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La aparición de poblaciones de malezas con resistencia a herbicidas inhibidores de la acetolactato sintasa (ALS) y glifosato trajo como consecuencia la reducción en la utilidad práctica y económica de estas herramientas químicas e importantes pérdidas en la producción. Amaranthus palmeri S. Watson es una especie muy competitiva que, en los últimos años, se ha convertido en un grave problema en los cultivos de soja de la zona núcleo de nuestro país. A. palmeri se caracteriza por tener alta tasa de crecimiento, elevada tolerancia a los ambientes adversos, gran variabilidad genética y facilidad para desarrollar resistencia a herbicidas. Esta maleza se detectó por primera vez en Argentina durante la campaña 2011-2012 en el sur-oeste de la provincia de Córdoba. En A. palmeri, la mayoría de los casos de resistencia a inhibidores de la ALS son debido a cambios en la secuencia de bases del gen de la ALS, mientras que la resistencia a glifosato se debe principalmente a la amplificación del gen 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS). Fundamentalmente en el caso de los inhibidores de la ALS, una misma mutación en el gen blanco puede causar resistencia a más de un principio activo (resistencia cruzada). Si éste es el caso, el espectro de herramientas químicas factibles para el control de la población en cuestión se acota notablemente. Asimismo, si se identifica una mutación puntual que genera resistencia sólo a una determinada familia química, se puede plantear el uso de alguna de las otras familias de herbicidas, aumentando las posibilidades de éxito en el manejo de dicha maleza. Así, la dilucidación de las bases moleculares que explican el fenotipo de resistencia de diferentes subpoblaciones de malezas halladas a campo es de gran utilidad para el diseño racional de estrategias de control. Además, la obtención de información genética novedosa que pueda ser transferida a especies de interés agronómico constituye una potencial herramienta biotecnológica para abordar una de las principales problemáticas de la agricultura actual. El objetivo de esta tesis doctoral consistió en identificar las bases moleculares responsables del fenotipo de resistencia a herbicidas inhibidores de la ALS y glifosato observado en plantas de A. palmeri halladas a campo, con énfasis en el hallazgo y la caracterización de nuevas mutaciones en el sitio de acción de los herbicidas inhibidores de la ALS. Mediante estudios de dosis-respuesta, bioquímicos y moleculares, se confirmó que la subpoblación de A. palmeri hallada en lotes con cultivo de soja en la localidad de Totoras tiene resistencia cruzada a imazetapir, clorimurón-etil y diclosulam y que la resistencia a inhibidores de la ALS se debe a un mecanismo asociado al sitio de acción, de mutación de punto en la secuencia codificante del gen ALS. Se identificaron dos sustituciones de aminoácidos (W574L y S653N) en la enzima ALS previamente reportadas en la especie y cuatro sustituciones (A122S, A282D, D376E y A205V) detectadas por primera vez en A. palmeri en este trabajo de tesis. Las distintas versiones de la enzima ALS halladas fueron expresadas de forma heteróloga en sistemas procariotas y posteriormente purificadas a fin de evaluar su cinética y respuesta inhibitoria frente a los herbicidas, con énfasis en la sustitución A122S, que sólo se había observado en levaduras hasta el momento. Los resultados obtenidos demuestran que la sustitución A122S disminuye la susceptibilidad de la enzima frente a herbicidas de cuatro familias químicas diferentes y que la sustitución A282D no proporciona resistencia a los herbicidas del grupo B. También se detectó una disminución en la eficiencia catalítica en las enzimas con las sustituciones A122S, S653N, A205V, y W574L; al tiempo que las dos últimas fueron las únicas que produjeron una disminución de la afinidad de la enzima por el sustrato. Por otro lado, se obtuvieron individuos propagados asexualmente con las sustituciones en la enzima ALS: A122S, A205V o D376E reportadas por primera vez en esta especie en este trabajo de tesis y se evaluó el nivel de resistencia in vivo que proporciona cada una de ellas. Las tres sustituciones otorgan resistencia cruzada a los herbicidas del grupo B, siendo la primera vez que se informa que la sustitución A205V confiere resistencia a un herbicida de la familia de las triazolopirimidinas. Por último, mediante ensayos fenotípicos y moleculares se confirmó la resistencia a glifosato de la subpoblación A. palmeri de Totoras. La resistencia es causada principalmente por una mutación puntual en el gen EPSPS (P106S). Además, se detectó la contribución de un mecanismo ajeno al sitio blanco, en concordancia con lo reportado para una población cercana (geográficamente) a la estudiada. Futuros experimentos son necesarios para caracterizar este mecanismo. Dada la propensión de A. palmeri a desarrollar resistencia a múltiples modos de acción, es importante detectar rápidamente nuevos casos de poblaciones resistentes y determinar el mecanismo de resistencia involucrado, con el fin de diseñar estrategias de manejo sostenibles.

Los herbicidas son una importante herramienta en la producción agrícola para controlar malezas, evitar la erosión del suelo y mantener altos rendimientos. En Argentina, el modelo agro-productivo consolidado en las últimas décadas se basa en el cultivo de soja transgénica tolerante a glifosato (ya sea en monocultivo, o bien, en una rotación con maíz transgénico tolerante al mismo herbicida). Sin embargo, la elevada eficacia combinada con la simplicidad de operación de estos sistemas resultó en el uso excesivo de un pequeño número de herbicidas. Esto trajo como consecuencia inmediata una disminución en la diversidad productiva, una reducción sustancial en la abundancia de numerosas especies de malezas y la evolución de biotipos resistentes. El primer caso de resistencia a herbicidas en Argentina fue detectado en 1996, y al día de la fecha existen 18 especies diferentes que han desarrollado resistencia al menos a un herbicida, ascendiendo este número a 262 especies a nivel mundial. Así, la resistencia a herbicidas en malezas representa hoy uno de los problemas más importantes que enfrentan los sistemas agropecuarios en todo el mundo. El sorgo de Alepo (Sorghum halepense (L.) Persoon) ha sido introducido al país con propósitos forrajeros, pero actualmente es considerada una de las malezas más problemáticas del mundo, causando grandes pérdidas económicas. Es una gramínea C4, perenne y alotetraploide. Sus características la vuelven una especie sumamente competitiva, interfiriendo con los barbechos previos a cultivos primavero-estivales como soja, maíz o girasol. El principal inconveniente que presenta para su control químico eficaz y económico es su carácter de perennidad a través de la formación de rizomas de gran extensión y biomasa, especialmente en condiciones de ausencia de labranza. Este atributo es el que dificulta marcadamente el control mediante tratamientos con herbicidas sistémicos post-emergentes. En este trabajo de tesis se caracterizó la resistencia múltiple a herbicidas inhibidores de la ACCasa y a glifosato de una subpoblación de Sorghum halepense hallada en campos de Gobernador Crespo (GC-R). Los ensayos in vivo con haloxifop-p-metil mostraron que la subpoblación GC-R es altamente resistente con valores de LD50 y GR50 mayores a ocho veces la dosis recomendada a campo. Experimentos de dosis respuesta sobre ciertos individuos seleccionados de esta subpoblación (GC-C4, GC-C6 y GC-C7) permitieron explicar la resistencia observada y justificar los valores de GR50 y LD50 de la subpoblación original. A su vez, los estudios XI moleculares de secuencias nucleotídicas permitieron identificar dos mutaciones en el gen de la ACCasa. Las sustituciones provocadas por estos cambios (I2041N y A2096G) fueron reportadas previamente como responsables de conferir altos niveles de resistencia a varios principios activos de herbicidas del grupo A. Además, se encontró una sustitución no reportada (IXXXXT) sobre el dominio CT de la ACCasa, exclusiva de la subpoblación en estudio, que podría estar implicada en el fenotipo de resistencia. La identificación de nuevos alelos que confieren resistencia resulta de gran interés por su potencial aplicación en el desarrollo de cultivos tolerantes a herbicidas. Por otra parte, los estudios de qPCR realizados indicaron la ausencia de un mecanismo de amplificación génica. Además, no se encontraron evidencias para postular a un mecanismo de resistencia metabólica contribuyendo de manera significativa a la resistencia. Por consiguiente, los resultados obtenidos confirman que la resistencia a haloxifopp-metil de la subpoblación GC-R se debe principalmente a un mecanismo asociado al sitio de acción. Con respecto al glifosato, los estudios de dosis respuesta confirmaron la resistencia de la subpoblación GC-R con un valor de LD50 poco mayor a la dosis recomendada a campo. Sin embargo, la biomasa remanente se vio severamente afectada a dicha dosis. Los estudios moleculares permitieron descartar un mecanismo asociado al sitio de acción (mutaciones en la secuencia y amplificación del gen EPSPS), de acuerdo con lo reportado previamente para esta maleza. La profunda caracterización de los mecanismos de resistencia en la subpoblación GCR, derivó en el desarrollo y optimización de una PCR cuantitativa alelo específica (ASqPCR) que posibilita la identificación rápida y confiable de la relación de alelos mutados respecto a los alelos salvajes en individuos de una especie poliploide con múltiples copias del gen bajo estudio. Finalmente, se logró expresar de manera recombinante y obtener en fase soluble el dominio CT de la ACCasa de Sorghum halepense. La obtención de las distintas versiones alélicas del dominio CT recombinante abre las puertas para su caracterización funcional en presencia de inhibidores y para la exploración de nuevas sustituciones implicadas en la resistencia. Así, la optimización de esta herramienta de análisis representa una estrategia prometedora a fin de evaluar alelos novedosos que puedan encontrarse en poblaciones naturalmente resistentes.

Esta tesis se centra en el estudio de componentes antioxidantes que le permiten a Leptospira interrogans evadir el estrés generado durante el proceso infectivo, así como también la implicancia de los mismos en mecanismos regulatorios y de señalización celular. En primer lugar, se presenta una caracterización cinética y estructural de la catalasa (enzima del periplasma) y el sistema tiorredoxina (enzimas citosólicas). Estas enzimas contribuyen a la detoxificación in vivo de peróxido de hidrógeno y tert-butil hidroperóxido y por lo tanto juegan un papel clave en la virulencia. Además, se describe una interacción de estas proteínas con otros componentes de la bioquímica redox de la bacteria, tales como la metionina sulfóxido reductasa (Msr). Las dos isoformas de MsrA y la MsrB presentes en L. interrogans, mostraron capacidad de reducir a metionina, el isómero S y el R de MetSO, respectivamente. La localización periplasmática de la MsrB podría contribuir a reversión parcial de la inactivación oxidativa de la catalasa. Se evidenció la presencia de glutatión en esta bacteria y se comenzó la caracterización cinética de la gamma-glutamil cisteína sintasa, la primera enzima implicada en la síntesis de este tiol de baja masa molecular. Finalmente, se caracterizan funcionalmente dos glutarredoxinas (Grx) presentes en la bacteria: una monotiólica, y una ditiólica. La Grx ditiólica fue capaz de ceder electrones a las Msrs, mientras que la monotiólica fue capaz de unir centros hierro-azufre. Ambas proteínas se asociaron con procesos de-glutationilación y trans glutationilación de otras proteínas. Los resultados aquí presentados aportan al conocimiento sobre la biología redox en esta bacteria.

El parentesco ha sido un tema extensamente abordado por la antropología, encontrándose en todas las sociedades del planeta múltiples maneras prácticas de clasificar la ascendencia y descendencia de cada persona. Además de los vínculos establecidos desde el nacimiento y de los adquiridos a lo largo de la vida, las relaciones de parentesco tienen un correlato biológico que permite definir linajes y ancestrías a nivel poblacional. La historia de nuestra nómada especie también está escrita en sus células, más concretamente, en el ADN contenido en su interior. Se han definido polimorfismos específicos de poblaciones o asociados a poblaciones y es posible construir linajes paternos o maternos de distribución geográfica o étnica determinada. En este trabajo de tesis se emplearon técnicas de análisis molecular para caracterizar el perfil genético de la comunidad que hoy habita en Azampay, Catamarca. El objetivo fue conocer el porcentaje y aporte diferencial de componentes americanos y extra-americanos a esta población, reconstruir su historia migracional en el contexto del movimiento colonizador de los valles en el Noroeste argentino y cotejar estos linajes moleculares con las genealogías construidas a partir de los registros oficiales y los relatos orales de los informantes.

Los minerales son nutrientes esenciales que representan un 5% del peso vivo en el bovino. Las carencias y desequilibrios de minerales en la nutrición animal afectan la producción, reproducción y la salud. El ganado lechero cumple una destacada función productiva dentro de la economía de la región central de Santa Fe, principal cuenca lechera Argentina. Se pudo observar p<0,05 para las variables Cu, Zn, Fe, Mg, Ca, Na y K en suero entre los valores de los distintos campos, debido al manejo nutricional distinto y en el caso del campo C a la presencia de animales de la cruza Holstein- Jersey que están más adaptados a las elevadas temperaturas y a la humedad de la región. En los tres establecimientos se evidenció hiponatremia durante el período de lactación y no se diagnostico anemia. A lo largo de los estados fisiológicos en los distintos campos, se observó heterogeneidad en la leche. Las grandes concentraciones de cinc en la composición mineral del pasto, antagoniza ante la presencia de altas concentraciones de hierro y molibdeno de la dieta, caso que se observo en el campo A. Los resultados obtenidos brindan información a los productores y profesionales asesores de tambos.

Los objetivos del presente trabajo han sido delineados para avanzar en el conocimiento de base de los plásmidos presentes en aislamientos recuperados de un biofiltro enriquecido con pesticidas, para conocer la relación de los mismos con los presentes en otras bacterias y otros ambientes, y para obtener nueva evidencia molecular que ayude a comprender de modo más acabado el peso de la transferencia horizontal de plásmidos en la dinámica de transferencia de ADN y en la adaptación/tolerancia de las bacterias presentes en dicho ambiente. Asimismo esperamos contribuir en el desarrollo de herramientas que permitan avanzar en la captura de plásmidos y estudio. Objetivo general Caracterización molecular y funcional de plásmidos aislados de un biofiltro utilizado para la decontaminación de pesticidas. Objetivos específicos En el marco del objetivo general expuesto, en la presente Tesis Doctoral se establecen los siguientes objetivos específicos: - Obtención de una colección de bacterias portadoras de plásmidos de alto peso molecular. Caracterización de dichos aislamientos. - Purificación y secuenciamiento del conjunto de plásmidos de la colección bacteriana. Análisis bioinformático del contenido plasmídico. - Búsqueda, identificación, clonado, expresión y caracterización de actividades con potencial interés industrial. - Diseño, construcción y validación de una nueva herramienta para la captura de plásmidos de muestras ambientales y cultivos puros.

Esta tesis surge de la necesidad de trabajos empíricos sobre la sustentabilidad en la producción agropecuaria extensiva. La falta de trabajos con esta perspectiva urge en el plano académico pero también en los organismos técnicos-políticos a los fines de generar alternativas al modelo de producción actual. Este libro busca explorar la identificación de unidades productivas que sean núcleos de inicio de transformación agroecológica, como paso previo a un proceso de transición hacia modelos de desarrollo sustentable. El trabajo se focaliza en la Cuenca del Salado, la cual cuenta con características “marginales” desde la óptica productivista. La investigación se aborda desde el enfoque de la agroeocología, pretendiendo interrelacionar factores ecológicos, económicos, productivos y sociales. Se profundiza en la identificación y caracterización de las unidades de producción familiares que mantienen una cultura productiva en equilibrio con el ambiente. En ellas el modelo de agricultura industrial no ha penetrado de manera considerable, por lo que una posible llave de un modelo alternativo podría moldearse en estos sistemas a partir del rescate de sus prácticas tradicionales.

La producción ovina en la Región Central Argentina es de tipo doble propósito, carne y lana. El poblamiento ovino del territorio es el resultante de constantes introducciones de diferentes biotipos de animales lo que determinó la existencia de poblaciones ovinas con una gran variabilidad. Se realizó una caracterización etnozootécnica de las poblaciones, incluidas las muestras de vellón, evaluando la factibilidad de la utilización de los biotipos ovinos existentes en relación al potencial productivo (lana/carne). El estudio de estas poblaciones se realizó mediante trabajos de relevamientos conforme a los pasos de la metodología demográfica denominada “estructura poblacional", que analiza la distribución de la variabilidad dentro y entre poblaciones, para lo cual se definió a priori y secuencialmente una metodología prolija y ordenada de criterios y aspectos a tener en cuenta para la realización de los relevamientos. La caracterización de los sistemas productivos, por ser un proceso dinámico, se realizó bajo la forma de dos ensayos consecutivos representando las posibles situaciones productivas del lugar, engorde de animales a campo y corderos suplementados a corral, analizando las características de la lana de cordero y su producto carne. L a región en estudio y poblaciones relevadas se seleccionaron bajo la metodología “bola nieve”. Se evaluaron, 1 650 ovinos pertenecientes a 18 majadas distribuidas, 9 en la provincia de Córdoba, 1 en San L u is y 8 en La Pampa. Las características del diseño del estudio demográfico permitieron realizar una primera descripción de las poblaciones estudiadas en base a estimaciones con buen nivel de confianza. Las distribuciones de frecuencia de los diferentes caracteres etnozootécnicos estudiados y las relaciones entre los mismos confirman la existencia de una gran variabilidad, pero a la vez permiten afirmar la existencia de una variable potencial de lana común, como es la voluminosidad o bulk, requerida y premiada por la industria textil. El análisis del comportamiento de los sistemas productivos, no arrojó diferencias significativas entre biotipos, lo que permite afirmar que la variación dentro de un biotipo de animal es más importante aún que la esperada entre biotipos, sin mostrar diferencias significativas entre sistemas lo cual indicaría que ambos tratamientos pueden ser utilizados acorde a la situación particular de cada unidad productiva. Es posible producir lana y carne de excelente calidad buscando las bondades de la lana producida y optimizando a través de acertadas prácticas de manejo el producto carne.

Se han estudiado en detalle, por primera vez, los eventos moleculares más importantes responsables de la histolisis de tejidos larvales durante la transición larva-adulto de dípteros. Se han descrípto, por primera vez en los insectos, proteinasas lisosomales específicas de la histolisis y se ha correlacionado su actividad con la de otras enzimas degradativas y con las imágenes de cambios anatómicos degenerativos en músculos y cuerpo graso. Los principales resultados obtenidos son: l. Se aisló una nueva aspartil-proteínasa de 43.000 daltons, específica de la histolisis, denominada EMAP (Early metamorphosis aspartyl proteinase), con características bioquímicas similares al grupo de las Catepsinas tipo D y cuya secuencia amino terminal no presentó homología con este grupo. Usando la secuencia correspondiente al N- terminal se obtuvo un transcripto que fue clonado y secuenciado. La secuencia obtenida mostró homología del 59% con catepsina D de porcino, 51% con una proteinasa aspártica de mosquito y 60% con una proteinasa aspártica de arroz. 2. Se aislaron dos nuevas cisteín proteínasas lisosomales denominadas MCP I y MCPII (metamorphosis cystein proteinase), de 32.000 y 67.000 daltons respectivamente. Ambas enzimas fueron caracterizadas bioquímicamente y sus extremos amino terminales secuenciados. MCP I mostró características bioquímicas similares y alta homología N-terminal con las Catepsinas B de mamíferos (55.5%) y con una cisteín proteinasa de la mosca Sarcophaga (44%). MCP II es una endoproteinasa de nuevo tipo, cuyo N-terminal no presentó homología con ninguna cisteín proteinasa conocida en invenebrados, ni tampoco en vertebrados. 3. El perfil de actividad de las nuevas endopeptidasas coincidió con el de fosfatasa ácida, β-glucosidasa y β-galactosidasa lisosomales y correlacionó estrechamente con un marcado descenso en el contenido de proteínas registrado durante las etapas tempranas de la metamorfosis. El incremento en la actividad de enzimas lisosomales coincidió temporalmente (entre 20³º y 48 h desde la inmovilización definitiva de la larva) con la aparición de los primeros signos de muerte celular en los músculos y el cuerpo graso. 4. Es la primera vez que se describe en insectos el progreso temporal de la histolisis del cuerpo graso larval. Se determinó que la degradación de éste es un proceso gradual, que se inicia a las 20³ºh cuando las células que forman una red se separan unas de otras y finaliza alrededor de las 120 h cuando gran parte de las mismas se han fragmentado. Se determinó que los músculos esqueléticos correspondientes a los segmentos anteriores (l a 5) se fragmentan a partir de las 22 h, mientras que los correspondientes a la región abdominal, lo hacen recién a partir de las 72 h. 5. Se encontró una estrecha correlación entre la degradación del cuerpo graso larval y la depleción en el contenido de las principales moléculas de reserva. Cortes histológicos de cuerpo graso teñidos por PAS demostraron la completa desaparición del glucógeno en horarios posteriores a las 20³º h. El glucógeno fue consumido principalmente durante la etapa de salto y dispersión de la larva, mientras que el remanente (14% del contenido original, de acuerdo a dosaje directo) se consumió durante las primeras 20³ºh después de iniciada la metamorfosis. Los lípidos se consumieron principalmente a partir del estadio pupal (40 h), confirmando las imagenes histológicas obtenidas, donde se registró la disminución en el número y tamaño de las vesículas de grasa a partir de este horario Los resultados alcanzados han permitido obtener un panorama integral de la progresión de eventos degradativos durante la transición larva-adulto y mostraron por primera vez, que con muy pequeñas variantes, los eventos de la metamorfosis tienen idéntica duración relativa y representan etapas equivalentes del ciclo de vida en todos los insectos dípteros.

Tesis de Maestría