Catálogo de publicaciones

Echinococcus granulosus es un pequeño parásito cestode cuyo estadío larval causa la equinococcosis quística o hidatidosis. El objetivo de esta tesis fue analizar el transporte de aminoácidos en el estadío de metacestode y diseccionar los componentes moleculares involucrados en el mismo. Los análisis bioinformáticos realizados han mostrado que en Echinococcus spp. los transcriptos codificantes para transportadores de aminoácidos de la familia DAACS (transportadores de aminoácidos/ dicarboxilatos y catión) se encuentran entre los más representados, siendo los transportadores de aminoácidos excitatorios los más expresados dentro de los miembros de esta familia. Los ensayos de transporte efectuados en quistes hidatídicos infértiles indican que la incorporación de glutamato se daría mediante difusión simple, lo cual sugiere que dicho aminoácido podría ser sintetizado endógenamente. Este resultado estaría en concordancia con el hallazgo bioinformático de genes codificantes para enzimas que intervendrían en la síntesis de novo del aminoácido glutamato. Los análisis transcriptómicos sugieren que habría un aumento muy importante en la expresión de transportadores a nivel del parásito adulto con respecto a la forma lavaria, lo cual sugiere que en el estadío adulto la incorporación de glutamato en forma mediada podría ser esencial. Así mismo, en el protoescólex se han identificado ADNs copia codificantes para transportadores de aminoácidos que podrían estar involucrados en dicho transporte y se han denominado egat1-4. Con el fin de caracterizarlos, se han clonado y determinado las secuencias completas de los ADNs copia correspondientes y se ha hallado que poseen similaridad de secuencia y estructura con miembros de la familia DAACS. Los ensayos de hibridación in situ mostraron que el mensajero de egat1 se localiza en la zona tegumentaria del protoescólex y el correspondiente de egat3 en células del parénquima del protoescólex y en brotes de la capa germinal. Los anticuerpos contra fragmentos de EgAT1 y EgAT2 reconocieron proteínas en extractos del metacestode en ensayos de Western-blot. Se ha observado que EgAT1 se localiza en el subtegumento del protoescólex, ventosas, almohadilla rostelar y en fibras internas. EgAT1 también se localiza en capa germinal y en el subtegumento del parásito adulto. Por otro lado, EgAT2 se localiza en el parénquima del protoescólex y en brotes de la capa germinal. La diferente expresión espacial y temporal de los transportadores de aminoácidos analizados sugiere que cada uno de ellos cumpliría con las distintas necesidades de aminoácidos en diferentes territorios celulares y/o estadíos del ciclo de vida del parásito. EgAT1 se logró expresar en células de mamífero y los estudios funcionales efectuados en dichas células mostraron un pequeño pero significativo nivel de transporte de glutamato. La expresión de los transportadores a lo largo del ciclo de vida del parásito, su localización en estructuras claves para la interacción con el hospedador, su capacidad aunque limitada de incorporar glutamato, junto a las diferencias de estructura primaria y secundaria con sus ortólogos en mamíferos sugieren que estas moléculas podrían ser blancos de drogas contra la hidatidosis, además de proveer las bases moleculares para profundizar en la biología del parásito en lo que respecta al intercambio de metabolitos con el hospedador.

La Falla Hepática Aguda (FHA) es un desorden complejo y devastador que afecta a pacientes sin enfermedad hepática preexistente. Es una patología de rápida progresión, asociada con una alta tasa de mortalidad [13]. Actualmente, el único tratamiento efectivo disponible es el Trasplante Hepático Ortotópico (THO). El número de trasplantes hepáticos que se lleva a cabo en la actualidad se mantiene estable, mientras que el número de pacientes en lista de espera para un nuevo órgano se sigue incrementando. Por ello, uno de los principales problemas a los que se enfrenta hoy en día esta terapia lo constituye la escasez de órganos. Con el fin de evitar el desarrollo de complicaciones o la muerte de pacientes durante el período de espera, se están evaluando diferentes opciones alternativas al tradicional THO. Entre estas, destacan los hígados bioartificiales (HBA). Los HBA son dispositivos extracorporales que constan de tejido hepático o de hepatocitos funcionales (el componente biológico), alojado dentro de un biorreactor fabricado por el hombre (el componente sintético o artificial) y separado de la circulación sanguínea por membranas semipermeables [26]. Una de las claves para el óptimo rendimiento de un HBA es la correcta elección del componente biológico. A su vez, la arquitectura del biorreactor debe adecuarse al componente biológico elegido, permitiendo el acceso del mismo a los nutrientes necesarios para llevar a cabo funciones hepato-específicas. Finalmente, una vez seleccionado el componente biológico y diseñado el modelo de biorreactor a escala de laboratorio, el sistema debe validarse, chequeando su habilidad para sostener una buena viabilidad y funcionalidad del componente biológico elegido. Dentro de este marco, nos planteamos el objetivo de desarrollar un prototipo de biorreactor que pueda ser utilizado como dispositivo de asistencia extracorporal para soporte de la función hepática, principalmente, en casos de FHA. En primer lugar, seleccionamos como componente biológico para nuestro sistema a los microórganos hepáticos (MOHs), que son cortes de hígado, tipo láminas, de unos 400 μm de espesor, que mantienen la micro-arquitectura básica del lobulillo hepático y, por lo tanto, conservan sus características fisiológicas. Esta elección se fundamentó en el hecho de que se considera que el componente biológico “ideal” para ser aplicado a un HBA debe ser aquel que tenga en su composición todos los tipos de células hepáticas, con el objetivo de obtener una máxima respuesta. Una vez seleccionado el componente biológico, se optimizó el método de obtención y corte manual de los mismos, obteniéndose MOHs de un espesor de 338 ± 27 μm (n=25), valor que se encuentra dentro del rango óptimo (mayor a 200 μm y menor a 500 μm) indicado en la literatura [39]. Para que el HBA se convierta en una herramienta terapéutica útil es necesario desarrollar algún método de preservación del componente biológico, que permita mantenerlo viable y funcional, de manera de poder utilizarlo clínicamente cuando sea requerido. El método elegido en este trabajo de tesis fue la preservación por isquemia fría: almacenamiento estático, en frío (0 a 4 °C), en anoxia (bajo atmósfera de N2) y en una solución especialmente diseñada para tal fin [52]. Para poder contar con una solución adecuada para la preservación de MOHs, nuestro equipo de trabajo desarrolló la solución BG35 [58]. En este trabajo de tesis se profundizó en el estudio de la preservación de MOHs de rata en esta solución BG35, haciendo hincapié en la evaluación del metabolismo de amonio durante la etapa de reoxigenación. Esto se debe a que, previo a su uso en un HBA, es fundamental constatar que el componente biológico elegido mantenga su capacidad para detoxificar amonio, ya que la acumulación en sangre de dicho metabolito es el principal agente causal de los daños neurológicos asociados a la FHA [13]. Para ello, tanto MOHs frescos (recién cortados) como los MOHs preservados en BG35 y ViaSpan® (solución Gold Standard), luego de las 48 h de almacenamiento en frío, fueron evaluados en un sistema in vitro de reoxigenación normotérmica, en el que se tomaron muestra a los tiempos 0, 60 y 120 min. Los MOHs preservados en BG35 mantuvieron valores similares a los de MOHs frescos para todos los parámetros de viabilidad (liberación de LDH y contenido de glucógeno) y funcionalidad (consumo de oxígeno y contenido de agua total) evaluados. En cuanto a los parámetros ensayados sobre el metabolismo de amonio, a pesar de algunas diferencias observadas en los niveles de transcripto y de actividad enzimática para Carbamil Fosfato Sintetasa I y Ornitina Transcarbamilasa, las dos principales enzimas del ciclo de la urea, los MOHs preservados en BG35 fueron capaces de detoxificar amonio y sintetizar urea de manera similar a MOHs frescos y preservados en ViaSpan®, luego de 120 min de reoxigenación. Esto los hace aptos para ser utilizados como componente biológico en un HBA. Una vez optimizados los métodos de obtención y preservación del componente biológico, se desarrollaron dos prototipos de minibiorreactores (MBR), uno de cuerpo cilíndrico y el otro con un cuerpo de basa plana. Ambos modelos tienen una capacidad de 45 cm3 y permiten un intercambio correcto de fluidos y metabolitos entre los compartimientos biológico y sanguíneo. En la construcción de los dos prototipos se utilizaron fibras de PolyamixTM, obtenidas a partir de cartuchos de diálisis comercializados por la firma GAMBRO®, que posibilitan un adecuado transporte difusivo y convectivo de solutos a través de sus paredes. En la etapa final de validación, se analizaron diferentes parámetros de viabilidad y funcionalidad para MOHs utilizados como componente biológico en nuestros MBR. En el modelo cilíndrico, los MOHs frescos no fueron capaces de detoxificar amonio, mientras que si pudieron hacerlo en el MBR de base plana, lo que demuestra la importancia de la arquitectura y la configuración del componente artificial en el diseño de un HBA. Por otro lado, los MOHs preservados en BG35 mostraron un porcentaje de liberación de LDH, un mantenimiento de su integridad morfológica y una capacidad para detoxificar amonio similar a los controles al desempeñarse como componente biológico en el MBR de base plana. En base a todos los resultados enunciados anteriormente podemos concluir que: Nuestra técnica manual de corte se ha optimizado y validado, ya que permitió obtener MOHs de rata de un espesor adecuado y con una alta reproducibilidad. La solución BG35, desarrollada en nuestro laboratorio, permite que MOHs de rata almacenados 48 h en hipotermia mantengan niveles de viabilidad y funcionalidad similares a los de MOHs frescos durante todo el período de reoxigenación normotérmica. Los MOHs preservados en solución BG35 mantuvieron una adecuada capacidad para detoxificar amonio durante la reoxigenación, lo que posibilita su uso como componente biológico en un sistema de HBA. El poseer un método eficaz de preservación para nuestro componente biológico nos permite contar con el mismo en cantidad y calidad, y en el momento en el que sea necesario. Los MBR diseñados como parte de este trabajo de tesis muestran un adecuado funcionamiento in vitro en lo que respecta a intercambio de fluidos y metabolitos, no observándose pérdidas ni interacciones inespecíficas de los compuestos evaluados (glucosa y amonio) con alguno de sus componentes. En el desarrollo de un HBA, la arquitectura del MBR debe adecuarse a las necesidades del componente biológico para lograr un óptimo desempeño del mismo, tal como se ha demostrado en esta tesis. El MBR de base plana tiene un diseño sencillo y está construido con materiales estándar. Además de su uso como parte de un HBA, podría utilizarse como una herramienta de laboratorio útil para investigar los efectos de diferentes protocolos de preservación, criopreservación o cultivo sobre las funciones sintéticas o de detoxificación de MOHs provenientes de diferentes fuentes. Nuestro prototipo ha superado con éxito la etapa de validación in vitro, lo que posibilita continuar con las siguientes fases de escalado y evaluación en modelos animales.

En esta Tesis Doctoral se estudiaron distintos aspectos de la regulación del eje hipotálamo-hipófiso-gonadal (HHG) en un modelo de ratones transgénicos que produce niveles elevados de la hormona gonadotrofina coriónica humana (hCG) y desarrolla tumores gonadales (ratones hCGDE+). Se partió de la hipótesis que los elevados niveles de esteroides sexuales inducidos por la hipersecreción de hCG desde edades tempranas del desarrollo, actuarían sobre el eje HHG alterando la síntesis y secreción de hormonas y factores claves en la función reproductiva, participando directa o indirectamente en el inicio y progresión de los tumores gonadales que presentan estos ratones. En una primera etapa se caracterizó en profundidad el fenotipo de machos y hembras hCGDE+, estudiando parámetros morfológicos, bioquímicos y moleculares de la función gonadal e hipotálamo- hipofisaria. Se observaron marcadas diferencias sexuales en el modelo, donde los machos transgénicos resultaron severamente comprometidos a nivel de la regulación de la unidad hipotálamo-hipofisaria desde edades tempranas del desarrollo, mientras que las hembras mostraron alteraciones gonadales que condujeron al desarrollo de teratomas ováricos al inicio de la edad reproductiva. En una segunda etapa se aplicaron tratamientos antihormonales y gonadectomía, siendo nuestro particular interés estudiar el rol de los esteroides sexuales en el fenotipo de los machos y hembras hCGDE+. Los resultados obtenidos ponen de manifiesto que la hipersecreción de hCG, a través de la estimulación de la esteroidogénesis gonadal, altera la funcionalidad del eje reproductivo y participa en el desarrollo de patologías gonadales.

Casiraghi, L. (2018). Caracterización de un modelo novedoso de desincronización circadiana y sus consecuencias sobre el metabolismo. (Tesis de doctorado). Universidad Nacional de Quilmes, Bernal, Argentina.

Fil:Wilner, Ariel G.. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

El presente trabajo surge a partir de una recopilación bibliográfica de numerosos estudios de investigación que han demostrado la presencia de patógenos zoonóticos de origen canino transmitido por materia fecal en lugares frecuentados por las personas. El estrecho vínculo entre las mascotas y la población humana, crea el ambiente propicio para el surgimiento de zoonosis parasitarias y bacterianas. Se impone la necesidad de implementar campañas educativas que concienticen a la población respecto a la tenencia responsable de mascotas y alerten sobre las consecuencias de las enfermedades zoonóticas por ellas transmitidas. A su vez, las autoridades sanitarias locales deberían realizar campañas para disminuir la cantidad de perros sueltos y descontrolados en la vía pública.

La línea BLS1A posee un sistema de letales balanceados localizado en las cercanías del centrómero del cromosoma 6 de maíz formado por un gen letal clorofílico estrechamente ligado en fase de repulsión con un gen letal gamético. Los objetivos de esta tesis fueron los de caracterizar agronómica y molecularmente el segmento cromosómico balanceado de la línea de maíz BLS1A. Los resultados de ensayos a campo mostraron diferencias estadísticamente significativas entre BLS1A y algunos de sus recombinantes. La línea BLS1A mantuvo su vigor a pesar de los años de endocría. La caracterización genética a nivel molecular se realizó a través de la búsqueda de polimorfismos con marcadores moleculares de RAPD, RFLP, STS, AFLP y Microsatélites. Se analizaron más de 13200 loci génicos en todo el genoma de las líneas. Cinco microsatélites resultaron polimórficos para en el segmento y se lograron clonar y secuenciar siete bandas de RAPD y AFLP que mapearon en la región cromosómica en estudio. Las técnicas moleculares permitieron demostrar la alta homocigosis de la línea BLS1A, por fuera del segmento balanceado, luego de más de 25 años de endocría Del resultado de algunos de los ensayos de rendimiento de híbridos se observó que las líneas Rec 9 y Rec 10 que perdieron los letales, debido a la recombinación, parecerían corresponderse a los “homocigotas” de cada uno de los brazos del segmento balanceado original. La línea BLS1A como sus Recombinantes presentan buena aptitud combinatoria con las líneas públicas Mo17 y B73 representativas de los 2 grupos heteróticos más importantes en la producción de híbridos comerciales.

En esta Tesis se describe el hallazgo de actividad hemolítica, así como también de tres actividades lipolíticas en el medio extracelular del protozoo ciliado Ietrahymena thermophila. Las enzimas halladas son una fosfolipasa C (EC.3.1.4.3), una fosfolipasa A, (EC.3.1.1.32) y una triacilglicerol lipasa (EC.3.1.1.3). Estas enzimas fueron purificadas mediante precipitación fraccionada con sulfato de amonio y cromatografía de intercambio iónico, de filtración en geles y de interacción hidrofóbica en decil Sepharose 4B. Se encontró así que la fosfolipasa C copurífica con actividad hemolítica, no así la triacilglicerol lipasa ni la fosfolipasa A, aunque esta última es capaz de acelerar la acción hemolítica de la fosfolipasa C. Se halló además un segundo factor hemolítico no asociado a fosfolipasas, cuya acción es inhibida por colesterol y que, junto con la fosfolipasa C, puede dar cuenta de la acción hemolítica causada por el medio extracelular de Tetrahymena. Este segundo factor podría actuar en forma semejante a ciertas citolisinas bacterianas que causan hemólisis por interacción con el colesterol de las membranas. Las tres enzimas lipolíticas fueron caracterizadas y sus propiedades indican que provienen del sistema lisosomal. El hallazgo de las actividades aquí descriptas proporciona una explicación para el enigmático rol de los fosfonolípidos, un tipo especial de fosfolípidos que predominan en la membrana plasmática de Tetrahymen. Estos compuestos presentan un enlace directo carbono-fósforo que los hace particularmente resistentes a la hidrólisis enzimática por fosfolipasa C. Poseen, además, un enlace éter en la posición sn-1, que les confiere resistencia a la acción de fosfolipasa A. Es decir, Tetrahymena, una célula carente de pared celular u otras estructuras protectoras, sería capaz de tolerar sus propias secreciones líticas gracias a este tipo peculiar de fosfolípidos. Otras observaciones presentadas aquí pueden estar relacionadas con particularidades de las membranasde este ciliado. Así debe destacarse la baja proporción de triacilglicerol en la membrana plasmática, contrastando con lo observado para membranas internas de Tetrahymena. Este hecho puede estar vinculado con la secreción de la triacilglicerol lipasa. Otro aspecto notable es que esta célula carece totalmente de colesterol, el que es reemplazado por tetrahymanol. Esto puede explicar que el segundo factor hemolitico hallado no actúe sobre la membrana de Tetrahymena y sí sobre la de los eritrocitos. En esta Tesis se propone que la secreción de enzimas y las particularidades de la membrana representan una coadaptación que puede conferir a estos ciliados una ventaja evolutiva, al ser capaces de lisar otras células siendo ellos mismos resistentes. Otros experimentos presentados aquí sugieren, por último, que las actividades lipolíticas secretadas pueden desempeñar un rol destacado en la digestión extracelular e incorporación de fosfolípidos exógenos en este ciliado.

Las lesiones cutáneas que abarcan una gran superficie de la piel, requieren el recubrimiento inmediato de la zona afectada para reducir riesgos se sepsis y facilitar la regenración tisular. Entre los múltiples procedimientos terapéuticos aplicados en el tratamiento de estas lesiones, los injertos de piel proveen un medio adecuado y seguro para la regeneración tisular. En esta tesis se estudió un sustituto de piel humana a base de dermis porcina utilizado para ese fin terapéutico, el cual essometidopara su comercialización a un tratamiento industrial que incluye liofilizacipon. El objetivo de la tesis, consistió en la caracterización de este producto comercial, su comparación con la dermis fresca original, y la descripción de ciertos aspectos de su actividad biológica. El análisis consistió en desarrollar la metodología adecuada para el aislamiento y cuantificación de los componentes de importancia biológica. Estos fueron los colágenos del tipo I y III, las proteínas fibronectina y laminina, y los proteoglicanos de ácido hialurónico, keratán sulfato, dermatán sulfato y condroitín sulfatos A y C. Los resultados se esta etapa sugieren que el tratamiento industrial aplicado para su comercialización, no los modificó de manera importante, ya que no hubo alteraciones cuali-cuantitativas relevantes. Además, el análisis de su actividad biológica en un " modelo de cultivo in vitro" de fibroblastos humanos, mostró que la dermis induce un aumento de la proliferación celular. Por lo tanto, este sustituto dérmico puede considerarse una excelente herramienta para el tratamiento de pacientes con heridas cutáneas extensas.

Una de las últimas técnicas aplicadas en biología molecular para detectar diferentes niveles de transcripción en distintos estadios de un mismo tipo celular es el Differential Display. Este ensayo se basa en la técnica de RT-PCR, utilizando un oligo dT “anclado” que se une al nacimiento del pon A+ de los ARN mensajeros, y un oligonucleótido corto de secuencia al azar que, en diferentes combinaciones, van a amplificar un set de bandas característico para cada par de oligos elegidos. Estas reacciones se corren en un gel de poliacrilamida desnaturalizante y se observan por autorradiografía. De esta forma se comparan ambos estadios celulares y se recuperan del gel aquellas bandas que muestren una amplificación diferencial como producto de distintos niveles de ARN mensajeros. Utilizando el Differential Display en los estadios no infectivo (epimastigotes) e infectivo (trypomastigotes metacíclicos) del parásito Trypanosomacruzi, causante de la enfermedad de Chagas, se purificaron varias bandas de expresión diferencial. Una de ellas aplicada como sonda en un Northern-blot demostró tener una transcripción entre 8 y 9 veces mayor en trypomastigotes metacíclicos. A partir de una biblioteca genómica realizada en el bacteriófago A Fix, se aisló un clon positivo para esta banda que, una vez secuenciado y comparado en bancos de datos, dió una homología de hasta el 46 % a nivel de aminoácidos con diferentes ARN helicasas. Estas proteínas pertenecen a la familia de las proteinas DEAD Box y participan en el relajamiento de estructuras de ARN doble cadena. Por lo tanto son importantes en procesos como transcripción, traducción, ensamblado de ribosomas, splicing y editing.Además se ha descripto su participación en diferenciación y desarrollo celular, por lo cual se abre un campo muy importante con en el estudio de la participación de estas proteinas en los procesos de metaciclogénesis e infectividad del Trypanosoma cruzi. Por otro lado se demostró por Southern-blot que, a diferencia de la mayoría de los genes conocidos de Trypanosoma cruzi, el gen de esta ARN helicasa es de única copia en el genoma. Ensayos de Cromo-blot con ia región que codifica al carboxilo terminal de la proteína mostraron que este gen se encuentra representado en por lo menos nueve cepas del parásito. Por último, se demostró que esta ARN helicasa posee una especificidad enzimática con dirección 3’-5’ sobre transcriptos realizados in-vitro, con una aparente independencia de ATP o GTP, como ocurre con algunos miembros de esta familia El descubrimiento de este gen de transcripción diferencial entre ambos estadios de la metaciclogénesis de T. cruzi y la caracterización parcial de su función enzimática, son el principio para estudiar su participación en la diferenciación y/o infectividad de este parásito y nos permitirá conocer un poco más de este proceso del cual se sabe tan poco y que es parte del comienzo de la enfermedad de Chagas en los huéspedes vertebrados, entre ellos el hombre.