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Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2017.

Los ácidos grasos insaturados (AGI) son componentes esenciales de la membrana celular. Los organismos vivos, en particular los poiquilotermos, responden a una disminución en la temperatura aumentando la proporción de AGI. Este fenómeno ha sido designado con el nombre de adaptación homeoviscosa 1. Los AGI son sintetizados por desaturasas, un tipo especial de oxigenasas que tienen la capacidad de remover dos hidrógenos de una cadena hidrocarbonada, especialmente de cadenas de ácidos grasos (AG), catalizando la formación de un doble enlace en el sustrato en forma altamente estéreo-, regio- y quimio- selectiva 2. Hasta el momento, no se conocen las bases moleculares que expliquen este grado de sofisticación de estas enzimas. La gran mayoría de las desaturasas se encuentran unidas a membrana, lo que dificulta la obtención de grandes cantidades en forma activa, y por consiguiente el entendimiento de las propiedades particulares de su actividad enzimática. El estudio de desaturasas bacterianas con actividades diferentes, sobre sustratos similares, y estructura primaria similar presenta una oportunidad única para llevar a cabo estudios sobre la relación estructura-función de estas enzimas. En bacterias Gram positivas la única desaturasa de AG caracterizada es la Δ5 desaturasa de Bacillus subtilis 3. El análisis de la composición lipídica de cepas de B. subtilis reveló que esta bacteria sintetiza exclusivamente AGI con el doble enlace en la posición 5 y los estudios complementarios realizados revelaron que esta bacteria posee una única acil lípido desaturasa denominada Des que cataliza la introducción de dobles enlaces en la posición 5 con distintos sustratos, no mostrando preferencia por la longitud de cadena 3. Esta desaturasa se induce a bajas temperaturas y su expresión se encuentra regulada por un sistema de dos componentes, DesK-DesR (DesK/R) 4. Estudios realizados por Fulco 5 demostraron que algunas especies de bacilos sintetizaban AGI con el doble enlace en la posición 5, mientras que en otras se encontró un espectro de isómeros de dobles enlaces centrados alrededor de la posición 9 y sobre AG de distinta longitud de cadena6. En Bacillus licheniformis 9259 se observaron tanto AGI en la posición 5 como en la posición 10, y se propuso que al menos dos desaturasas distintas estaban involucradas 7. Otros grupos observaron que Bacillus cereus sintetiza AGI Δ5, Δ10 y Δ5,10 8. Esta diversidad de actividades hacen del género Bacillus una fuente natural de desaturasas que podría ser utilizada para comprender los mecanismos moleculares que gobiernan la especificidad de sustrato. Además, la gran cantidad y diversidad de AGI sintetizados por estos organismos los convierten en excelentes modelos para comprender la funcionalidad de las desaturasas y estudiar los mecanismos que regulan su expresión. Los resultados presentados en este Trabajo de Tesis permitieron contribuir al conocimiento de la función y regulación de las desaturasas de B. cereus ATCC 14579 y B. licheniformis ATCC 14580. Se comprobó que B. licheniformis posee una única acil lípido desaturasa, DesL que tiene actividad Δ5. Cuando cultivos de esta bacteria se transfieren de 37°C a 25°C la cantidad de AGI aumenta 2 veces, de 3% a 6%, lo cual sugirió que la expresión o actividad de esta enzima se encuentra regulada por la temperatura de crecimiento. Posteriormente se pudo demostrar que la expresión del gen desL se encuentra regulada por un mecanismo similar al descripto previamente en nuestro laboratorio para B. subtilis, en el que estaría involucrado un sistema de dos componentes similar a DesK/R. Se determinó que B. cereus posee dos desaturasas denominadas DesA y DesB. Ambas proteínas son acil lípido desaturasas con actividad Δ5 y Δ10, respectivamente. Estas dos enzimas son las responsables de sintetizar la gran cantidad de AGI que produce B. cereus tanto a 37°C (27%) como a 25°C (45%). Este aumento en la síntesis de AGI al disminuir la temperatura de crecimiento se debería a un incremento en la expresión del gen desA y a un aumento en la actividad de DesB, ya que el gen desB se expresaría de manera constitutiva. Estudios fisiológicos realizados con mutantes obtenidas en el gen desA, mostraron que esta desaturasa no es esencial para el crecimiento bacteriano en ninguna condición ensayada. Por otro lado la ausencia de DesB inhibe completamente el crecimiento de B. cereus en medio mínimo (MM). Este defecto no pudo ser corregido por el agregado de AGI exógenos en este medio debido a que el suplemento en este medio fue insuficiente para corregir la deficiencia de AGI o a los efectos líticos que produce el agregado externo de los mismos al medio de cultivo. La recuperación del crecimiento se logró luego del agregado de aminoácidos (AA) precursores de ácidos grasos ramificados (AGR) al medio de cultivo, o de AA no precursores más AGI exógenos. Esto estaría sugiriendo que es necesaria una combinación de AGR y AGI que provean fluidez a la membrana para permitir el crecimiento. En este sentido se pudo determinar que el agregado de precursores de los AGR, en particular la isoleucina, rescata el crecimiento en forma parcial. Los AGR presentan bajos puntos de fusión al igual que los AGI y permiten fluidificar la membrana en ausencia de los mismos. Esta la primera vez que se describe la esencialidad de una desaturasa para el crecimiento bacteriano en estas condiciones. Finalmente, todos los resultados obtenidos en esta Tesis han contribuido a la caracterización de desaturasas del género Bacillus con el fin de comenzar a comprender las bases moleculares que gobiernan el proceso de desaturación. Además la identificación de genes homólogos a desB, esencial para el crecimiento de B. cereus, en otras especies Gram positivas, incluyendo otros patógenos humanos, indica que la información sobre esta proteína descripta en este trabajo podría ser utilizada para el desarrollo de nuevos compuestos antimicrobianos.

El objetivo general del presente estudio de Tesis es la “Caracterización funcional del cotransportador Na⁺/HCO₃- (NBC) cardíaco”, investigando la implicancia de sus diferentes isoformas en la fisiología cardíaca y esclareciendo el papel que cumple la Angiotensina II (Ang II) en la modulación de su actividad. Para ello se utilizaron miocitos ventriculares de gato adulto en los cuales se midió el pH intracelular (pHi) por epifluorescencia y se realizaron registros de potenciales de acción (PA) con la técnica de Patch-clamp para evaluar la implicancia de las isoformas electrogénicas del NBC en su morfología y duración. La producción de anticuerpos contra la isoforma electrogénica NBC1 se utilizó para evaluar la expresión y función del NBC1 en los miocitos ventriculares.

La fijación biológica de nitrógeno que surge a partir de la relación simbiótica entre rizobios y leguminosas permite la incorporación de nitrógeno al suelo para su explotación en sistemas agropecuarios a muy bajo costo. En esta relación compleja y específica existen determinantes moleculares de las plantas que gobiernan la colonización preferencial por ciertas cepas de rizobios. Las plantas integran señales derivadas del microsimbionte y del ambiente para iniciar los programas de organogénesis de estructuras diferenciadas llamadas nódulos y el proceso de infección. Varios factores de transcripción desempeñan funciones fundamentales en estos procesos, incluyendo las proteínas de las familias GRAS y NF-Y. En el presente trabajo de tesis se generó un conjunto de datos de secuencias, estructuras génicas, relaciones filogenéticas y patrones de expresión de genes que codifican las subunidades NF-Y en Phaseolus vulgaris, la leguminosa de grano más importante utilizado para el consumo humano directo. A partir de este análisis se seleccionaron genes candidatos para estudiar su rol en la nodulación mediante genética reversa. La reducción de los niveles de mRNA de PvNF-YA1 y PvNF-YA9 condujo a la ausencia de nodulación y provocó defectos en el proceso de infección. La inducción de genes del ciclo celular en respuesta al rizobio se vio afectada en las raíces silenciadas, sugiriendo que estos factores de transcripción podrían promover el desarrollo de nódulos mediante la activación de divisiones celulares corticales que participan en la formación del primordio del nódulo. A su vez, ensayos de sobreexpresión permitieron demostrar que PvNF-YA1 contribuye a la selección de cepas de rizobio que son más eficientes en la formación de nódulos. Por otro lado, se llevó a cabo la caracterización de una proteína de la familia GRAS, denominada SIN1 (Scarecrow like 13 Involved in Nodulation), que interactúa físicamente con la subunidad PvNF-YC1, previamente vinculada al proceso de nodulación. Ensayos de silenciamiento mostraron que SIN1 desempeña una función importante tanto en la elongación de raíces laterales como en el desarrollo de nódulos fijadores de nitrógeno y en la progresión de la infección bacteriana durante la interacción simbiótica. El presente trabajo de tesis contribuye a sustentar la relevancia de los complejos de transcripción multiméricos en la capacidad de las plantas para integrar y responder a múltiples factores ambientales.

La luz y las temperaturas alternadas son dos señales que promueven la salida de la dormición en las semillas de muchas especies. La germinación depende además de los cambios que se producen en los niveles hormonales, como las giberelinas y el ABA que promueven e inhiben el proceso, respectivamente. Si bien existen muchos niveles de regulación génica modulados por los fotorreceptores, no hay información disponible sobre la regulación a nivel de splicing del ARN mensajero por luz, aunque existen evidencias de su importancia en la regulación de varios procesos fisiológicos. En este trabajo caracterizamos el perfil transcripcional y post-transcripcional de semillas Col-0 irradiadas con luz R o RL y demostramos que el splicing alternativo es un mecanismo de control relevante que confiere un nivel adicional de regulación génica. Mediante aproximaciones fisiológicas y moleculares demostramos que el gen ATHB2 es un regulador negativo de la germinación promovida por el fitocromo B (phyB) que ejerce su función en la vía de señalización del ABA. Además, evaluamos el rol de auxinas en la promoción de la germinación por luz y demostramos la importancia de los procesos de transporte que involucra a las proteínas PIN. Semillas de muchas especies necesitan temperaturas alternadas antes del estímulo de luz para germinar. Demostramos que la germinación de semillas de Arabidopsis thaliana embebidas a ciclos cortos de temperaturas alternadas y luego a un pulso de luz R es mediada por phyB y requiere de la presencia de alelos funcionales PRR7 y TOC1. Adicionalmente, los ciclos diarios de temperatura en oscuridad reducen los niveles de DOG1, permitiendo que la expresión de TOC1 promueva la germinación. Nuestros resultados ponen de relevancia el rol de algunos componentes del reloj circadiano relacionados con la acción de DOG1 en el control de la germinación por luz y temperaturas alternadas.

La PPNA es indicadora de la biomasa disponible y se relaciona con la capacidad de carga de los sistemas pastoriles extensivos. Es posible estimarla a partir de índices de vegetación obtenidos de sensores remotos. El objetivo de esta tesis fue caracterizar funcional y estructuralmente una estepa graminosa (Estepa Magallánica Seca-EMS)y una arbustiva ((Matorral de Mata Negra-MMN)de la Patagonia Austral. En 18 sitios se midió cobertura vegetal (2004 y 2010)y biomasa por estratos (2004 y 2005). Se obtuvieron 8 índices de vegetación a partir de imágenes MODIS (resolución 16 días, 250m, 2003-2010). Se caracterizaron las comunidades vegetales (PCA). Se extrajeron los índices en áreas de 3x3 pixeles y correlacionaron con la biomasa y cobertura medidas a campo. Ambas áreas están dominadas por especies perennes con una cobertura de 66 por ciento En MMN la mitad de este valor corresponde a arbustos. La biomasa aérea total fue de aproximadamente 1000 Kg MS/ha en EMS y el triple en MMN, en ambos casos un 33 por ciento corresponde a material verde. Los índices presentan patrones temporales similares entre áreas, con un máximo a fines de octubre, aunque NDVI y RVI mostraron un segundo pico en abril. El MMN posee mayor biomasa pero los índices fueron 20 por ciento menores que EMS. El NDVI caracterizó mejor la vegetación de la EMS, con correlaciones de 0,69, 0,43 y 0,48 con la fracción verde de biomasa total, intercoironal y coironal, respectivamente. Reflejó además el crecimiento otoñal característico de ambientes con régimen isohigro, limitados por temperatura y humedad. Por el contrario, en el MMN, los índices espectrales y los indicadores de biomasa no correlacionaron. Los valores de regresión obtenidos indican que la evaluación de biomasa disponible a partir de sensores remotos es solo posible en uno de los ecosistemas y muestran que para estimar la receptividad, seria necesaria una calibración local de los índices, dado que la estructura de la vegetación modifica los valores espectrales.

La envoltura bacteriana de Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 tiene las características de una bacteria Gram positiva, pero además posee proteínas de superficie o Surface layers (S-layers), las cuales se asocian con roles de protección contra enzimas hidrolíticas, cambios de pH y estrés, la captación de moléculas y iones, y ayudan a mantener la forma y rigidez de la célula. Además, varios reportes sugieren que en los lactobacilos la S-layer tendría un rol en las propiedades probióticas de las cepas que la poseen, sin embargo las funciones y los mecanismos involucrados están poco descriptos. El objetivo general de esta Tesis doctoral fue caracterizar funcional y estructuralmente la S-layer de Lactobacillus acidophilus ATCC 4356. Los resultados obtenidos permitieron confirmar que la S-layer presenta un comportamiento homólogo a las lectinas, capaz de interactuar con eritrocitos de carnero, células bacterianas, levaduras, virus y células eucariotas. Respecto a los posibles carbohidratos con los cuales interactúa, se observó un comportamiento mixto asemejándose tanto a las lectinas que reconocen quitina/N-acetilglucosamina como a las de reconocimiento de ácido siálico/manosa. Mediante diferentes ensayos, como el clonado y expresión de proteínas o partes de la proteína conjugadas con la proteína verde fluorescente GFP, se logró identificar los dos dominios de reconocimiento a carbohidratos (CRD) ubicados en la porción carboxilo-terminal y predichos del análisis in silico de la proteína. La actividad de lectina depende de la presencia de estos CRD. También quedó demostrado que el ácido lipoteicoico sirve como un ancla para la proteína SlpA. Además, fue posible determinar cómo se modifica la expresión de los tres genes que codifican para S-layer en esta cepa: slpA, slpB y slpX, en respuesta a cambios ambientales como la alta concentración salina. Se observaron cambios en la expresión génica de los ARNm slpA y la slpX pero no slpB. En consecuencia, la cantidad de las proteínas SlpA y SlpX se modifican no solo por la condición de alta sal (NaCl 0,6 M) sino también por la fase de crecimiento. Por otro lado, en los últimos años se han desarrollado o sugerido diversas aplicaciones biológicas para las proteínas S-layers de Lactobacillus, en este trabajo se pudo establecer que la proteína S-layer disminuye la adherencia y la formación de biopelículas de Pseudomonas aeruginosa en superficies bióticas y abióticas, respectivamente. Además fue capaz de modular la infección de diferentes virus, con una notable actividad pro-viral, facilitando las etapas tempranas del ciclo de infección de tres virus empleados como vectores oncolíticos: el herpes virus simplex tipo 1 (HSV-1), el virus de la estomatitis vesicular y el adenovirus 5. La proteína S-layer también fue capaz de proteger al virus HSV-1 de la inactivación térmica por calor.En conjunto estos resultados aportan a comprender las características estructurales y funcionales de la S-layer, y permiten proponer futuras aplicaciones biológicas.

Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2015

Las plantas adaptan su arquitectura de raíz como parte de la respuesta a los cambios en las condiciones ambientales, tales como disponibilidad de agua, nutrientes y estreses de tipo biótico y abiótico. En particular, las plantas leguminosas desarrollan dos tipos de órganos laterales post-embrionarios en sus raíces, las raíces laterales (RLs) y los nódulos fijadores de nitrógeno. Las RLs participan en el anclaje de la planta al suelo y en la incorporación de agua y nutrientes. Los nódulos, los cuales se desarrollan a partir de la interacción simbiótica entre las leguminosas y las bacterias del suelo conocidas como rizobios, proveen compuestos nitrogenados asimilables a la planta. Ambos órganos poseen un fuerte impacto en el crecimiento de la planta, por lo tanto la comprensión de los mecanismos moleculares involucrados en el desarrollo de las RLs y los nódulos contribuiría a mejorar y aumentar el rendimiento de cultivos de importancia agronómica, así como también a recuperar tierras pobres en nitrógeno y reducir el impacto negativo de los fertilizantes químicos sobre la biodiversidad. Los microRNAs (miRNAs) son pequeños RNAs de 21-22 nucleótidos que actúan como reguladores post-transcripcionales de la expresión génica en organismos eucariotas durante el desarrollo de nuevos órganos o en respuesta a estímulos ambientales. En los últimos años, se han descripto miRNAs cuyos niveles se acumulan diferencialmente en diferentes etapas del desarrollo de las RLs o nódulos, sin embargo sólo un número reducido de ellos han sido caracterizados en detalle y asociados con una función en la infección rizobiana y/o la organogénesis y desarrollo del nódulo. En el presente trabajo de tesis doctoral se propuso como objetivo general caracterizar la vía de miR390/TAS3 durante el desarrollo de los órganos laterales en las raíces de la leguminosa modelo M. truncatula. El miR390 se asocia a la proteína ARGONAUTA7 y posee como target al transcripto no codificante TAS3, a partir del cual se generan los trans-acting interference small RNA (tasiRNAs). Estos tasiRNAs regulan mediante un mecanismo de clivaje los niveles de los transcriptos que codifican los Factores de Transcripción Regulados por Auxinas (ARF)2, ARF3 y ARF4, por lo que han sido denominados tasiARFs. Estudios previos en nuestro laboratorio, sugirieron que la vía miR390/TAS3 estaría involucrada en la infección rizobiana y/o en la organogénesis del nódulo. Con el fin de evaluar la acumulación y la expresión espacio-temporal de los transcriptos y los pequeños RNAs que componen esta vía en diferentes estadios de desarrollo de los órganos laterales de la raíz, se llevaron a cabo reacciones de RT-qPCR y fusiones transcripcionales de los promotores a los genes reporteros gfp y uidA (también conocido como gen gus dado que codifica la proteína β-glucuronidasa (GUS)). Estos resultados mostraron que la vía miR390/TAS3 se reprime en etapas tempranas de la interacción entre M. truncatula y S. meliloti, liberando la represión post-transcripcional de ARF2, ARF3 y ARF4. A su vez, hemos identificado y validado una nueva variante del transcripto TAS3 que probablemente actúa como un target mimicry endógeno de miR390 y contribuiría a disminuir los niveles de miR390 en esta etapa. En estadios más avanzados de la interacción, la vía es re-activada quedando restringida a la zona apical del nódulo. Para indagar sobre la función de la vía se generaron raíces transgénicas que sobreexpresaban el precursor de miR390b (OX390) o un target mimicry de miR390 (MIM390) capaz de secuestrar al miR390 y bloquear su acción. Además de la estrategia de expresión target mimicry, se utilizaron líneas mutantes en el gen AGO7, en las cuales la vía miR390/TAS3 se encuentra inactiva. La evaluación del fenotipo asociado a la arquitectura de raíz y a la nodulación en las plantas OX390, MIM390 y ago7 reveló que la vía miR390/TAS3 actúa como un regulador positivo sobre la elongación de las RLs, posiblemente como consecuencia del incremento de la señalización y/o respuesta a auxinas, y como un módulo represor de la infección rizobiana y el desarrollo de nódulos. A su vez, la inactivación de la vía miR390/TAS3, ya sea en las raíces MIM390 o ago7, resultó en el desarrollo de nódulos que presentan una distribución espacial y morfología alterada. El análisis de la acumulación de transcriptos, previamente descriptos como marcadores de la nodulación, en las raíces OX390, MIM390 y ago7 permitió establecer una correlación entre los niveles de ARF2, ARF3 y ARF4 y dos factores de transcripción de la familia GRAS designados NSP (Nodulation Signaling Pathway)1 y NSP2, sugiriendo que ambos factores de transcripción serían los candidatos por medio de los cuales la vía de miR390/TAS3 y la vía de señalización de la nodulación se intersectan. Con el objetivo de identificar genes cuyos niveles de acumulación se encuentran afectados directa o indirectamente por la sobreexpresión de miR390, se caracterizó el transcriptoma de las raíces OX390 en presencia y ausencia del rizobio mediante RNA-seq. El análisis in silico de los datos generados permitió identificar genes con expresión diferencial regulados negativamente o positivamente en respuesta a la sobreexpresión de miR390. Entre estos, se destacan genes marcadores de nodulación, factores de transcripción miembros de la familia LOB, genes involucrados en la respuesta y señalización de hormonas y genes relacionados con la traducción. Los resultados obtenidos en el presente trabajo de tesis doctoral han permitido avanzar en el conocimiento sobre la regulación post-transcripcional de genes durante dos procesos de desarrollo con relevancia ecológica y agronómica. Este conocimiento podría ser aplicado en etapas futuras a la optimización de incorporación de nutrientes y nitrógeno en las plantas, contribuyendo a mejorar y aumentar el rendimiento de los cultivos de leguminosas.

Dado el aumento continuo de la población mundial es necesario incrementar la producción de los cultivos que aseguren la alimentación de esta población. Para lograr este objetivo es fundamental conocer el funcionamiento integral de las plantas y sus mecanismos de respuesta a estímulos de distintos tipos. En estas respuestas intervienen factores de transcripción (FTs), proteínas que regulan la expresión de genes blanco y desencadenan cascadas de señalización que llevan o no a la adaptación de las plantas al medio en el que se encuentran. En este trabajo de tesis, se eligieron como objeto de estudio tres FTs, dos de girasol (HaWRKY76 y HaWRKY10) y uno de arroz (OsWRKY47). HaWRKY76 le confiere a las plantas de Arabidopsis características agronómicas deseables en condiciones de crecimiento normales y mayor tolerancia al estrés por exceso o defecto de agua. Por otro lado, HaWRKY10 está involucrado en la acumulación y el uso de sustancias de reserva y tiene un papel en la germinación de las semillas. Por su parte, OsWRKY47 tiene un papel en la respuesta de las plantas IPT al estrés hídrico y en su mecanismo de respuesta hay al menos dos genes regulados de forma directa por este FT de transcripción. Esta caracterización funcional permitió obtener información relevante para la mejor comprensión de los mecanismos de respuesta de estas especies vegetales frente al estrés por exceso y falta de agua y sobre algunos aspectos del desarrollo. El resultado de estos estudios permitió postular a estas tres proteínas como potenciales herramientas biotecnológicas para el fitomejoramiento.