enterococcus spp. es flora habitual de la microbiota intestinal de humanos y animales, así como importantes patógenos nosocomiales. Desde principios del siglo XX, se conoce que causan infecciones en humanos. Enterococcus faecalis y Enterococcus faecium son las especies más relevantes clínicamente, particularmente en infecciones invasivas humanas. Estas especies se consideran patógenas oportunistas, ya que las infecciones graves se han asociado principalmente a pacientes inmunocomprometidos. Las infecciones invasivas causadas por enterococos pueden tener un origen alóctono o endógeno. Además, los enterococos presentan resistencia intrínseca a varios antibióticos, como los β-lactámicos, trimetoprima-sulfametoxazol y los aminoglucósidos que podrían mejorar su selección en el tracto gastrointestinal humano. E. faecium y E. faecalis han adquirido resistencia a la mayoría de las familias de antibióticos utilizados en terapia humana, en las últimas tres décadas. Esto llevó a la selección de clones enterocócicos resistentes a múltiples fármacos, lo que complica enormemente el tratamiento antimicrobiano, particularmente en el caso de infecciones graves. La adquisición de resistencia a vancomicina, una de las opciones terapéuticas de primera línea para las infecciones por enterococos, es uno de los problemas más preocupantes para la salud humana. El primer enterococo vancomicina resistente (EVR) reportado en América Latina fue una cepa de E. faecium de Argentina en 1998. Posteriormente, se realizaron estudios epidemiológicos para detectar EVR en diferentes hospitales de Argentina. El linaje clonal más frecuente de E. faecium vancomicina resistente (EFMVR) que circula en los hospitales argentinos parece ser el ST17. Se han realizado varios estudios de vigilancia epidemiológica aplicando técnicas moleculares en nuestro país, sin embargo se limitan principalmente a cepas EVR. No hay documentación de los perfiles de resistencia a los antimicrobianos y de la estructura poblacional de E. faecalis y E. faecium aislados de infecciones invasivas humanas en el Hospital Público de Tandil, Argentina hasta la fecha. El objetivo general de este trabajo de tesis fue caracterizar fenotípicamente y genotípicamente Enterococcus spp. aislados de líquidos obtenidos por punción, de infecciones invasivas humanas, de pacientes ingresados en el Hospital Municipal Ramón Santamarina (HMRS) de Tandil. Además, el segundo objetivo general fue detectar la resistencia a los antimicrobianos y evaluar in vitro varias opciones terapéuticas en enterococos resistentes a múltiples fármacos (MDR). Las cepas de Enterococcus spp. se recuperaron de forma retro-prospectiva a través de un estudio transversal a partir de infecciones invasivas de pacientes hospitalizados en el HMRS entre 2010 y 2014. Todas las cepas fueron identificadas con métodos convencionales fenotípicos y confirmadas por MALDI TOF-MS. Cuarenta y cuatro fueron identificadas como E. faecalis (69,8 %) y 19 como E. faecium (30,2 %). La caracterización molecular y la relación clonal se determinaron mediante electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE) y tipificación de secuencias multilocus (MLST). La susceptibilidad a 15 antimicrobianos ampicilina, penicilina, ampicilina/sulbactam, cloranfenicol, vancomicina, teicoplanina, estreptomicina (resistencia de alto nivel: RAN), gentamicina (RAN), ciprofloxacina, levofloxacina, quinupristin-dalfopristin, clindamicina, eritromicina, linezolid y tigeciclina fue determinada por el método de difusión de disco y por concentraciones inhibitorias mínimas (CIM). El genotipo de resistencia a glucopéptidos fue determinado por PCR. La actividad antimicrobiana se evaluó in vitro mediante estudios de cinética de muerte utilizando curvas de letalidad. Este trabajo de tesis contribuye a generar conocimiento para continuar avanzando en la temática de la resistencia antimicrobiana y su estrategia de control en Argentina en el contexto de “Una Salud’’. Además, reconoce que, la detección y el control epidemiológico de los enterococos MDR es necesario realizarlo tanto en reservorios humanos como no humanos, para evitar su diseminación e impacto en salud pública.

Tesis (Magister en Ciencias Agropecuarias. Mención: Producción Vegetal)--UNC- Facultad de Ciencias Agropecuarias, 2014.

Helicoverpa gelotopoeon (D.) (Lepidoptera: Noctuidae) es una plaga polífaga de la subfamilia Heliothinae que ocasiona daños a los cultivos de soja, garbanzo, algodón y alfalfa, entre otros. Algunas especies de este complejo han desarrollado resistencia a cultivos genéticamente modificados e insecticidas, lo cual ha llevado a incrementar el interés sobre la biología, diversidad genética y estructuración poblacional de H. gelotopoeon. El objetivo de este trabajo fue determinar la existencia de estructura genética de poblaciones de H. gelotopoeon en función de distintas plantas hospederas y regiones de la Argentina en base a características biológicas y moleculares. Los parámetros biológicos evaluados fueron: duración de los estados de huevo, larva y pupa, número de estadios larvales, masa pupal y longevidad de adultos. Los parámetros reproductivos evaluados fueron: número de espermatóforos, período de pre, ovi y postoviposición, fecundidad y fertilidad. Para los ensayos de compatibilidad reproductiva se realizaron cuatro tipos de cruzas: parentales, híbridas, retrocruzas y cruzas entre híbridos. Para la caracterización molecular se utilizaron marcadores nucleares (microsatélites) y mitocondriales (de las regiones Citocromo oxidasa I y Citocromo b), ya que se consideró que ambos marcadores podían proveer información complementaria y más precisa para entender la estructura poblacional de esta especie. A partir de los resultados obtenidos en esta investigación, se observó que H. gelotopoeon completa su ciclo aproximadamente en 45 días en condiciones de laboratorio, observándose la mayor mortalidad en el estado de huevo y los primeros estadios larvales. Las poblaciones pertenecientes a distintos cultivos y regiones mostraron parámetros biológicos y reproductivos similares. A su vez, las cruzas intra e interpoblacionales no mostraron signos de incompatibilidad reproductiva, sugiriendo un flujo génico sustancial entre las poblaciones. Los marcadores nucleares microsatélites mostraron que las poblaciones de H. gelotopoeon no están estructuradas y hay flujo génico entre ellas, correlacionándose este resultado con lo observado a nivel biológico. Sin embargo, los marcadores mitocondriales mostraron que en general existiría cierta estructuración genética entre las poblaciones de H. gelotopoeon. Se consideran diversas causas que podrían haber contribuido a esta estructuración, como ser: región geográfica, planta hospedera, año de recolección, influencia de plantas silvestres, distintos sistemas de manejo, etc. Se destaca también la necesidad de realizar más estudios, abarcando una escala geográfica mayor, así como otros cultivos y posibles hospederos silvestres a lo largo de varias campañas. Todo esto ayudará a comprender mejor el grado de flujo génico y la repercusión del comportamiento migratorio de H. gelotopoeon en las distintas campañas. Este trabajo de tesis constituye el primer estudio de caracterización biológica y genética de H. gelotopoeon, información que servirá para desarrollar estrategias de manejo de esta plaga en Argentina, sobre todo haciendo énfasis en el retraso del desarrollo de resistencia a insecticidas y cultivos Bt.

El mal de Río Cuarto virus (MRCV) es la enfermedad más importante del maíz (Zea mays L) en la Argentina. El MRCV -género Fijivirus, Familia Reoviridae- es transmitido de manera persistente por Delphacodes kuscheli Fennah. Estudios iniciales mostraron que la resistencia al MRCV es un carácter poligénico de moderada heredabilidad, regido por genes con efectos genéticos aditivos y no aditivos. Los genotipos usualmente tienen respuestas impredecibles porque esta enfermedad virósica, que se presenta de manera no sistemática, manifiesta una marcada interacción genotipo x ambiente. Los objetivos del presente estudio fueron evaluar fenotípicamente familias segregantes F2:3 de maíz por los caracteres índice de severidad (ISE), incidencia (INC) y severidad (SEV) del MRCV, así como por intervalo antesis-estigma (IAE) y rendimiento (RTO); estimar la heredabilidad y correlación de los caracteres; identificar loci de caracteres cuantitativos (QTL) para ISE, INC y SEV; y determinar la consistencia en las posiciones encontradas. Un total de 208 familias F2:3 derivadas del cruzamiento entre la línea parental susceptible (B73) y resistente (LP116), fueron evaluadas para los caracteres mencionados en tres ambientes en el área donde el MRCV es endémico. La extracción de ADN se realizó desde material vegetal obtenido de las líneas parentales y de las generaciones F1 y F2. El análisis molecular se realizó con marcadores microsatélites y se efectuaron análisis de ligamiento entre los mismos para identificar regiones del genoma asociadas a los caracteres. Los valores estimados de heredabilidad fueron moderados para todos los caracteres en ambientes individuales donde las componentes de varianza genética y ambiental presentaron similares dimensiones; las estimaciones a través de ambientes fueron inferiores debido a una gran proporción de la componente de varianza genotipo x ambiente. El ISE del MRCV presenta correlaciones positivas y significativas con síntomas en panojas y hojas, INC, SEV e IAE, y correlaciones negativas y significativas con altura de planta y RTO. Los QTL estables detectados para ISE, INC y SEV del MRCV, mediante el análisis de QTL para caracteres múltiples en ambientes múltiples (MTME), ubicados en los bins 1.03, 1.07, 4.01, 8.08 y 10.03, resultan posiciones consistentes al observar lo encontrado en estudios previos, por lo que serán regiones candidatas para profundizar la investigación de las bases genéticas de la resistencia a la enfermedad. Sobre la base de heredabilidades moderadas e interacciones genotipo x ambiente significativas, la selección para la resistencia requiere continuar con la evaluación de distintas fuentes de germoplasma a través de múltiples años y localidades.

Aspergillus flavus es uno de los principales productores de aflatoxinas, carcinógeno de grado 1. La Argentina es un país agrícola donde el cultivo de maní (Arachis hypogaea) es uno de los más rentables, pero también uno de los más susceptibles de ser atacados por Aspergillus. El origen del maní cultivado proviene de Argentina y Bolivia, donde se encuentran distribuidas las especies nativas del género y sobre las cuales no existen estudios sobre los hongos productores de micotoxinas asociados. Por primera vez se realizó un relevamiento de especies nativas de Arachis y se aislaron Aspergillus de la sección Flavi, comparando la diversidad fúngica de las especies nativas y cultivadas. Se estudió la estructura poblacional de A. flavus de semillas de maní en base a la técnica de compatibilidad vegetativa, potencial toxigénico y producción de esclerocios de tipo S o L. Se llevó a cabo una revisión de la sección Flavi utilizando características morfológicas, filogenia molecular y perfil de producción de extrolitos. Los resultaron mostraron que existen diferencias en la proporción y especies de la sección Flavi asociados a las especies de Arachis. Mas del 90% de A. flavus produjeron aflatoxinas y cerca del 100%, ácido ciclopiazónico. Las cepas S produjeron aflatoxinas tipo B y G. El porcentaje de las cepas L es mas alto que el de las cepas S. La presencia de un alto numero de VCGs con un solo aislamiento y el bajo número de grupos de compatibilidad vegetativa que incluyeron aislamientos de diferentes zonas agroecológicas demostraron la alta diversidad poblacional de A. flavus en nuestro país. Cepas tipo L y S de A. flavus actúan de diferente manera, presentan diferencias morfológicas, perfil de producción de extrolitos y quedan agrupadas en diferentes clados. Las especies nativas de Arachis podrían actuar como reservorios de Aspergillus sección Flavi. El alto potencial toxigénico de las especies de Aspergillus y la alta diversidad genética de A. flavus son factores importantes cuando se debe elegir y formular medidas de control a aplicar en el campo. La heterogeneidad en las poblaciones derivadas de las semillas de maní sugiere que las poblaciones de A. flavus se encuentran bajo continuos cambios temporales y espaciales. La sección Flavi se caracteriza por la superposición de caracteres entre los miembros del grupo por lo cual el estudio taxonómico requiere de la utilización de diferentes disciplinas. Del análisis filogenético se concluye que la habilidad de producir aflatoxinas fue perdida (o ganada) varias veces en la evolución de los integrantes de la sección. Se describen 2 nuevas especies.