Catálogo de publicaciones

Carrica, M. C. (2008). Caracterización estructural y funcional del factor de virulencia IivA de Brucella abortus (Tesis de Doctorado). Universidad Nacional de Quilmes, Bernal, Argentina

. subtilis se adapta rápidamente a disminuciones de temperatura mediante un mecanismo denominado vía Des, el cual es controlado por el sistema de dos componentes DesK/DesR. El termosensor DesK es el encargado de detectar cambios en la temperatura ambiental y regular la transcripción del gen des que codifica para una Δ5 acil lípido desaturasa, la cual genera insaturaciones en los ácidos grasos de los fosfolípidos de la membrana plasmática modificando la fluidez de la misma. En este trabajo de tesis nos propusimos estudiar los eventos moleculares que tienen lugar en los segmentos transmembrana (TM) de DesK durante la detección de la señal de temperatura. La estrategia inicial que decidimos aplicar es la marcación de spin sitio-dirigida y posterior medición por resonancia paramagnética electrónica (EPR). Dicha estrategia implica la unión de una sonda de spin a residuos de cisteína ubicados en diferentes posiciones de los segmentos TM, para estudiar la dinámica de los mismos en membranas artificiales. Este procedimiento requiere de la purificación de las proteínas en estudio a homogeneidad. Hasta la escritura de esta tesis, los estudios in vitro de DesK completa requerían de la utilización de un sistema de expresión in vitro. Aunque el sistema libre de células ha demostrado ser adecuado para la expresión de DesK, el mismo es muy costosos para ser usado de forma rutinaria. Por este motivo, en una primera instancia nos enfocamos en desarrollar un protocolo que permitiese purificar DesK a partir de cultivos bacterianos, en concentración y pureza suficientes para estudios biofísicos posteriores a un costo reducido. Con este fin, ensayamos diversas estrategias para la expresión y purificación de DesK, incluyendo diferentes vectores de expresión, medios de cultivo, condiciones de crecimiento para la expresión proteica, detergentes para la solubilización de las proteínas de membrana y diversas técnicas cromatográfícas. En función de los resultados obtenidos planificamos un protocolo que permitirán purificar DesK a homogeneidad en micelas de detergente. Resultados posteriores mostraron que la integración de DesK en liposomas permite incrementar la pureza de la misma, indicando que sería posible realizar la marcación con la sonda de spin de las proteínas purificadas en detergente, y posteriormente reconstituir las mismas en liposomas para las subsiguientes mediciones por EPR. Por otra parte, a partir de un análisis informático de covariancia de residuos identificamos pares de aminoácidos con alta probabilidad de interaccionar, ya sea por su cercanía en la estructura cuaternaria, o a través del esqueleto peptídico de DesK. En función a estos resultados seleccionamos posiciones de los segmentos TM que próximamente se reemplazarán por cisteínas, generando variantes de DesK con mutaciones puntuales, para su posterior marcación con la sonda de spin y mediciones de EPR. Estos experimentos ermitirían obtener información estructural y dinámica de los segmentos TM durante la detección de la señal de temperatura. En base a predicciones de estructura secundaria junto con el análisis de las estructuras cristalográficas de la porción catalítica soluble de DesK (DesKC) en distintos estados funcionales, identificamos un motivo de hélices enrolladas (2-HCC) que conecta el dominio TM sensor y el dominio catalítico soluble. La construcción de dos variantes de DesK en las cuales se estabilizó (DesKSTA) o desestabilizó (DesKDEST) el dominio 2-HCC mediante mutaciones puntuales permitió determinar que este motivo juega un rol importante en la regulación de las actividades catalíticas de DesK. Además, de acuerdo con medidas de actividad in vitro de DesK salvaje y DesKSTA insertadas en liposomas, y a ensayos de dinámica molecular de modelos atómicos de DesK salvaje, DesKDEST y DesKSTA, se propuso que en el estado fosfatasa las hélices del segmento TM5 podrían continuar formando un 2-HCC a través de toda la membrana, y que la hidratación de este motivo podría favorecer la apertura del mismo durante la transición al estado auto-quinasa. Por otra parte, se construyeron modelos del estado fosfatasa y auto-quinasa de una quimera funcional de DesK (MS-DesK), la cual posee un único segmento TM por monómero, generado por la fusión de los 17 residuos N-terminales de DesK a los 14 residuos C-terminales del TM5 de DesK. En función a ensayos de dinámica molecular de estos modelos embebidos en bicapas lipídicas de diferente espesor, se propuso un modelo para la detección y transmisión de la señal de temperatura por parte de MS-DesK. En este modelo, a 37 ºC la membrana se encuentra fluida y delgada, y MS-DesK adopta una conformación fosfatasa competente, caracterizada por el enrollamiento de las hélices TM formando un 2-HCC que se prolonga hacia el dominio citoplasmático. Los residuos polares del extremo N-terminal de los segmentos TM se encuentran hidratados debido a la apertura del 2-HCC generada por la bisagra formada entre Gly13 y Pro16, y los dominios de unión a ATP (ABDs) interaccionan fuertemente con el dominio de dimerización y fosforilación de histidina (DHp). Frente a una disminución de la temperatura, la membrana pierde fluidez y se ensancha, generando un movimiento de tijera en el N-terminal de los segmentos TM, favoreciendo la deshidratación de los residuos polares. Los segmentos TM sufren un estiramiento debido al cierre del extremo N-terminal y al segmento citoplasmático KERER que permanece anclado en la interface lípido-agua citoplasmática. Este estiramiento promueve la rotación de las hélices que a su vez provoca el desenrollamiento de los segmentos TM y del 2-HCC. El desenrollamiento estaría favorecido por la hidratación de los residuos polares que se orientan hacia el núcleo del CC. Esta rotación se transmite al DHp, que ahora esconde los residuos hidrofóbicos que le permitían interaccionar con los ABDs. Finalmente, los ABDs quedan libres favoreciendo el estado auto-quinasa competente.

Prosopis alba, P. chilensis y P. flexuosa "algarrobos", características en las regiones fitogeográficas del Chaco y Monte, Argentina, constituyen un recurso natural con innumerables aplicaciones. Si bien el progresivo avance de la desertización ha puesto en riesgo a estas comunidades vegetales, es indudable que en la actualidad constituyen una fuente inagotable de productos y subproductos. A partir del estudio de los caracteres estructurales (micro, ultra, nano), propiedades funcionales y color de los frutos y harinas de P. alba, P. chilensis y P flexuosa, se desarrolló un proceso de secado, molienda y mezcla. Se analizaron y discutieron las observaciones con microscopio óptico (MO), microscopio electrónico de barrido ambiental (MEBA) y con campo de emisión (FESEM), microscopio electrónico de transmisión (MET) y microscopio de fuerza atómica (MFA). Se caracterizaron las harinas de las distintas especies en función de la granulometría, la capacidad de absorción de agua, la capacidad de absorción de aceite, la solubilidad y el color. La investigación permitió optimizar el proceso, elaborar harina enriquecida con proteínas a partir de P. chilensis y proponer una mezcla de fácil formulación. El estudio constituye un aval para lograr la incorporación de P. chilensis al Código Alimentario Argentino.

Tesis (Grado Doctor en Ciencias Biológicas)--Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales. Lugar de Trabajo: Facultad de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales-CONICET-Universidad Nacional de Córdoba: 2015 - 325 h. + CD. ils. col.; grafs.; tabls.; figuras. Contiene Referencia Bibliográfica y Publicaciones Derivadas de la Tesis. Abstract en español e inglés.

Los Camélidos Sudamericanos domésticos constituyen el recurso zoogenético primario y, muchas veces, la única actividad productiva del ecosistema altiplánico. En la Provincia de Tacna, Perú, el sistema productivo consiste en praderas de pastoreo común de pequeñas tropas. Allí, una deficiente gestión del recurso ganadero y un deterioro de la calidad de fibra han puesto en riesgo la sostenibilidad del sistema. Para desarrollar estrategias futuras que permitan revertir este proceso se llevó a cabo un relevamiento de tropas. El objetivo de este trabajo se centró a realizar la caracterización etnozootécnica de las poblaciones de Camélidos domésticos de las comunidades. Para esto, se relevaron dos comunidades según la metodología de estructura poblacional. Por cada sujeto se registraron características morfológicas; además, se tomaron muestras de vellón, las cuales fueron posteriormente analizadas en el laboratorio para definir tipo de vellón, color y diámetro de fibra. Los datos obtenidos fueron resumidos y descriptos estadísticamente mediante tabla de frecuencia, test Chi-cuadrado y Análisis multivariante. En total, fueron relevados 2051 animales, provenientes de tropas entre 60 a 280 alpacas, llamas y huarizos, en forma conjunta. En promedio, 78,68 % fueron del biotipo alpaca Huacaya, 54,39 % en edad adulta y 76,97 % hembra; estos sujetos productivos se caracterizaron por tener oreja mediana, oreja en forma de v, cobertura de pata intermedia y perfil nasofrontal recto fundamentalmente. Los patrones pigmentarios, por su parte, se mostraron en diferentes frecuencias; las variantes cara negra, tapado claro, tapado oscuro y silvestre fueron medianamente frecuentes, mientras que negro y rojo (dóberman), raya de mula y panza negra fueron muy raros. En promedio, del 45,89 % de los animales no se identificó algún patrón pigmentario. Con respecto a los diseños de mancha, el 39,85 % de los fenotipos del color de vellón correspondió a la variante mancha total, seguido de ausencia de mancha con 21,76 %. Las variantes de manchas irregulares, marca, pintado y regular tuvieron una incidencia menor. Con respecto a las clases de color, la categoría crudo alcanzó 56,42 % y otros como terra, camel, gris y grafito con frecuencias de 17,84 % a 4,60 %, respectivamente. El tipo de mecha simple capa fue el más frecuente (77,85 %) y la doble capa con 11,83 %. Las categorías de fibra fina y superfina sumaron la frecuencia de 70,35 %. El diámetro medio de mecha, ponderado a partir de clases de finura, estimó 24,30 micras. La prueba de homogeneidad de proporciones de las variantes y la hipótesis de independencia según tropa, resultaron en diferencias altamente significativas. En cambio, la hipótesis de independencia según comunidades tres variantes resultaron con p-valor mayor o igual que 0,05 y el restante con p=0,0001. En forma general, esto implica que las diferencias entre las frecuencias de las variantes observadas dependen de la comunidad y tropa; excepto edad, uñas pigmentadas y forma de oreja, con diferencias no significativas. Por otra parte, la dispersión de las variantes del presente estudio ha sido explicada en 51,30 % por los primeros dos componentes principales. El primero agrupó a las variantes morfológicas de los animales y del vellón, mientras que el segundo a la pigmentación del vellón. Son ocho las características morfológicas con correlación directa y alta, incluida biotipos, estas separan a las especies alpaca y llama; además, la presencia o ausencia del pigmento en la piel y vellón también diferencia a los sujetos productivos. En la población relevada la alpaca presenta una tendencia a color ausente de mancha y blanco total (color uniforme); en cambio, la llama refleja la tendencia a fenotipos con diseños de manchas y patrones pigmentarios, estos determinan la oferta de individuos productivos y las características de la producción de fibra.

En el territorio argentino persisten aún poblaciones autóctonas y/o locales de ovinos, caprinos y llamas denominadas genéricamente como “criollas” y que son básicamente productoras de fibra. Existen evidencias de que dichos recursos genéticos conservan una gran variabilidad de sus características etnozootécnicas y por tanto gran primariedad o arcaísmo con un potencial textil importante de la fibra. Se realizó una caracterización etnozootécnica de dichas poblaciones en diferentes cuencas del territorio nacional. La misma implicó, en primer lugar, la descripción de sus atributos; para ello se calcularon frecuencias poblacionales de los caracteres etnozootécnicos relevados y se analizaron sus interrelaciones. En segundo lugar, implicó realizar la cuantificación de su estado de primariedad mediante la confección y evaluación de diferentes índices basados en marcadores fenotípicos. Finalmente, determinar el potencial textil de la fibra, para lo cual se la clasificó y tipificó en base a criterios de calidad y analizando los posibles usos y destinos textiles de los diferentes tipos de fibra que surgieron. Se realizó un estudio demográfico mediante la metodología de «estructura poblacional», realizando relevamientos de diferentes características etnozootécnicas de los animales incluida la obtención de muestras de vellón. Se relevaron, en la Provincia de Córdoba, 2 140 ovinos de un total de 4 868 pertenecientes a 66 majadas y 10 cuencas de producción. En el norte de la Provincia del Neuquén, se relevaron 2 396 caprinos de un total de 10 049 pertenecientes a 37 hatos y 6 cuencas de producción. En la Provincia de Jujuy, se relevaron 10 973 llamas de un total de 17 022 pertenecientes a 173 tropas y 9 cuencas de producción. Las características del diseño del estudio demográfico permitieron realizar una primera descripción de las poblaciones en estudio en base a estimaciones con buen nivel de confianza. Las distribuciones de frecuencia de los diferentes caracteres etnozootécnicos estudiados y las relaciones entre los mismos confirman la existencia de una gran variabilidad pero a la vez permiten afirmar la existencia de un biotipo productor de fibra en las tres especies. Ello se ve reflejado en la existencia de importantes frecuencias de variantes compatibles con la producción de fibra, tanto en los caracteres de cobertura, de morfología y de fenotipos de color como en las características propias de la fibra. También esto se ve reflejado en la existencia de marcadas relaciones entre algunos de dichos caracteres. Estas asociaciones determinan que existen tipos de animales predominantes y que no cualquier variante es producida por cualquier tipo de animal. Los índices de primariedad calculados en el presente estudio permitieron medir la variabilidad encontrada en las tres poblaciones estudiadas y determinar la situación etnozootécnica de las mismas. En ovinos, si bien se hallaron majadas que conservan aún un estado de primariedad, se observa un proceso de estandarización marcado y en forma generalizada por la introducción de biotipos más evolucionados. En caprinos, si bien se observaron diferencias de primariedad en cuanto a la ubicación geográfica y los biotipos encontrados, serían los surgidos de un proceso de adaptación a las condiciones climáticas y agroecológicas. En Camélidos, dentro del estado de primariedad generalizado, existe un incipiente proceso de estandarización en la cuenca de producción de Cieneguillas, dado por la selección de determinadas características. El producto zoógeno estudiado (fibra) también registró una importante variabilidad, encontrándose diferencias en las proporciones de las categorías de todos los criterios de clasificación y gran cantidad de tipos de fibras. A su vez, tales diferencias dependen del área geográfica de la cual proviene la fibra. La determinación de las categorías de finura de fibra de la mano del diámetro medio de la misma permite identificar y establecer diferentes usos y destinos del producto. En ovinos, a pesar de que la mayoría de los lotes a obtener no serían finos, reúne requisitos para su uso potencial en tapicería. En tanto en caprinos y Camélidos, donde se encontrarían mayoritariamente lotes finos, la fibra reúne los requisitos para su uso en la confección de prendas de vestir de calidad. La gran heterogeneidad de la fibra requiere de su correspondiente clasificación a los fines de obtener lotes comerciales homogéneos, permitiendo predecir el destino y el precio de los lotes a obtener y la confección de mezclas.

El ácido γ-aminobutírico (GABA) es el principal neurotransmisor inhibitorio del sistema nervioso central de vertebrados y hasta el momento se han caracterizado tres tipos de receptores de GABA, según sus propiedades farmacológicas: GABAa, GABAb y GABAc. Los receptores de GABAa (GABAaR) y GABAc (GABAcR) comparten además su mecanismo de señalización, ambos son receptores ionotrópicos con una alta permeabilidad a iones cloruro. Los receptores de GABAb son metabotrópicos, generalmente acopladas a proteínas G. En esta tesis se presenta una extensa caracterización de las propiedades farmacológicas y biofísicas de los receptores de GABA, con especial énfasis en los GABAcR Este subtipo de receptores de GABA fue el último en ser identificado y se caracteriza por su insensibilidad al antagonista clásico GABAérgico, bicuculina y por el lento curso temporal de sus respuestas. Este trabajo se realizó expresando los receptores en ovocitos de Xenopus laevis y estudiando sus propiedades con dos diferentes técnicas electrofisiológicas: fijación de voltaje con dos electrodos (FVDE) y patchclamp en la configuración outside out. Los receptores ionotrópicos de GABA (GABA-R) son modulables por una diversidad de compuestos de diferente naturaleza química. Entre ellos se encuentran los flavonoides (F), una familia de compuestos aislados de plantas vasculares que presentan una gran variedad de acciones neurofarmacológicas. Algunos son ansiolíticos y sedantes, y se ha propuesto que su mecanismo de acción sería a través de los GABAaR. En este trabajo, evaluamos la acción de un grupo de F sobre las respuestas mediadas por GABA-R. Los F utilizados en este trabajo fueron: quercetina, crísina, apígenina, morina, flavona y α-naftoflavona. Contra lo esperado, los F evaludados tuvieron un efecto inhibitorio general tanto sobre los GABAaR como los GABAcR. Quercetina fue el más potente para ambos receptores con un IC50 de aproximadamente 4 µM en cada caso. También se evaluó la acción de quercetina en otros receptores ionotrópicos de neurotransmisores, como los colinérgicos nicotínicos, serotonina y kainato. En todos ellos se observaron efectos inhibitorios con distinta potencia. Tanto los GABAaR como los GABAcR son sensibles al alcaloide picrotoxina. Se han propuesto distintos mecanismos para su acción sobre los GABAaR incluyendo efectos no-competitivos y mixtos. Sin embargo, aún no se ha esclarecido suficientemente el mecanismo de acción en los GABAcR. Picrotoxina produjo una inhibición reversible con un IC50 = 0.6 ǂ 0.1 µM. La curva dosis-respuesta (D-R) para GABA en presencia del antagonista (1, 10 y 100 µM) sufrió un desplazamiento hacia la derecha y para las concentraciones más altas de esta toxina, una reducción en la respuesta máxima. Este resultado sugeriría un mecanismo de acción de tipo no-competitivo. No obstante, al igual que los antagonistas competitivos, las respuestas a concentraciones bajas de GABA fueron más sensibles a picrotoxina que las más altas. La inhibición por esta toxina fue también dependiente del uso, es decir, requirió la activación de los receptores para ejercer su efecto. La recuperación de la inhibición también fue facilitada por la acción de GABA. Además, picrotoxina produjo un aumento en la velocidad de de-activación de las respuestas al GABA, sugiriendo un mecanismo de tipo no-competitivo. En resumen, la inhibición de los GABAcR por picrotoxina tendría un mecanismo de acción no-competitivo o mixto, y dependiente del uso aunque menos que los GABAaR. Los GABAcR son sensibles a la modulación por iones trivalentes de la serie de los lantánidos (L) que producen un incremento en las respuestas a GABA. En un estudio previo se caracterizó la acción de uno de los elementos pertenecientes a los L, lantano (La³+); mientras que en este trabajo se analizaron los efectos de otro, lutecio (Lu³+). Ya en experimentos preliminares, se observó que la acción de Lu³+ sería más compleja ya que produjo un aumento rápido de la corriente, seguido de una atenuación durante la aplicación del ión sobre la respuesta a GABA. Lu³+ provocó una aumento en la afinidad aparente por GABA (0.4 ǂ 0.1 µM) y un incremento en la respuesta máxima a concentraciones saturantes de agonista. También se evaluó cómo afectaba la presencia de Lu³+ a la acción de ciertos antagonistas, como parámetro de la función de los GABAcR. El antagonista competitivo, TPMPA, inhibió las respuestas evocadas por GABA en presencia de Lu³+ con una potencia semejante a lo observado en ausencia de este ión. No obstante, no tuvo un efecto protector de la atenuación de la respuesta mediada por Lu³+, sugiriendo que este proceso sería operado por este ión independientemente de GABA. Las respuestas evocadas en presencia de Lu³+ también fueron sensibles a picrotoxina pero con caracteristicas diferentes a lo ya descripto. Se elaboró, además, un modelo de gating de los GABAcR y de la acción de Lu³+, donde se propone la existencia de dos estados abiertos, revelado por la presencia de este ión, que además mediaría un proceso de desensibilización independiente de GABA. Los estudios existentes sobre la cinética de los GABAcR fueron hechos con técnicas de pobre resolución temporal, y por esto decidimos realizar esta serie de experimentos en parches de membrana con la técnica de patch-clamp en la configuración outside out. Las respuestas al GABA obtenidas con esta metodología presentaron un curso temporal característico de los GABAcR: activación y de-activación lentas, de varios segundos de duración, con escasa desensibilización. La afinidad aparente por GABA calculada fue 4.0 ǂ 0.8 µM con un n de Hill = l.7 ǂ 0.5. La relación corriente-voltaje fue lineal, y el canal mostró una permeabilidad alta a cloruro. Se evaluó la sensiblidad de los GABAcR en parches de membrana a una serie de agonistas (TACA, β-alanina, glicina), antagonistas (TPMPA, picrotoxina, quercetina, zinc) y moduladores (La³+ y Lu³+) conocidos. Todos estos produjeron efectos similares al descripto previamente. Un estudio más profundo de la cinética de de-activación de las respuestas mostró que a concentraciones altas de agonista, la relajación era mejor descripta por ecuación de decaimiento exponencial de segundo orden; mientras a dosis cercanas al EC50,de primer orden. Esto sugeriría un modelo de gating con dos estados abiertos con distinta cantidad de moléculas de agonista unido, que fue evaluado realizando simulaciones numéricas de la actividad del receptor.

En este trabajo se presenta una extensa caracterización del receptor colinérgico nicotínico α9, utilizando el sistema de expresión heteróloga de ovocitos de Xenopus laevis. Durante la mayor parte del desarrollo del mismo se tuvo como hipótesis de trabajo que α9 sería la única subunidad integrante del receptor colinérgico nativo de las células ciliadas externas de la cóclea y de las células tipo II del aparato vestibular. Este receptor es responsable de la inhibición de la actividad de dichas células, mediada por la inervación colinérgica eferente coclear y vestibular. En 2001 se identificó y clonó una nueva subunidad de receptores nicotínicos, α1O. Esto condujo a modificar la hipótesis de trabajo, para incluir la posibilidad de un receptor heteromérico α9αl0 en las células ciliadas, pero sin excluir la posible existencia del receptor homomérico α9 en otros tipos celulares. La caracterización del receptor homomérico recombinante α9 incluyó el estudio de las propiedades farmacológicas del mismo. En particular, se demostró que a pesar que α9 es un miembro de la familia de genes de subunidades de receptores nicotínicos, el receptor no puede ser clasificado farmacologicamente como nicotínico o muscarínico y presenta un perfil farmacológico mixto, en coincidencia con lo reportado para el receptor nativo de las células ciliadas. Se mostró que tanto agonistas colinérgicos no específicos como la acetilcolina y el carbacol, agonistas nicotínicos como el metilcarbacol, la suberildicolina y el DMPP y agonistas muscarínicos como la oxotremorina - M, el metilfurtretonio y el McN-A-343 son capaces de activar al receptor α9. También la colina, un producto de degradación y precursor en la síntesis de la acetilcolina, activó al receptor α9. Notablemente, agonistas nicotínicos clásicos como la epibatidina, la nicotina y la citisina bloquearon al receptor α9 (IC50 : 1.6±0.l, 31.5±l.0 y 43.1±3.5 µM, respectivamente). Se estudió la sensibilidad de α9 a diversos antagonistas nicotínicos. En particular la metillicaconitina, un antagonista selectivo de receptores nicotínicos neuronales sensibles a la α-bungarotoxina, inhibió las respuestas de α9 a la acetilcolina en forma competitiva (IC50 : l.l±0.2 nM), siendo este el antagonista más potente de α9 hasta ahora reportado. Se demostró también que el receptor α9 es bloqueado tanto por agonistas como por antagonistas muscarínicos con el siguiente orden de potencia: atropina (IC50: l.0±0.1µM, ) ~ galamina (IC50: 1.5±0.2 µM) > pilocarpina (IC50: 76±9 µM) ~ muscarina (IC50: 84±6 µM) ~ betanecol (IC50: 105±14 µM), un rango de concentraciones comparable con las requeridas para el bloqueo producido por compuestos nicotínicos. Por otra parte, se demostró la inhibición de la respuesta a acetilcolina de los receptores α9 y α9α10 por morfina y péptidos opioides. Estos péptidos estarían presentes en la inervación eferente a las células ciliadas del aparato vestibular y modularían su actividad a través de su acción sobre α9αl0. Se demostró también que el receptor homomérico α9 es bloqueado por Ca++ extracelular (IC50: 100±10 µM a -70 mV), en forma dependiente del potencial de membrana. Este resultado es relevante para la fisiología de las células ciliadas. Mediante la construcción de una subunidad quimérica entre α9 y el receptor de serotonina de tipo 3A, se aportó evidencia de que el dominio aminoterminal de α9 es el determinante estructural de la interacción de α9 con agonistas y antagonistas. También se construyó una subunidad quimérica mediante el empalme de porciones de las subunidades α7 y α9. Los resultados obtenidos con las dos quimeras mencionadas, indican que los determinantes estructurales de la particular relación corriente - potencial de α9 (relacionada con la presencia de Ca++ extracelular), estarían confinados a la región que se extiende desde el comienzo del segundo segmento hidrófobo, supuestamente transmembranal, hasta el extremo carboxiterminal. Se identificó un residuo en el segmento hidrófobo M2 (Q261) involucrado en la rectificación de la corriente y en el bloqueo por el Ca++. En suma, el presente trabajo demuestra que el receptor α9 presenta una farmacología mixta nicotínica - muscarínica coincidente con la del receptor colinérgico de las células ciliadas. Esta coincidencia incluye también la sensibilidad de los receptores que contienen la subunidad α9 a péptidos opioides y a cationes divalentes. Por otro lado aporta evidencia de la importancia clave del dominio aminoterminal en determinar características farmacológicas de α9 y del segundo segmento hidrófobo en las propiedades del canal de los receptores α9 y α9α10.

El Ca²+ juega un papel preponderante en la regulación de numerosos procesos celulares tales como el acoplamiento excitatorio-contráctil, la secreción hormonal, la expresión de genes y la proliferación celular. Además, en la neuronas, el Ca²+ que entra a través de los canales de Ca²+ voltaje-dependientes (CCVD) participa en la transmisión sináptica como una señal intracelular que dispara el proceso de liberación de neurotransmisor en respuesta a la despolarización de la membrana. Así, entre todos los procesos celulares en los que participa el Ca²+ en el sistema nervioso, el papel que cumple en la exocitosis es, sin lugar a dudas, uno de los más prominentes. Los canales de Ca²+ voltaje-dependientes (CCVD) conforman una de las familias de canales iónicos más heterogéneas. Muy probablemente, esta característica refleja la gran diversidad de procesos celulares en los que participan. De acuerdo a sus propiedades de activación, los CCVD han sido divididos en dos clases: los canales que se activan por pequeñas despolarizaciones (low voltage activated, LVA) y los canales que requieren grandes despolarizaciones para su activación (high voltage activated, HVA). Entre los HVA, han sido descriptos al menos tres tipos de canales de Ca²+: los CCVD de tipo L, los de tipo N y los canales de tipo P/Q, distinguidos por su sensibilidad a bloqueantes. Los CCVD de tipo L son sensibles a las dihidropiridinas, compuestos que pueden actuar como antagonistas o agonistas; los de tipo N son canales bloqueados por la toxina w-CgTx GVIA, y los de tipo P/Q son inhibidos por las toxinas w-AgaIVA y FTX. Uno de los objetivos de este trabajo es la caracterización farmacológica de los CCVD en los terminales sinápticos del cerebro de dos especies de vertebrados, el pollo y la rata. En el primer capítulo se determina la sensibilidad a los distintos bloqueantes que presenta el influjo de Ca²+ voltaje-dependiente en sinaptosomas de cerebro anterior de pollo y corteza frontal de rata. En los terminales sinápticos de corteza frontal de rata, los CCVD que median la entrada de Ca²+ inducida por despolarización ([K]c= 40 mM) son de alto umbral de activación y sensibles a w-AgaIVA, FTX y altas concentraciones de w-CgTx MVIID, características de los CCVD de tipo P/Q. Contrariamente, el influjo de Ca²+ voltaje-dependiente en los terminales nerviosos del cerebro anterior del pollo es mediado por CCVD de alto umbral de activación sensibles a w-CgTx GVIA. Sin embargo, este proceso también es bloqueado, aunque parcialmente, por FTX, w-AgaIVA y w-CgTx MVIID. Estos resultados presentan evidencias de la existencia, en los terminales sinápticos del cerebro anterior del pollo, de un canal de Ca²+ con características farmacológicas no descriptas anteriormente. Por otro lado, los CCVD son componentes de membrana altamente regulados y, como consecuencia de la modulación de su actividad, los procesos que dependen de la entrada de Ca²+ a través de los mismos puede ser ajustados de manera muy precisa. Otro objetivo de este trabajo es el estudio de la modulación de la actividad de los CCVD de los terminales sinápticos. En el capítulo 2 se determinan los posibles cambios en las propiedades del influjo de Ca²+ a través de los CCVD en los terminales nerviosos aislados a partir de corteza frontal de rata, producidos como consecuencia del tratamiento de los animales con el ácido 3-mercaptopropiónico (MP), una droga convulsivante que provoca una generalizada hiperactividad neuronal. Los animales fueron sometidos a dos tratamientos distintos con MP: tratamiento agudo (1 dosis MP 150 mg/kg) y tratamiento crónico (1 dosis MP 35 mg/kg cada 24 horas, durante 3 días) y estudiados en los periodos de convulsión o postconvulsión. Las propiedades farmacológicas de los CCVD que participan del influjo de Ca²+ a los terminales sinápticos no son modificadas como consecuencia del tratamiento agudo ni del tratamiento crónico con MP. Más aún, tampoco es afectada significativamente la dependencia de la captación de Ca²+ con la concentración extracelular de KCl en los animales tratados con MP, lo que podría sugerir que las características de activación de los CCVD tampoco son alteradas por el tratamiento. En el estudio desarrollado en el capítulo 3, se determina el efecto modulador del péptido atrial natriurético (ANP) sobre la actividad de los CCVD de los terminales sinápticos de hipotálamo de rata. ANP, además ser liberado por los miocitos atriales en respuesta al estiramiento de la pared del atrio, es sintetizado y liberado en el sistema nervioso central, en particular, en el hipotálamo. En este trabajo se analiza el efecto del ANP sobre la entrada de Ca²+ a los terminales nerviosos aislados de hipotálamo de rata. ANP inhibe potentemente y de manera dependiente de la concentración la entrada de Ca²+ voltaje-dependiente (IC50= 2 nM). Este proceso es también bloqueado por la toxina w-Aga IVA, indicando que los CCVD involucrados en el influjo de Ca²+ a los terminales de hipotálamo podrían pertenecer a los tipo P/Q. Por otro lado, otro péptido de la familia de los factores natriuréticos, el péptido natriurético tipo C, no afecta el influjo de Ca²+ en esta preparación, lo que sugiere la especificidad de la acción de ANP. En este trabajo tesis se identifican las propiedades farmacológicas de los CCVD de terminales sinápticos del SNC del pollo y la rata, y de esta manera, los resultados aportan a la comprensión de los componentes involucrados en la transmisión sináptica en el SNC de vertebrados. Por otro lado, este estudio proveen evidencias del papel modulador del péptido atrial natriurético sobre la actividad de los CCVD de los terminales sinápticos de hipotálamo de rata. Estos resultados podrían facilitar la comprensión de los efectos fisiológicos de ANP sobre el sistema nerviosos central y de los mecanismos involucrados en el control de la volemia y la presión arterial.

En este trabajo de tesis doctoral y bajo la hipótesis de la utilización por parte la bacteria de Bordetella pertussis del desarrollo en biofilm como un posible mecanismo de persistencia en el hospedador se evaluó la capacidad de formación de biofilm por parte de aislados clínicos de Bordetella pertussis obtenidos de pacientes infectados y tratados en el Hospital Sor María Ludovica de la ciudad de La Plata. Todos los aislados clínicos estudiados, incluyendo cepas aisladas entre los años 2001 y 2007 presentaron mayor capacidad de formación de biofilm en superficies abióticas cuando se las comparó con la cepa de referencia Bordetella pertussis Tohama I, cepa adaptada al laboratorio y utilizada en la producción de vacunas contra la enfermedad. De los ocho aislados clínicos estudiados se seleccionó uno, debido a una exacerbada producción de biofilm (produjo 5 veces más biomasa en las mismas condiciones de cultivo cuando se la comparó con la cepa de referencia) y se realizó un estudio de proteómica comparativa para establecer un posible fenotipo adaptado a la condición de cultivo en estudio. Los experimentos se llevaron a cabo en colaboración con el grupo de la Dra. Monika Elingh Schulz de la Universidad de Veterinaria de Viena, Austria y se utilizó la tecnología 2D-DIGE para evaluar la expresión diferencial de proteínas de la fracción soluble entre ambas cepas en condiciones de cultivo líquido y biofilm. Un análisis de componente principal indicó que las diferencias más significativas entre los fenotipos expresados es consecuencia de la diferencia de cepas y posteriormente consecuencia de la condición de cultivo. Se identificaron 32 proteínas diferencialmente expresadas (mayor de 3 veces de diferencia) entre ambas cepas, las cuales fueron asignadas a las categorías: metabolismo y obtención de energía, síntesis de aminoácidos y proteínas, transporte y virulencia (Bcrh2, OmpQ, Vag8 y BrkA). Todos los factores de virulencia identificados corresponden a proteínas reguladas por el sistema de dos componentes BVGAS. Sabiendo que dicho sistema regula la expresión de importantes adhesinas en Bordetella pertussis y que su inactividad provoca la incapacidad de formación de biofilm es que se decidió estudiar a través de la técnica de PCR en tiempo real la expresión del ARN mensajero de un conjunto mayor de factores de virulencia regulados por este sistema incluyendo adhesinas tales como FHA, PRN, Fim, BipA y la proteína de secreción del sistema tipo III Bsp22 que ha sido reportada en la bibliografía como participante junto a Fim en la producción de filamentos que brindarían estructura a la matriz extracelular del biofilm de B. pertussis. Los resultados obtenidos indicaron un aumento en la expresión de ARN mensajero para la totalidad de los genes estudiados indicando que posiblemente el aumento en la expresión de adhesinas reguladas por el sistema BvgAS, sumado a la expresión de enzimas involucradas en la producción de energía que podrían explicar la alta velocidad de duplicación de la cepa clínica Bp2723 le conferirían la capacidad de formar un biofilm más robusto comparado con la cepa de referencia en las condiciones de cultivo estudiadas.