Catálogo de publicaciones

El protozoario Trypanosoma cruzi, agente etiológico de la enfermedad de Chagas, expresa en su superficie moléculas con actividad trans-sialidasa. Esta actividad novedosa constituye la única vía de captación de residuos de ácido siálico en el parásito. La adquisición de estos azúcares en glicoconjugados aceptores de superficie es indispensable para el reconocimiento y/o la infección de células de mamífero. La trans-sialidasa presente en el estadío infectivo de T cruzi tiene una estructura quimérica, compuesta por una región responsable de la actividad catalítica y un dominio repetitivo altamente inmunogénico (SAPA). Esta proteína es también secretada espontáneamente a sangre del hospedador mamífero con propósitos inciertos. En el transcurso de la presente Tesis, hemos realizado un análisis funcional del antígeno SAPA. Más precisamente, hemos evaluado el rol que podría estar cumpliendo este dominio en la interacción de la trans-sialidasa con el sistema inmune y en la biodisponibilidad de la molécula secretada. Con este propósito, generamos y expresamos en bacterias distintas trans-sialidasas recombinantes conteniendo o no al dominio SAPA. Las mismas fueron administradas en ratones siguiendo distintos protocolos de inmunización a fin de analizar el curso de la respuesta inmune humoral contra uno y otro dominio. Por otro lado, realizamos un análisis farmacocinético de las distintas enzimas purificadas. De tal manera, demostramos que la presencia del dominio SAPA cumpliría un rol dual durante la infección; en un primer momento, estabilizando la actividad trans-sialidasa en sangre, lo cual podría estar asociado al mecanismo de infección y/o a las alteraciones del sistema inmune que se verifican durante la fase aguda de la enfermedad. En etapas más tardías, la presencia del dominio SAPA induce la formación de anticuerpos capaces de neutralizar la actividad trans-sialidasa. La respuesta inmune inicial dirigida contra el dominio SAPA y/o la estabilización en sangre de la molécula secretada en su conformación nativa podrían estar mediando la difusión de la respuesta humoral hacia epitopes presentes en la región catalítica. De hecho, también demostramos que los anticuerpos inhibitorios de trans-sialidasa están dirigidos contra epitope/s discontinuo/s en la secuencia primaria de la enzima. Estos resultados son coincidentes con los datos clínicos, en los que se observa una fase inicial de la infección en la que puede llegar a detectarse actividad trans-sialidasa en circulación (asociado a altos niveles de parasitemia) y una fase tardía caracterizada por la presencia de anticuerpos inhibitorios de dicha actividad (asociado a bajas o nulas parasitemias). La inducción de anticuerpos inhibitorios mediada por SAPA contradice el rol inmunodistractor propuesto para este antígeno repetitivo, y sugiere un mecanismo seleccionado en la interacción parásito-hospedador para el establecimiento de una infección crónica. La estabilización de la actividad trans-sialidasa en sangre requiere de un número mínimo de unidades repetitivas y no depende de las secuencias no repetitivas presentes en el antígeno SAPA. El mecanismo molecular por el cual estas repeticiones aumentan la vida media de la transsialidasa en circulación no ha podido ser dilucidado, aunque no está mediado por una mayor resistencia a la degradación por proteasas séricas ni por unión de estas repeticiones a alguna proteína endógena. De manera interesante, el dominio SAPA es también capaz de estabilizar la conformación nativa de otra proteína en sangre, en absoluto relacionada a la trans-sialidasa, por lo cual se sugiere una posible aplicación biotecnológica.

El sistema MMR, constituye uno de los pilares fundamentales del mantenimiento de la estabilidad génica de todos los organismos. Su funcionalidad está altamente relacionada a los pasos post replicativos, sin embargo, han sido propuestos roles adicionales del sistema entre los que se encuentra la corrección de lesiones oxidativas sobre el ADN. El sistema MMR se encuentra conservado desde organismos procariotas a eucariotas, presentando mayor complejidad en estos últimos. El paradigma bacteriano se estableció en primer lugar en E. coli donde existen tres homodímeros específicos del sistema denominados MutS, MutL y MutH. En eucariotas, se ha demostrado la existencia de parálogos de MutS (denominados MSHs) y de MutL (denominados MLH y PMS) que forman heterodímeros funcionales específicos. Sin embargo, no existen homólogos eucariotas de MutH. El primer paso del sistema involucra el reconocimiento de lesiones en el ADN, principalmente apareamientos incorrectos o desapareamientos de bases, por complejos del tipo MutS. En eucariotas existen dos heterodímeros conservados que difieren en su especificidad de reconocimiento de lesiones. El primero se denomina MutSα y está formado por las subunidades MSH2 y MSH6, mientras el segundo se denomina MutSβ y se encuentra conformado por las subunidades MSH2 y MSH3. En A. thaliana y otras plantas estudiadas existe un tercer parálogo de MutS denominado MSH7. Esta subunidad forma junto con MSH2 el complejo heterodimérico MutSγ. Existen numerosos estudios sobre el sistema MMR en bacterias, células humanas y levaduras, sin embargo, el conocimiento del mismo en plantas es aún escaso. Ante este escenario se planteó como uno de los objetivos del presente trabajo extender el conocimiento sobre el sistema MMR de plantas, principalmente centrándose en el rol del complejo MutSγ, exclusivo de estos organismos. Adicionalmente, se estudió la relación del sistema MMR con la reparación del daño oxidativo en el ADN. En primer lugar, se expresó la subunidad AtMSH2 en un sistema bacteriano y se purificó a homogeneidad con la finalidad de utilizar esta proteína en futuros ensayos bioquímicos in vitro. Adicionalmente, se utilizaron anticuerpos generados contra esta subunidad para demostrar la existencia de un ortólogo de MSH2 en inflorescencias de Brassica olaracea, especie relacionada filogenéticamente con A. thaliana. La presencia de la proteína en inflorescencias sería importante para mantener la fidelidad genética durante la siguiente generación. De hecho, también se observó que los niveles transcripcionales del gen MSH2 en A. thaliana son 70 veces superior en callos con respecto a los valores de plántulas, asociado probablemente a la mayor tasa de replicación existente en estos tejidos. Los niveles de expresión de los genes MSH2, MSH6, MLH1 y PMS1, también, se evaluaron en plantas salvajes sometidas a condiciones de estrés oxidativo, por tratamiento con MV y estrés salino, por tratamiento con NaCl. En general, todos los genes mostraron un aumento en su expresión en relación a las condiciones control, sin embargo, los incrementos dependieron del gen en estudio y del tratamiento. AtPMS1 fue el único gen que mostró una disminución en su expresión relativa cuando se estudió el efecto de NaCl. Estos experimentos se extendieron a estudiar el efecto del estrés oxidativo y salino en plantas de A. thaliana salvajes o mutantes en el gen MSH2. Se observaron disminuciones de las cantidades de clorofilas a y b y en la elongación de raíces, tanto en plantas salvajes (control) como en plantas mutantes sometidas a tratamientos de estrés. Adicionalmente, se observó una mayor acumulación de bases oxidadas, 8-oxoG, en el ADN de plantas sometidas a estrés oxidativo, sin evidenciarse diferencias atribuibles a los genotipos. En conjunto, estos datos no permiten establecer una relación directa entre el sistema MMR y la reparación del daño oxidativo en el ADN. Finalmente, se caracterizó la función de AtMutSγ en un sistema in vivo. Para ello, se expresaron las subunidades AtMSH2 y AtMSH7 en un huésped heterólogo. La expresión funcional del complejo se confirmó mediante ensayos de cambios de movilidad electroforética y medidas de tasas de mutaciones de distintos marcadores moleculares. A partir de la comparación de las tasas de mutaciones, se determinó que la expresión de AtMutSγ produce un aumento en la frecuencia de mutaciones del tipo de sustitución de bases en el ADN, evidenciada por uno de los genes reporteros utilizados (CAN1). El análisis del espectro mutacional de CAN1 permitió confirmar que el aumento en la tasa de mutaciones se debe a sustituciones de bases. Adicionalmente, los resultados obtenidos permitieron inferir cierta especificidad de reconocimiento de AtMutSγ, mediante la prevalencia de ciertas sustituciones sobre las demás. Estas sustituciones involucran los cambios de T por A, C o G y de G por A en la hebra codificante del CAN1. De esta forma, AtMutSγ reconocería preferencialmente los apareamientos incorrectos que causan estas mutaciones. Estos datos, abren nuevas perspectivas para continuar avanzando en la elucidación de las bases moleculares y bioquímicas de este sistema de reparación en plantas.

Tesis para obtener el grado de Doctora en Farmacia y Bioquímica en Biología Molecular, de la Universidad de Buenos Aires, en 2014

Tesis (Grado Doctor en Ciencias Biológicas)--Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales. Lugar de Trabajo: Instituto de Investigaciones Médicas Mercedes y Martín Ferreyra. INIMEC-CONICET-Universidad Nacional de Córdoba. 2013. 103 h. + CD. tabls.; grafs.; ilus. Contiene Referencia Bibliográfica. Título y Abstract en español e inglés.

Las phasinas son un grupo de proteínas que se encuentran asociadas a gránulos de polihidroxialcanoatos (PHA). Además de su rol estructural como parte de la cubierta del gránulo, se han encontrado diferentes funciones estructurales y regulatorias asociadas a varias de estas proteínas, y se han desarrollado aplicaciones biotecnológicas utilizando proteínas fusionadas a phasinas. A pesar de su diversidad funcional, la estructura de estas proteínas ha sido analizada en detalle en muy pocos estudios. PhaP de Azotobacter sp. FA8 (PhaPAz) pertenece al grupo más representado de la multifuncional familia de las phasinas. Esta proteína ha sido clonada y expresada en Escherichia coli. Las cepas recombinantes de E. coli que sobreexpresan phaPAz crecen más y acumulan más polímero, lo que sugiere que PhaPAz ejerce un efecto promotor del crecimiento. Se observó también que la expresión de PhaPAz tiene un inesperado efecto protector en E. coli no productora de PHA, tanto en condiciones normales como en condiciones de estrés, resultando en un mayor crecimiento y mayor resistencia a estrés oxidativo y estrés térmico. El objetivo de este trabajo doctoral es realizar una caracterización funcional y estructural de esta phasina para estudiar sus diversas propiedades y dilucidar el mecanismo por el cual ejerce su efecto protector. Su estructura primaria reveló que no posee claros dominios hidrofóbicos, característica que parece ser común a la mayoría de las phasinas, a pesar de su capacidad de unión a gránulos lipídicos. La estructura secundaria de esta proteína consiste en α-hélices, combinadas con regiones desestructuradas que le confieren una notable flexibilidad dependiente del entorno. Los datos experimentales obtenidos revelaron que PhaPAz es un tetrámero formado por interacciones de tipo coiled coil entre los monómeros. Estas características estructurales tambén fueron encontradas en otras phasinas y podrían estar relacionadas con su diversidad funcional. Se realizaron experimentos de actividad chaperona in vitro para dilucidar el mecanismo por el cual PhaPAz ejerce su efecto protector. PhaPAz demostró evitar la agregación térmica de la proteína Citrato Sintasa (CS) y facilitar el proceso de replegado de la enzima luego de la desnaturalización por métodos químicos in vitro. Estos experimentos mostraron que PhaPAz tiene actividad chaperona in vitro. Se utilizaron técnicas de microscopía de fluorescencia y de transmisión electrónica para analizar la localización intracelular de PhaPAz en cepas de E. coli productoras y no productoras de PHB con el objetivo de estudiar el rol de PhaPAz en el plegado de proteínas in vivo, el agregado de proteínas y la dinámica de formación de cuerpos de inclusión. PhaPAz colocalizó con los cuerpos de inclusión de PD, proteína que forma grandes y visibles agregados cuando es sobreexpresada en E. coli. Se observó una reducción en el número de cuerpos de inclusión cuando PD fue coproducida con PhaPAz o con la chaperona GroELS. Estos resultados demuestran que PhaPAz presenta actividad chaperona tanto in vitro como in vivo en E. coli recombinante, y sugieren que las phasinas podrían tener un rol protector general en los productores naturales de PHA. Estas observaciones hacen posible el uso de esta proteína en el desarrollo de nuevas aplicaciones biotecnológicas, como por ejemplo la producción de proteínas recombinantes y otros productos heterólogos en E. coli.

Se ha descripto que algunos ARNm de polen son sintetizados durante el desarrollo del polen y acumulados en grano de polen maduro deshidratado, para ser traducidos luego de la germinación del polen. Nuestra hipótesis es que la regulación de la acumulación de estos ARNm de polen pre-sintetizados está mediada por cuerpos citoplasmáticos. Para probar dicha hipótesis, analizamos la localización celular de algunos ARNm pre-sintetizados durante el desarrollo del polen utilizando el sistema MS2-CP. Utilizamos como sistema biológico a Arabidopsis thaliana que permite llevar a cabo un análisis genético, molecular y de desarrollo de la expresión específica de genes de polen. Por otro lado, estudiamos gránulos de estrés (SG) y cuerpos de procesamiento (PB) en polen maduro de Arabidopsis como posibles estructuras celulares donde estos ARNm pre-sintetizados polínicos puedan ser almacenados. En otra línea de estudio, caracterizamos cuerpos de cajal (CB) para investigar si su número y tamaño varían durante los procesos de división celular y diferenciación celular que ocurren en el desarrollo del grano de polen. Nuestros resultados demuestran la presencia de agregados de ARNm citoplasmáticos en polen maduro en líneas transgénicas que contienen el sistema MS2-CP. Validamos y cuantificamos estos agregados de ARNm usando un análisis automatizado de MATLAB. Luego verificamos si estos agregados de ARNm co-localizan con gránulos de estrés y/o cuerpos de procesamiento mediante el análisis de líneas transgénicas que expresan el sistema MS2-CP y a la vez proteínas marcadas de SG o PB. Hemos demostrado que uno de cada cinco agregados, aproximadamente, co-localiza con alguna de las proteínas marcadoras de PB, lo que sugiere que los PB son sitios de almacenamiento de los ARNm en granos de polen maduro. Además, analizamos de qué manera se afecta la presencia y la localización de los agregados citoplasmáticos en ausencia de los genes marcadores de SG y PB. Hemos determinado que dichas proteínas serían necesarias para la localización de los ARNm en acúmulos citoplasmáticos. Nuestros resultados además sugieren que los CB responden durante el desarrollo del polen a las diferentes necesidades fisiológicas de los distintos tipos de células gametofíticas masculinas. Estos resultados contribuirán a entender los mecanismos de regulación transcripcional y traduccional en granos de polen de Arabidopsis thaliana.

Las estrategias para poder clonar los genes involucrados en la síntesis, movilización o metabolismo del PHB en otras especies bacterianas abarcan 3 tipos: I) Complementación de cepas que no poseen actividad de alguna de las enzimas que intervienen en el camino biosintético del polímero. II) Hibridización de ácidos nucleicos utilizando sondas heterólogas de la zona conservada . III) Secuenciación directa de las proteínas de gránulo y construcción de sondas homólogas. Durante el desarrollo de mi tesis de investigación utilicé la estrategia de la secuenciación directa de las proteínas de gránulos. Para lograr esto era necesario saber que tipo de proteínas están asociadas al gránulo y comparar su patrón de corrida en PAGE con los patrones de corrida de otras especies y establecer cual era la probable PHB sintasa. El patrón de proteínas mostró 3 bandas intensas en el gel: una proteína de 22 kDa que cuyo extremo aminoterminal ya había sido secuenciado (Steinbüchel, dato no publicado). Está sería la proteína estructural de gránulo (fasina); las otras dos bandas son de proteínas de 40 kDa y 43 kDa. En cambio la proteína de 40 kDa, sería la PHB sintasa, debido a que se encuentra en gran cantidad el momento de recolección de las bacterias para analizar su patrón de proteínas, fue el de mayor acumulación de PHB. Por lo tanto procedí y logré el secuencimiento del extremo aminoterrninal de dicha proteína. Con las secuencias de las proteínas de 22 kDa y 40 kDa, diseñé dos sondas y con ellas realicé estudios de Southern tanto sobre ADN genómico como sobre plásmidos que contienen genes clonados de B. megaterium que intervienen en el metabolismo del PHB. Con estos experimentos se detectó un segmento de ADN cromosómico de B. megaterium que hibridaba con la sonda de fasina. Cuando se secuenció este fragmento se descubrió que contiene 3 genes que estuvieron involucrados en la transactivación de la Tiolasa II de E. coli. Dos de dichos genes mostraron, por comparación con secuencias proteínas y secuencias de ADN de los bancos de datos, que tenían una gran homología con un par de proteínas sensor-activador involucradas en la regulación del operón ato de E. col mediada por el complejo σ54 holoenzima RNA polimerasa. También mostraron una gran homología con otro activador de B. subtilis dependiente de σ54.El tercer gen mostraba homología con el gen pbt que codifica para la enzima Fosfobutiril transferasa (Pbt) en C. acetobutuylícum. Los análisis de la actividad enzimática de esta posible enzima Pbt de B. megaterium mostraron un patrón de expresión complejo: l) Sufre represión catabólica 2) Su pico de expresión se encuentra en el principio de la fase estacionaria 3) Se aumenta la expresión de este gen por la presencia de los aminoácidos valina, leucina e isoleucina. Finalmente, mediante experimentos de expresión en E. coli, tanto de la enzima Pbt como del activador dependiente de σ54 clonados de B. megaterium, corroboré que dicho activador está involucrado en la transcripción del gen pbt.

Fil:Petroni, Eberto Alejandro. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.