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Acinetobacter baumannii (A. baumannii) y ‘Candidatus Phytoplasma’ asteris (Fitoplasma) son dos patógenos con diferentes estilos de vida. Por un lado, A. baumannii es un patógeno nosocomial oportunista capaz de generar infecciones en pacientes inmunodeprimidos y gravemente heridos, y está asociado a infecciones de alta mortalidad. Las cepas aisladas de infecciones son generalmente resistentes a múltiples antibióticos y capaces de persistir en condiciones de hambreado severo y desecación. Se postula que dos de los mecanismos que esta bacteria utiliza como estrategia para la subsistencia son la motilidad y la capacidad de adherirse y formar biofilms sobre superficies bióticas y abióticas. En el presente trabajo de tesis se estudió la capacidad de regulación de diversos aspectos fisiológicos y moleculares de A. baumannii en función de la luz y la temperatura, utilizando técnicas biofísicas, de biología molecular y microbiología. Los resultados obtenidos indican que se detecta una temperatura crítica por debajo de la cual el fotorreceptor es funcional, por lo que habría dos niveles de control: la expresión del gen blsA y la fotoquímica de BlsA en función de la luz y la temperatura. Además, se muestra que estos procesos son reversibles. También se muestran resultados que indican que A. nosocomialis y A. sp. A47 son capaces de regular la motilidad en función de la luz y esto tiene una dependencia de la temperatura diferente a A. baumannii, pudiendo modular la motilidad en función de la luz incluso a temperaturas compatibles con hospedadores de sangre caliente. Esta capacidad de modular la motilidad a temperaturas moderadamente altas podría deberse a una dotación desigual de genes homólogos a blsA, cuyos productos génicos podrían tener estructuras que les permitan funcionar en otros rangos de temperaturas. Mostramos que el mensajero secundario diguanilato cíclico (c-di-GMP) estaría involucrado en la transducción de la señal lumínica y que A. baumannii cuenta con 11 genes putativos que codificarían por diguanilato ciclasas (DGCs) y Fosfodiesterasas (PDEs), enzimas responsables de su síntesis y degradación. Otro factor que participaría en la transducción de la luz es el producto del gen bof, el cual presenta un dominio de unión a oligonucleótido/oligosacárido. Este, actuaría como un regulador transcripcional de los genes involucrados en la formación de biofilms y su función dependería de BlsA. Por el contrario, el efecto del producto del gen bof en la motilidad sería a través de una molécula fotosensible distinta a BlsA y a temperaturas de 24° C y 37° C. Finalmente, mostramos que la modulación por luz observada para la susceptibilidad a antibióticos en cepas clínicas de A. baumannii se correlaciona con la modulación de los niveles de expresión de genes que codifican por componentes de dos bombas de eflujo capaces de expulsar tigeciclina (TIG), como AdeABC y AdeIJK. Esta modulación no dependería de BlsA y cursaría por medio de la generación de 1O2. Por su parte, Fitoplasma es un patógeno de plantas que produce efectos devastadores en más de 700 cultivos de alto y bajo interés agronómico, incluyendo varios destinados a la alimentación. Es un microorganismo endosimbionte obligado que se transmite a través de insectos del orden Hemiptera, por lo que son capaces de vivir en asociación con dos hospedadores diferentes. Cuando un insecto portador de fitoplasma se alimenta de la planta inyectando su estilete, deposita a la bacteria en ese compartimiento, donde se desarrolla y disemina. Fitoplasma tiene un genoma muy reducido y carece de muchos genes que codifican por componentes de vías catabólicas, por lo que se cree que la utilización del malato, abundante en el floema, puede ser la clave para la obtención de energía y poder reductor a través de la vía del malato. Utilizando técnicas bioquímicas y de biología molecular, en el presente trabajo de tesis se estudió la cinética de la enzima málica (EM) para comprobar su posible participación en la vía del malato y la regulación de su actividad por diversos metabolitos de dicha vía. Además, se evaluó la estructura cuaternaria y la importancia del residuo de Tirosina de la posición 36 que forma parte del sitio activo. También se evaluó la capacidad de la enzima PduL de participar en la vía del malato y la regulación de su actividad por diversos metabolitos de la vía. Los resultados indicaron que tanto la EM como la PduL tienen la capacidad de participar en la vía del malato para la obtención de energía y poder reductor, que sus actividades están reguladas concertadamente por unos pocos metabolitos (Glutamina, Glutamato y acetil-fosfato) y especialmente por el nivel energético de la célula representado por la relación ATP/ADP. También se vio que el residuo Tyr36 es fundamental para la actividad catalítica de la EM, pero no para la formación y mantenimiento de la estructura dimérica, la cual es especialmente interesante ya que este residuo en un sitio activo es aportado por un brazo proveniente del otro monómero. En el presente trabajo de tesis se ha logrado ampliar el conocimiento de diversos aspectos de estos dos patógenos con diferentes estilos de vida. A partir de la información generada en este trabajo se pueden proponer diferentes blancos de acción para combatirlos de manera de controlarlos y evitar así las infecciones que pueden producir.

Esta tesis se enfoca en el estudio de contaminantes magnéticos emitidos por las distintas actividades humanas: emisiones vehiculares e industriales mediante el uso de colectores de origen vegetal, tanto pasivos (líquenes sobre cortezas de árboles) como activos (trasplante de líquenes), y mediciones in situ de líquenes en la ciudad de Tandil en Argentina. Además, se evalúan las partículas magnéticas liberadas por las chimeneas de una coquera en la localidad de Ensenada, La Plata. El presente estudio de contaminantes se centra en la utilización de técnicas de magnetismo ambiental y el uso de biomonitores como herramienta de bajo costo y relativamente rápida para la identificación de áreas críticas en ciudades; asimismo, como complemento de las técnicas tradicionales en el monitoreo de la contaminación. Los estudios de magnetismo ambiental permiten determinar las variaciones en la mineralogía, concentración y tamaño de grano de los minerales magnéticos en un material, las cuales dan información sobre las fuentes y características de la formación del material. Si bien es de relevancia la caracterización magnética de los portadores, también lo es su relación con elementos potencialmente tóxicos, de allí su utilización para la investigación del impacto de contaminantes en distintos ambientes. El estado de contaminación atmosférica de diferentes ambientes suelen ser analizados usando técnicas y parámetros magnéticos, los cuales permiten su monitoreo. La utilización de técnicas magnéticas de monitoreo in situ permite conocer las propiedades de acumulación de elementos contaminantes de los biomonitores a utilizar, en este caso particular, Parmotrema pilosum, la distribución de los contaminantes sobre el espécimen y su variación en el tiempo. Además, la realización de mediciones in situ contribuye a la preservación de la especie y permite la evaluación de la contaminación ambiental en periodos cortos o prolongados. 14 En el Capítulo 1: Introducción, se realiza una descripción de los antecedentes en el área de estudio, los tipos de contaminantes, las fuentes y las relaciones con los minerales magnéticos. Además, se describe cómo el material particulado afecta a la salud humana y las propiedades magnéticas en la identificación de la contaminación ambiental. En el Capítulo 2: Métodos y áreas de estudio, en una primera parte se realiza una descripción de los parámetros magnéticos medidos directa e indirectamente, estudios termomagnéticos, y no magnéticos como microscopia de barrido electrónico. Además, se detallan los equipos utilizados. En la segunda parte, se describen las áreas de estudios de los diferentes trabajos: ciudad de La Plata y Tandil, y se detalla el diseño de muestreo. En el Capítulo 3: Biomonitores de la contaminación atmosférica, se diferencia entre un biomonitor y un bioindicador, además se describen distintos tipos de biomonitores (líquenes, hojas, Tillandsias y musgos), sus características principales y la utilización de biomonitores en problemas de contaminación atmosférica. En el Capítulo 4: Contaminación del aire causada por MP de origen industrial a partir de la producción de coque de petróleo en La Plata, se presenta el estudio de las propiedades magnéticas de muestras de residuos carbón emitidos de las chimeneas de una coquera y su dispersión con los vientos predominantes de la zona. En el Capítulo 5: Monitoreo magnético pasivo de la contaminación del aire en Tandil usando la especie Parmotrema pilosum, se presenta la investigación de la utilización de colectores pasivos (líquenes) y técnicas magnéticas para monitorear la contaminación del aire. Y se describe la determinación de las áreas de mayor concentración de minerales magnéticos y su relación con las fuentes de emisión de contaminantes. Finalmente, en el Capítulo 6: Monitoreo magnético in situ y activo utilizando la especie Parmotrema pilosum, se describe la técnica de trasplante de P. pilosum (monitoreo activo) y la realización de un monitoreo temporal de la calidad del aire en distintos sitios de Tandil. Además, se presenta un estudio innovador de mediciones magnéticas sobre líquenes Parmotrema pilosum sin recolectarlos y afectarlos, permitiendo la realización de monitoreos in situ.

Se admite que en el doblaje de azúcares y polialcoholes por cerimetria el que actúan es el anión cerato descartándose asi la vieja teoria sobre reacción Ce^+4 - Ce^+3 . Siendo los argumentos mas convincentes en favor de la teoria de ión cerato, la determinación del potencial de oxidación, que varía en un amplio margen según el ácido que se encuentra en el medio, y esto débase a la presencia de aniones complejos Cl6Ce^= , (S04)3Ce^= , (NO3)6Ce^= , (ClO4)6Ce^= . De los cuatro potenciales correspondientes a los sistemas anteriores, el que más se adecua para la determinación de manitol es el del sistema del nitrato cérico en medio nítrico que le corresponde un potencial de 1,44 volt. Como no se halló en la bibliografia consultada ninguna técnica en que aplicara el sistema anterior, se comenzó la parte experimental de este trabajo en el estudio de la técnica para efectuar las determinaciones. Para la obtención de ésta última se siguió un esquema general en el que habia que fijar tres variables: tiempo, temperatura y acidez del medio; aparte de otros detalles tales como elección del indicador y estabilidad de éste en las condiciones en que se realiza la determinación. En base a los datos obtenidos experimentalmente se llegó a la siguiente técnica: 1- En un Erlenmeyer colocar 50 mL de la solución de manitol a valorar, luego agregar 2,5 mL de NO3H concentrado y finalmente 10 mL de la solución de nitrato dcérico en medio nítrico. 2- Colocar en baño maria a 50°C durante 1 hora. 3- Retirar, agregar 2 gotas de o-fenantrolina ferrosa y titular con solución valorada de S04Fe, efectuandose esta titulación a 50°C también. Como la sustancia utilizada (Nitrato cérico amónico) es de elevado precio y de dificil obtención en el mercado, hubo necesidad de recuperar el cerio utilizado en las titulaciones. Para éste fin se debió estudiar una marcha, en base a las propiedades químicas de las sales de cerio, y que se describirá a continuación: 1- Concentración de los líquidos provenientes de las titulaciones. 2- Precipitación con ácido oxálico a pH 3 a 4. 3- Calcinación del precipitado a 700°C y posterior tratamiento con SO4H2 concentrado. 4- Disolución del sulfato cérico formado en agua destilada y posterior precipitación como Ce(OH)4 con amoniaco. 5- Disolución del precipitado anterior en ácido nitrico concetrado y mediante el agregado de NO3NH4, se produce la formación de nitrato cérico amóniaco. El método utilizado actualmente para la determinación del manitol es el de Nalaprade, que utiliza ácido periódico, tomando los datos obtenidos por ese método como base para controlar la exactitud del método que emplea el nitrato cérico en medio nitrico y que se describirá a continuación: 1- Pesar 2 g de alga molida seca, y efectuar una extracción en alcohol metílico, calentado a reflujo durante 24 horas. 2- Evaporar el metanol a baño maria y terminar el secado en estufa a 100°C durante 30 horas. 3- Disolver el residui seco en 35 mL de agua destilada, lavando el papel de filtro con agua destilada. Llevar el filtrado a volumen de 50 mL. 4- Tomar 5 mL de la solución anterior, llevar hasta 50 mL con la técnica para determinación de manitol. Se efectuaron numerosas determinaciones con diversas variantes hasta la obtención de este método, llegandose a la conclusión de que el dosaje de manitol por cerimetria siguiendo la tecnica descripta anteriormente, es muy exacta.

Los microARNs son reguladores post-transcripcionales de la expresión génica que participan en la regulación de distintos procesos celulares como por ejemplo en el desarrollo embrionario. En el presente trabajo estudiamos el perfil de expresión de los microARNs durante la diferenciación a mesodermo temprano y al linaje cardíaco mediante secuenciación masiva de los ARN pequeños. A partir de estos resultados determinamos que hay aproximadamente 700 micro- ARNs que se expresan diferencialmente en las células pluripotentes humanas, un progenitor temprano de mesodermo y cardiomiocitos. A su vez, analizamos la presencia de variantes de microARNs llamados isomiRs y determinamos la abundancia de las distintas isoformas en las distintas poblaciones celulares. A partir del análisis in silico de los genes target determinamos que estas isoformas amplían el repertorio de genes regulados por el microARN canónico, lo cual sugiere un rol funcional de los isomiRs durante el proceso de diferenciación celular. Por otro lado, analizamos el miRNoma de cada una de las tres poblaciones celulares en base a las familias y clusters de microARNs e identificamos que los microARNs de dichos grupos comparten un perfil de expresión y colaboran entre sí en la regulación de procesos relacionados con el desarrollo embrionario. Además, establecimos el miRNoma de los cardiomiocitos mediante la comparación de los microARNs que se expresan en otros tipos celulares. Finalmente, estudiamos el cluster C19MC, up-regulado en las células pluripotentes, y analizamos de manera in silico y experimental los genes target de dicho cluster. De esta manera, determinamos que el C19MC participa en la regulación del ciclo celular y de distintos procesos de diferenciación en el desarrollo embrionario. Por último, estudiamos el miR-205 en la diferenciación a mesodermo e identificamos que su sobreexpresión aumenta al doble el porcentaje del progenitor temprano de mesodermo. Los microARNs ejercen su función formando complejas redes de regulación, lo cual requiere de un análisis más global para poder entender mejor el rol que estos pequeños ARN tienen en las células. Nuestros resultados expanden el conocimiento de los microARNs en relación con el desarrollo cardíaco.

La producción de limón en Argentina superó, a fines de la década del 90, el millón de toneladas, destinándose el 77 % de la misma a satisfacer las necesidades industriales. La cáscara de limón o mesocarpio, que representa más del 40 % de la fruta, no es aprovechada industrialmente sino comercializada directamente como producto deshidratado. La tercera parte de los sólidos del mesocarpio está constituido por sustancias pécticas, un producto que tiene un atractivo comercial fundamentado en sus propiedades reológicas y que ha promovido el interés en su utilización de industriales conserveros, lácteos y aún cosmetólogos. En este trabajo se propone una alternativa tecnológica de obtención de pectina en polvo, que involucre la utilización de los procesos de membrana en la concentración del extracto pectínico y la deshidratación posterior por atomización. Para ello se plantea como objetivo evaluar las variables de proceso involucradas en la obtención de pectina cítrica, incluyendo ensayos reológicos del producto deshidratado obtenido. En el proceso de concentración por ultrafiltración se determinó, en primer lugar, la resistencia intrínseca de la membrana resultando ésta de 3 * 10 13 m-1. En segundo lugar se evalúa la influencia del factor de concentración y la temperatura en la variación del flujo de permeado instantáneo y la presión transmembrana. Las representaciones están dadas por regresión logarítmica y lineal respectivamente, cuyos factores independientes aumentan con la temperatura. Por último es recomendable avanzar en la modelización del procesos de ultrafiltración.

Se sabe que los compuestos derivados del cromo, considerados contaminantes ambientales importantes, son altamente tóxicos y reconocidos agentes carcinogénicos debido a su alto grado de mutagenicidad [4]. Su capacidad para actuar como agente oxidante sobre biomoléculas, es la responsable de la mutagenicidad y carcinogenicidad del CrVI. Si bien la especie CrVI, no produce daño en el ADN in vitro, en ausencia de agentes reductores, se cree que la especie mutagénica sería alguno de los intermediarios reactivos tales como las especies CrV y CrIV producidas durante la reducción del CrVI a CrIII. Teniendo en cuenta todas estas posibles especies intermediarias, se ha postulado que la reducción de CrVI ocurre mediante un mecanismo complejo. Para probar esta hipótesis, se deben identificar y caracterizar tanto los productos como los intermediarios del proceso. Resultan de gran interés los hidratos de carbono o sus derivados, presentes en el medio celular vegetal y/o animal, tales como D-ribosa, D-galactosa, D-glucosa y ácido Dglucurónico, los cuales podrían reaccionar con el CrVI, luego de su ingreso al citoplasma, estabilizándolo mediante la formación de complejos y/o actuando como agentes reductores, generando en el proceso redox, especies reactivas que produzcan daño celular. El presente trabajo de tesis pretende profundizar el estudio del proceso de transferencia electrónica entre el elemento cromo hipervalente y los diferentes grupos funcionales presentes en hidratos de carbono de importancia biológica; analizar la capacidad de coordinación y reactividad a partir de los diferentes estados de oxidación del elemento cromo (CrVI/V/IV/III), y finalmente integrar los resultados obtenidos, en la interpretación del proceso redox, cromo hipervalente - hidrato de carbono. Para concretar estos objetivos, se realizaron distintas acciones, que incluyen: Un estudio de la oxidación con cromo hipervalente de los sustratos, D-glucoheptono-1,4-lactona, ácido D-galacturónico y ácido D-glucárico. Un estudio de la reactividad del CrIV frente a los diferentes hidratos de carbono (neutros y ácidos) para determinar si el proceso oxidativo por esta especie, siempre se encuentra o no, involucrado en etapas rápidas de reacción. Se compararon los resultados obtenidos con los sustratos empleados en estudios anteriores [52-62] para lograr una interpretación más profunda del mecanismo de reacción redox. Los resultados obtenidos, permitieron llegar a las siguientes conclusiones: Los sistemas CrIV/sacáridos neutros y CrIV/sacáridos ácidos, responden a la misma ley de velocidad experimental, con la diferencia de que en el caso de oxidación de sacáridos neutros el proceso es independiente de la acidez del medio de reacción. El orden de reactividad determinado para sacáridos neutros fue: 1-metil-α-D-glucopiranosa << 1-metil-α-D-galactopiranosa ~ 3-O-metil-Dglucopiranosa ~ 6-desoxi-L-galactopiranosa ~ 2-desoxi-D-glucopiranosa ~ Dglucopiranosa << D-galactopiranosa << D-glucitol. Los valores de velocidad de oxidación de sacáridos por la especie CrIV confirman que las mismas son muy superiores a las velocidades de oxidación de las especies de cromo hipervalente CrVI o CrV con los sustratos orgánicos empleados. Los cálculos realizados para obtener los valores de los parámetros de activación para los sacáridos D-glucopiranosa y D-galactopiranosa, indicaron que el proceso oxidativo por la especie CrIV ocurre a través de un mecanismo concertado de reducción bielectrónica CrIV→CrII mediante la transferencia de hidruro. Los estudios de RPE en solución acuosa de los sistemas CrVI/GHL, CrVI/ Galur y CrVI /Glucar, determinaron la presencia de complejos oxo-CrVsacárido, los que pudieron ser caracterizados, con la determinación de sus tiempos de vida media. El estudio de la oxidación por CrVI de Galur, GHL y Glucar, verificó la presencia de especies intermediarias en las mezclas de reacción CrVI/sacárido, que incluyen radicales libres orgánicos, esteres de CrVI, especies: CrIV/II y oxo-CrV-sacárido. Las especies oxo-CrV-sacárido deben considerarse en la interpretación de los datos cinéticos solo en los sistemas CrVI/Galur y CrVI/GHL. Al comparar las velocidades de reacción de las diferentes especies del elemento cromo con los sacáridos estudiados, incluso a baja temperatura, el CrIV reacciona más rápido que las especies CrV y CrVI, indicando que este intermediario se encuentra involucrado en etapas rápidas y no se acumula en las mezclas de reacción. Por ello no fueron considerado en el ajuste de los datos cinéticos. En base a los datos experimentales y los resultados obtenidos en este trabajo de Tesis, se concluye: Opera el mismo mecanismo de oxidación por CrIV en medio ácido, para todos los sacáridos estudiados, el cual consiste en una reducción bielectrónica CrIV a CrII por transferencia de hidruros provenientes del sustrato orgánico. La reducción de CrVI a CrIII por parte de los ligandos orgánicos estudiados; no ocurre en una sola etapa, sino que tiene lugar en varias etapas de reducción que involucran vías de reducción: mono y bielectrónicas, confirmando experimentalmente, los estudios cinéticos y mecanísticos de oxidación crómica de hidratos de carbono previamente realizados en el grupo de investigación donde se realizó el presente trabajo de Tesis Doctoral. El proceso de oxidación por la especie CrIV siempre se corresponde con una etapa rápida.