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El destete es considerado uno de los períodos más críticos de la producción porcina debido a su impacto negativo sobre la salud y performance productiva del lechón, principalmente en la primera semana post destete. En esta etapa, el lechón queda expuesto a factores fisiológicos, inmunológicos, microbiológicos, sociales, ambientales y nutricionales que conducen al conocido estrés post destete. En relación a los factores asociados a la alimentación, la presencia de compuestos contaminantes como las micotoxinas influye negativamente en el rendimiento productivo. El deoxinivalenol (DON) es una micotoxina producida por especies del género Fusarium y el cerdo representa la especie más susceptible a los efectos tóxicos que ocasiona. Existe escasa información de los posibles efectos subclínicos asociados a la ingestión de concentraciones bajas de DON, en particular en etapas de alto riesgo para el lechón como el destete. Con el fin de reducir los efectos indeseables que se presentan en la etapa de destete y favorecer los rendimientos productivos se utilizan diferentes aditivos tales como los antibióticos y prebióticos. Los antibióticos son utilizados como aditivos promotores del crecimiento o como agentes terapéuticos, metafilácticos y profilácticos. Entre los antimicrobianos más utilizados se encuentra la fosfomicina (FOS), un antibiótico bactericida de amplio espectro y escasa toxicidad, empleada frecuentemente como una alternativa clínica para el tratamiento de infecciones causadas por bacterias resistentes en la etapa post destete. Los prebióticos son ingredientes alimentarios indigestibles que producen un efecto benéfico en el animal al estimular el crecimiento selectivo y la actividad metabólica de bacterias del colon. A este grupo pertenece la inulina, polímero oligomérico de fructosa de almacenamiento encontrado en muchas plantas, entre ellas en Cynara scolymus (variedad de alcachofa). El objetivo general de la presente tesis fue evaluar el efecto de la interacción de un antibiótico, prebiótico y micotoxina sobre la salud intestinal y performance productiva en lechones post destete. El trabajo de tesis presentó cinco objetivos específicos: I. Estudiar el efecto interactivo del deoxinivalenol sobre la penetración de fosfomicina en líneas de cultivos celulares. Se utilizó la línea celular HEp-2 como modelo celular del sistema respiratorio para evaluar la penetración del antibiótico FOS. Las concentraciones de antibiótico intracelular en células HEp-2 incubadas con 130 μg/ml de FOS cálcica, oscilaron entre 0,4 y 1,12 μg/ml con un tmax de 8 h. Cuando las células HEp-2 fueron incubadas con 130 μg/ml FOS y 1 μg/ml DON, la penetración celular del antibiótico no presentó variación significativa, en IV relación a la Cmax (1,10 μg/ml) y tmax (12 h). Se concluyó que DON no interfirió en la penetración de FOS a las células HEp-2 y que la concentración de FOS intracelular fue baja permaneciendo en alta proporción como antibiótico extracelular. Por otro lado, se realizaron cultivos de células IPEC-J2 para evaluar la penetración del antibiótico FOS a los enterocitos. El Cmax del antibiótico intracelular en las placas de cultivo incubadas con 580 μg/ml FOS fue de 45,81 μg/ml con un tmax de 4 h. Cuando las células IPEC-J2 fueron incubadas con 580 μg/ml FOS y 1 μg/ml DON, el Cmax del antibiótico intracelular fue 20,06 μg/ml y su tmax fue de 30 min. Se concluyó que DON interfirió en la penetración de FOS a los enterocitos. Las concentraciones obtenidas de FOS en el interior de las células superaron los valores establecidos de CIM90 para la mayoría de los patógenos de importancia en producción porcina. II. Estudiar el efecto interactivo del deoxinivalenol sobre la penetración de fosfomicina en explantes intestinales. Se desarrolló una técnica de cultivos de explantes de intestino procedentes del yeyuno de cerdos para estudiar la penetración de FOS a los enterocitos en presencia o ausencia de DON. La concentración intracelular de FOS no se modificó en presencia de las concentraciones de DON utilizadas. Se obtuvo un Cmax de 12 μg/ml y un tmax de 2 h. Solo el 2% del antibiótico se acumuló intracelularmente y, por lo tanto, una alta proporción de FOS permanecería en la luz intestinal. Las concentraciones obtenidas de FOS en el interior de los enterocitos superaron los valores establecidos de CIM90 para la mayoría de los patógenos de importancia en producción porcina. Los resultados obtenidos en estudios in vitro y ex vivo sugieren que FOS puede constituir una alternativa apropiada para el tratamiento de infecciones del sistema respiratorio y del tracto intestinal causadas por microorganismos intra y extracelulares en lechones de recría. III. Estudiar los cambios morfo-fisiológicos a nivel intestinal producidos por la fosfomicina, extracto de Cynara scolymus, deoxinivalenol y sus combinaciones en lechones post destete. Ocho grupos de lechones de 21 días de edad recibieron diferentes tratamientos durante 15 días. Grupo A: Control, Grupo B: Cynara scolymus (300 g/tn alimento), Grupo C: FOS (30 mg/kg PV incorporada en el agua de bebida), Grupo D: DON (1 mg/kg alimento), Grupo E: combinación Cynara scolymus y FOS, Grupo F: combinación Cynara scolymus y DON, Grupo G: combinación FOS y DON y Grupo H: combinación Cynara scolymus, FOS y DON. Al día 15, tres lechones de cada grupo fueron sacrificados e inmediatamente se tomaron muestras del tracto gastrointestinal para evaluar pH, bacteriología (enterobacterias y bacterias lácticas), V concentración de ácidos grasos volátiles (AGVs), actividad enzimática (lactasa, sacarasa y maltasa) y cambios histológicos (área absortiva intestinal y células caliciformes). Los tratamientos con FOS mejoraron la salud intestinal de lechones de destete por los efectos positivos sobre el pH, la microbiota intestinal, la actividad de las disacaridasas y los parámetros histológicos. La FOS decreció el recuento de enterobacterias, la relación enterobacterias/bacterias lácticas (E/BAL) y los valores de pH en ciego y colon (p< 0,05). La adición de FOS en el agua de bebida produjo un aumento significativo en la actividad de maltasa (p< 0,05) en todas las porciones del intestino analizadas mientras que no tuvo efecto sobre las actividades de sacarasa y de lactasa. También, la FOS condujo a una mayor área de superficie de absorción intestinal (AAI) en yeyuno medio (p= 0,0034) y a un incremento en el recuento de células caliciformes en criptas del íleon (p= 0,0159). Los tratamientos con Cynara scolymus mejoraron la salud intestinal de lechones de destete debido a los efectos positivos sobre la microbiota intestinal, la concentración de AGVs, la actividad de las disacaridasas y los parámetros histológicos. El tratamiento con el prebiótico C. scolymus disminuyó el recuento de enterobacterias y, por lo tanto, la E/BAL en ciego y colon (p< 0,05) e incrementó la concentración de ácido butírico en ciego (p=0,0330). Los tratamientos con extracto de C. scolymus condujeron a una mayor actividad de maltasa en íleon (p= 0,0020) y mayor AAI en yeyuno medio e íleon (p< 0,05). En adición, el prebiótico C. scolymus incrementó el recuento de células caliciformes a valores en vellosidades (p= 0,0159) y criptas (p= 0,0143) de yeyuno medio. Se observó un efecto interactivo entre FOS y el prebiótico C. scolymus sobre el recuento de enterobacterias (p= 0,0004) y, por lo tanto, en la E/BAL (p= 0,0016). La interacción observada entre los aditivos fue de tipo “antagónica” en el ciego, es decir cuando antibiótico y prebiótico se administraron en forma conjunta el efecto sobre las enterobacterias y la E/BAL fue menor al producido como factores individuales. Por el contrario, la interacción observada entre los aditivos en el colon fue de tipo “indiferencia”, es decir el efecto sobre el recuento de enterobacterias producido por la combinación de aditivos fue similar a la observada como factores individuales. En relación al AAI, la administración combinada entre antibiótico y prebiótico presentó una interacción de tipo “indiferencia” en yeyuno medio y de tipo “antagónica” en íleon (p< 0,05). En yeyuno medio, el efecto sobre el AAI producido por la combinación de aditivos fue similar a la observada cuando los aditivos se administraron en forma independiente. En íleon, se observó que los tratamientos con C. scolymus aumentaron el AAI en ausencia de FOS, mientras que en presencia del antibiótico, el efecto sobre el AAI fue menor (p< 0,05). Cuando los aditivos se administran en forma combinada el AAI fue similar a VI los grupos que no recibieron prebiótico. Estos tipos de interacciones entre aditivos podrían ser explicados por un fenómeno de adsorción del antibiótico a la fibra dietaria que en este caso es el extracto de C. scolymus. Los tratamientos con DON afectaron la salud intestinal de lechones de destete generando efectos adversos sobre la concentración de AGVs, la actividad de las disacaridasas y los parámetros histológicos. La micotoxina disminuyó la concentración total de AGVs (p= 0,0021), del ácido acético (p= 0,0104) y del ácido butírico (p= 0,0001). Se observó que los animales que recibieron la micotoxina en su dieta y se les adicionó el antibiótico o el prebiótico, el efecto sobre la concentración del ácido propiónico fue significativo (p< 0,05). En ambos casos, la presencia del antibiótico o prebiótico incrementó dicho AGV. Se observó un efecto perjudicial del DON (p< 0,05) sobre la actividad de diferentes disacaridasas (maltasa, sacarasa y lactasa) en distintas porciones del intestino delgado y disminuyó el recuento de células caliciformes presentes en las vellosidades de yeyuno medio (p= 0,0125) y en íleon (p= 0,0336). IV. Determinar los efectos de fosfomicina, extracto de Cynara scolymus, deoxinivalenol y sus combinaciones sobre la adherencia bacteriana al mucus intestinal. Se trabajó con el mucus del íleon procedente de los lechones que recibieron distintos tratamientos en la sección experimental II. El resultado se expresó como un porcentaje de bacterias de E. coli adheridas a las glicoproteínas del mucus intestinal y un porcentaje de bacterias no adheridas. A mayor porcentaje de bacterias adheridas, el mucus intestinal es mejor debido a una mayor cantidad de glicoproteínas que sirven de receptores para bacterias patógenas y protegen a las células epiteliales intestinales de la colonización e invasión bacteriana. Se observó un efecto positivo del antibiótico, prebiótico y combinación antibiótico-prebiótico sobre las bacterias adheridas al mucus intestinal (p< 0,05). Con el tratamiento FOS se obtuvo un 83,67% de bacterias adheridas a las glicoproteínas; el extracto de C. scolymus produjo un 72,25% de bacterias adheridas y cuando antibiótico y prebiótico fueron administrados en forma conjunta se observó una adhesión del 81,61%. De manera contraria, la adhesión bacteriana al mucus intestinal en los grupos que no recibieron aditivos fue del 45,71%. En conclusión, los aditivos produjeron un mayor recuento de células caliciformes y, por lo tanto, mayor producción de mucus intestinal que condujo a una mayor adhesión de bacterias frecuentes en la etapa post destete a las glicoproteínas presentes en ese mucus. V. Estudiar los efectos de fosfomicina, extracto de Cynara scolymus y su combinación sobre parámetros de performance productiva en lechones post destete. Los tratamientos con FOS, Cynara scolymus y combinación de aditivos mejoraron la conversión alimentaria a valores de 1,24- 1,25 (consumo/kg ganados) en relación al grupo control que fue de 1,71 (p< 0,05). Los VII efectos benéficos sobre distintos parámetros de la salud intestinal de los lechones, producto de los tratamientos con FOS y/o C. scolymus, repercutieron positivamente en la performance productiva de los animales. Los resultados obtenidos en estudios in vivo indicaron que el uso de los aditivos FOS y el prebiótico C. scolymus mejoraron la salud intestinal y la performance productiva en lechones de destete. De manera diferente, los tratamientos con DON ejercieron un efecto negativo sobre la salud intestinal en lechones de destete por lo que es esperable que estos efectos impacten de manera negativa sobre la performance productiva

La neurogénesis adulta en mamíferos produce continuamente células granulares (GC) que se integran a los circuitos del giro dentado del hipocampo. Si bien se ha demostrado la importancia de la neurogénesis adulta en procesos de aprendizaje y memoria espacial, la función de las GC nuevas es aún incierta. El objetivo de esta tesis es comprender cómo las GC generadas en el adulto contribuyen con la función del hipocampo, analizando qué capacidades de procesamiento le proveen al circuito. Las GC nacidas en el adulto maduran sus propiedades intrínsecas y sus conexiones sinápticas, alcanzando características indistinguibles de las de las GC nacidas durante el desarrollo. Por lo tanto, proponemos que es durante el proceso de maduración que las GC generadas en el adulto le proveen capacidades de procesamiento particulares al hipocampo, aportando a su función. Para poner a prueba nuestra hipótesis, estudiamos cómo los inputs provenientes de la corteza entorrinal son procesados por GC nuevas inmaduras de cuatro semanas de edad (4wpiGC) y las GC maduras generadas en el desarrollo (matGC). Se utilizó la inyección hipocampal de retrovirus para expresar proteínas fluorescentes en las GC generadas en el adulto y, luego de cuatro semanas, se obtuvieron rodajas agudas del hipocampo de los ratones inyectados. Mediante imágenes de calcio y electrofisiología, analizamos tres aspectos de la capacidad de procesamiento de información: En primer lugar, estudiamos el reclutamiento de las 4wpiGC y las matGC frente a la estimulación de la vía perforante medial (MPP), la principal aferencia al giro dentado. Observamos que las 4wpiGC se activan con estímulos más débiles que las matGC, constituyendo una población de neuronas con mayor excitabilidad. Estas diferencias están generadas por un mayor balance excitación/inhibición de las corrientes evocadas en las 4wpiGC, dado por una inhibición menor y más lenta en comparación con las matGC. En segundo lugar, analizamos la habilidad de las GC de integrar o separar dos inputs de la MPP. Los resultados muestran que hay un mayor porcentaje de 4wpiGC que de matGC que responde frente a la estimulación de dos inputs independientes, lo cual sugiere que las 4wpiGC son más integradoras y las matGC, más selectivas. Esta característica de las 4wpiGC es transitoria, dado que cuando las GC nacidas en el adulto maduran se comportan como las matGC, nacidas durante el desarrollo. Por último, estudiamos la capacidad de las GC de decodificar información temporal. Estimulando la MPP con trenes de pulsos a distintas frecuencias, observamos una mayor activación de las 4wpiGC a todas las frecuencias estudiadas, si bien tanto las 4wpiGC como las matGC se comportan como filtros pasa bajos. Los circuitos inhibitorios son los principales responsables de las diferencias observadas en la activación, tanto entre 4wpiGC y matGC, como entre las frecuencias. Concluimos que la neurogénesis adulta le provee al hipocampo de poblaciones de GC inmaduras que presentan capacidades de procesamiento únicas. La inhibición surge como un mecanismo que genera heterogeneidad de respuestas en las poblaciones de GC del giro dentado.

Las bacterias ácido lácticas (BAL), además de contribuir a la estructura, textura y aroma de masas ácidas mejoran la calidad nutricional y promueven efectos beneficiosos para la salud de los consumidores. En el presente trabajo se estudió el efecto de cuatro cepas de BAL sobre la microestructura y estructura secundaria y terciaria de las proteínas de gluten de masas ácidas con y sin agregado de miel. Durante la fermentación, la acidificación producida por las BAL, junto con la actividad de enzimas endógenas de cereales, produce la hidrólisis de las proteínas e inducen modificaciones en su microestructura y sobre las conformaciones de sus proteínas. En todas las masas fermentadas, la proporción relativa de estructuras β-sheet se incrementó, principalmente, en detrimento de la conformación α-hélice. La actividad fermentativa de L. bulgaricus y P. pentosaceus se caracterizó por promover el desplegamiento de las proteínas y, por una configuración β-sheet antiparalela que duplicó al valor obtenido en el gluten nativo. Esta conformación resultó en una microestructura dispuesta espacialmente como una red interconectada de fibras de espesor variable. L. plantarum, presentó la pendiente de acidificación más pronunciada y las proteínas de gluten adquirieron una microestructura laminar. En todas las masas fermentadas, la estructura terciaria de las proteínas estuvo caracterizada por una disminución de la banda disulfuro, respecto del gluten nativo. En particular, L. fermentum experimentó la mayor disminución en la intensidad de esta banda. Coincidente con este resultado, la microestructura adquirió un aspecto discontinuo y poco cohesivo. Sin embargo, la suplementación de estas masas con miel mejoró significativamente su cohesividad, resultando en una matriz hiperconectada de proteína.

This work aims to experimentally study the temporal evolution of the interaction between turbulent flow and scour processes around a bridge abutment, which has a flexible bed protection. A series of laboratory experiments was performed in a rectangular channel where a prismatic abutment is located, protecting the nearby channel bed with a blanket consisting of blocks attached to geotextile. Two experimental methodologies were used: a) continuous characterization of the evolution of the bed and turbulent flow in defined locations around the bridge abutment and, b) detailed measurement of 3D flow field for four different channel bed configurations, corresponding to different times of the evolution of the scour process. In addition, the interaction between turbulent flow and scour processes around an unprotected bridge abutment is studied in order to contrast the results for the same hydraulic conditions. Flow velocity measurements were performed using two velocimetry techniques: Large-scale particle tracking velocimetry (LSPTV) an acoustic Doppler velocimeter (ADV). The experimental work presented here made it possible to have a detailed data set of flow velocities and scour depths, available for validation of numerical models. The temporal evolution of two-dimensional and three-dimensional flow fields have been analyzed according the erosion develops. Mean flow patterns associated with the morphology of the resulting channel bed were identified. In addition, it was verified the interaction between the behavior of turbulence parameters (energy associated with flow velocity fluctuations and Reynolds stresses) and the development of scour around a protected bridge abutment.

El objetivo fue comparar absorción y retención de Ca, y cambios en la composición corporal y en diferentes parámetros del metabolismo energético durante el crecimiento. Ratas espontáneamente obesas (IIMb/β) (O) y ratas Wistar (W), fueron apareadas; las madres se alimentaron con una dieta isocalórica con diferentes concentraciones de Ca: Alto (ACa: 0.9%), Normal (NCa: 0.5%) y Bajo (BCa: 0.2%). Las crías macho continuaron recibiendo la misma dieta materna hasta los 60 días de edad (ACa, NCa y BCa). En O, el PC fue inverso al contenido dietario de Ca sin diferencias en % de agua; OBCa presentó el menor % corporal de proteínas (p<0.01). El %ACa fue inverso al contenido de Ca de la dieta y el %A grasas no se modificó. OBCa presentó los mayores niveles de TGL, glucosa, insulina en ayunas, y HOMA-IR (p<0.01) y el menor valor de Ca y P corporal, CMO del esqueleto total y DMO de tibia y columna (p<0.01). OACa presento similar %Ca corporal pero CMO del esqueleto total y DMO de tibia proximal y columna fueron menores que ONCa (p<0.01). En W, AWCa presentó mayor % de grasa que los otros dos grupos (p<0.01). WBCa y WACa presentaron % de proteínas y cenizas menores a WNCa (p<0.01). WACa presentó los mayores niveles de TGL, glucosa, insulina y HOMA-IR (p<0.01) y WBCa mayores que WNCa (p<0.01). Al comparar O con W se observó en O mayor depósito graso y menor % de proteínas para una misma dieta experimental, menor niveles de marcadores bioquímicos y mayores niveles de glucosa, insulina, TGL y HOMA-IR. La BGP guardó una relación inversa con dichos parámetros y directa con CTX. Conclusiones: Durante el período de crecimiento, la baja ICa o relación Ca/P dietaria modularía el PC, induciendo cambios en la composición corporal. La masa grasa no sería beneficiosa para la salud ósea. La BGP se asocia negativamente a la glucosa en ayunas y resistencia a la insulina; la deficiente ingesta de Ca induce cambios más negativos.

Duhart, J. (2019). Interacción entre el sistema inmune y el reloj biológico. (Tesis de posgrado). Universidad Nacional de Quilmes, Bernal, Argentina.

La adquisición de independencia hormonal en carcinomas mamarios con expresión de receptores para hormonas esteroides es un fenómeno frecuente con gran relevancia clínica. En este trabajo, abordamos el estudio de un posible mecanismo de activación ligando independiente del receptor de estrógenos alfa (REα). Nuestra hipótesis se desprende de observaciones anteriores del laboratorio en las cuales observamos que el factor de crecimiento fibroblástico 2 (FGF2), podía activar al receptor de progesterona (RP) a través del receptor para dicho factor (FGFR-2) en el modelo experimental murino C4 y en células de cáncer de mama humano T47D. Por otro lado, habíamos comprobado que el REα era necesario para que el RP fuera transcripcionalmente activo. Con estas evidencias decidimos investigar si existía un interacción entre la vía de FGF2 y el REα. Se eligieron para este trabajo las líneas celulares de cáncer de mama humano MCF-7, por ser la línea más frecuentemente utilizada para evaluar la funcionalidad del REα, y la T47D, más utilizada para evaluar la función del RP, aunque también se estimulan con estrógenos. Al tratar ambas líneas celulares con FGF2, encontramos un aumento en su proliferación, que fue revertido tanto con inhibidores de FGFRs, como con el antiestrógeno puro ICI 182780 (ICI). Dicho incremento estaba acompañado por un aumento de la fosforilación de las serinas 118 y 167 del REα en correlación con un aumento de la activación de las quinasas responsables de fosforilar a estas serinas, MAPK y Akt respectivamente. Más aún, experimentos de silenciamiento del REα confirmaron que el mismo estaba involucrado en el efecto estimulatorio de la proliferación celular del FGF2. Con estos resultados, exploramos posteriormente la funcionalidad del REα en respuesta a FGF2, demostrando que el REα era capaz de inducir la expresión de un gen reportero luego del tratamiento con FGF2 y que no sólo era capaz de interactuar con su secuencia consenso en una construcción de ADN recombinante, sino que también se unía a esta secuencia en el ADN endógeno, induciendo la expresión de c-MYC y pS2. En particular la expresión de este último gen es considerado un indicador confiable de la activación del REα. Luego de evaluar la interacción de las vías de FGF2 y REα en células MCF-7 y T47D, desarrollamos un modelo con activación constitutiva del FGFR-2 al que denominamos MCF-7 R2CA (R2CA). Estas células fueron seleccionadas hasta obtener una transfección estable, y la línea resultante presentó una morfología similar a las células control. La línea R2CA expresó mayores niveles de MAPKs fosforiladas y al evaluar la fosfoserina 118 del REα, si bien se vio un aumento de su proporción con respecto al control de carga, al relativizarlo con los niveles de REα totales no se evidenció un aumento específico ya que las células R2CA expresaron mayores niveles de REα total. Sin embargo, el efecto final resultó en una mayor activación de esta vía corroborada además, no sólo por la inducción del RP en condiciones basales, sino por un aumento en la expresión del gen pS2, marcador de actividad transcripcional del REα. Curiosamente, no se observaron modificaciones en pAkt lo que sugiere que otros FGFR estarían más asociados a la activación de Akt por FGF2, mientras que FGFR-2 involucraría a Erk. Evaluamos también el crecimiento in vivo del modelo R2CA en comparación con el control que no crece sin el aporte hormonal exógeno. Demostramos que la activación constitutiva del FGFR-2 le confiere una ventaja proliferativa sobre las células control ya que se pudieron establecer como xenoinjertos aunque su crecimiento fue mayor con el tratamiento con estrógenos, resultados que se condicen con los estudios in vitro en los cuales se observó que se activa la vía de Erk pero no la de Akt. Posteriormente, se evaluó la relación entre las vías de REα y FGF2 en un modelo murino de cáncer de mama. En nuestro laboratorio se desarrolló un modelo de tumores por administración prolongada de acetato de medroxiprogesterona (MPA) en hembras vírgenes de ratones BALB/c. Se establecieron líneas que necesitan la administración de MPA para crecer, denominadas hormono-dependientes, entre ellas la C4-HD, variantes que no necesitan la hormona para crecer (hormono-independientes) como la variante C4-HI y variantes independientes de hormonas y resistentes a antiprogestágenos (hormono-independientes resistentes) como la C4-HIR. Lo interesante de este modelo es que mientras en el tumor C4-HD el tratamiento con progestágeno activa al REα y es completamente sensible al tratamiento con antiestrógenos, la variante C4-HI muestra una activación basal del REα medida por fosforilación en las serinas 118 y 167, y es moderadamente sensible al tratamiento con el antiestrógeno Fulvestrant. En concordancia, cuando tratamos a los tumores con los inhibidores específicos de los FGFRs los tumores son parcialmente sensibles y los tumores tratados muestran una disminución en la fosforilación de las dos serinas mencionadas del REα, indicando una interacción cruzada de estas vías en el modelo. Otra área de interés en el laboratorio es la regulación epigenética en relación con la adquisición de hormono independencia en cáncer de mama. En trabajos previos de nuestro grupo se estudió el rol de la metilación en los mecanismos de resistencia a antiprogestágenos. En este trabajo de tesis decidimos estudiar el papel de los miRNAs (miRNAs) en la progresión hacia la resistencia endócrina. Se analizó la expresión de más de 300 miRNAs en un microarray, para las tres variantes mencionadas de la familia C4. Como contábamos con la información del transcriptoma de C4-HD y C4-HI, decidimos cruzar los datos con los obtenidos del array de miRNAs. Analizamos todos los genes potencialmente regulados por algún miRNA sobre o sub expresado en cada comparación, y evaluamos cómo era su expresión en el transcriptoma conocido. De los genes obtenidos, se destacaban tanto FGFR-2 como STAT5. En particular STAT5 es un gen que codifica para una proteína que ya habíamos estudiado en el modelo experimental y podría formar parte de un complejo con FGFR-2 y mediar efectos transcripcionales a través de RP. Encontramos también como candidato interesante a PTEN, una fosfatasa involucrada en la vía de señalización de Akt, que tiene relevancia en la activación de REα ligando independiente. Nos centramos en 5 miRNAs, de los cuales el miR-1 se destaca por ser el único sobre expresado en C4-HIR al compararlo con C4-HI, aunque no se pudo validar; los miRNAs 335 y 222, para los cuales no observamos diferencias significativas entre los tres tipos de tumores; y los miRNAs 31 y 155, los cuales aumentaban su expresión en las distintas variantes tumorales con estadios más avanzados de progresión tumoral: C4-HI mostró mayores niveles que C4-HD y C4-HIR que C4-HI (p<0.001). Ambos miRNAs se encuentran involucrados en la vía de señalización de FGF2 sugiriendo su participación en la progresión hacia la resistencia hormonal en este modelo, a través de la regulación de esta vía. Estos resultados también sugieren que la expresión de estos miRNAs podría ser utilizada como marcador de progresión tumoral. En conclusión FGF2 es capaz de activar tanto a REα como a RP en forma ligando independiente y la activación de esta vía de señalización participaría en la progresión del cáncer de mama.

La luz provee a las plantas la energía necesaria para la fotosíntesis e información sobre el ambiente. Las señales lumínicas son percibidas por fotorreceptores específicos. En Arabidopsix thaliana se identificaron y clonaron tres grupos de fotorreceptores: los fitocromos que son fotorreceptores de de luz roja (R) y roja lejana (RL), que son codificados por cinco genes (PHYA,PHYB,PHYC,PHYD,PHYE); los criptocromos que son fotorreceptores de luz azul, codificados por dos genes (CRY1 y CRY2) y las fototropinas. Los fitocromos y criptocromos tienen funciones independientes y coordinadas que regulan el desarrollo de las plantas durante todo el ciclo de vida. El objetivo de esta tesis es estudiar la interacción entre fitocromos (específicamente phyA y phyB ) y criptocromos (cryl y cry2) en distintas respuestas durante el desarrollo de Arabidopsis thalíana. Para cumplir este objetivo hemos obtenido los dobles, triples y cuádruple mutantes a partir de los simples mutantes de phyA, phyB, cry1 y cry2 para analizar el efecto de un fotorreceptor en ausencia/presencia de los demás fotorreceptores. El uso de los simples, dobles, triples, y cuadruple mutantes permitió revelar nuevas interacciones entre los fotorreceptores e identificar funciones no conocidas de los mismos. En plántulas etioladas expuestas a luz R, el phyA mostró un efecto dual. Cuando el phyA fue activado con bajos flujos de luz R produjo por un lado la inhibición del alargamiento del hipocotílo, y por otro lado, redujo la inhibición del alargamiento del hipocotílo mediado por el phyB, es decir que el phyA interactuó antogonísticamente con el phyB. En nuestras condiciones, el phyA retrasó la transición del estado vegetativo al reproductivo, sólo en determinados contextos genéticos: cry1, cry2 y cry1 cry2, poniendo en evidencia un nuevo rol del phyA en el control de la floración. El phyB y el cry1 fueron redundantes en la represión del alargamiento del entrenudo, y la ausencia de ambos permitió demostrar que el alargamiento del tallo no está obligadamente acoplado al desarrollo reproductivo. La redundancia entre phyB y cry1, sin embargo, fue condicional a la temperatura. En la inhibición del alargamiento del hipocotílo, el phyB y el cry1 interactuaron sinergísticamente. La interacción del phyB y el cry1 en ésta respuesta fue condicional al ambiente lumínico. En la mayoría de las respuestas el cry2 fue redundante con el cry1. La interacción del cry2 con phyA y phyB en las distintas respuestas durante el desarrollo puede dividirse en dos patrones, en el primero la actividad del cry2 requirió la presencia de phyA y phyB (efecto sinérgico), y en el segundo requirió la ausencia de phyA y phyB (efecto redundante). El análisis del comportamiento del cuádruple mutante phyA phyB cry1 cry2 mostró que la deficiencia en la percepción de luz durante el desarrollo no está restringida sólo a la des-etiolación sino que continúa incluso hasta al estadío adulto. Basados en los datos de esta tesis y de la literatura presentamos un modelo de los patrones de interacción para dos procesos: des-etiolación y floración. Las interacciones observadas en condiciones de radiación natural entre los fotorreceptores reflejan aquellas observadas en condiciones controladas. La compleja red de interacciones entre fitocromos y criptocromos en condiciones de radiación natural generó homeostasis en la des-etiolación contra los cambios en irradiancia y fotoperíodo que no forman parte de la señales relacionadas con la posición del vástago por debajo o por encima de la superficie del suelo. El phyA, phyB, cry1 y cry2, se acoplan con diferentes jerarquías durante el desarrollo de Arabidopsis. La dependencia o redundancia entre las vías es afectada por las condiciones ambientales, el estado ontogénico y el contexto genético. La redundancia entre los fotorreceptores en el control de los procesos del desarrollo genera estabilidad del fenotipo que evita caer en patrones aberrantes, mientras que las jerarquías entre los fotorreceptores permite un patrón específico de crecimiento y desarrollo bajo señales lumínicas particulares.

Las señales de Ca²⁺ son ubicuas y juegan un rol importante en numerosos procesos fisiológicos como la fertilización o la muerte celular. Su versatilidad se basa en la variedad de comportamientos espacio-temporales que puede mostrar la concentración de calcio intracelular y en que distintos comportamientos pueden inducir respuestas diferentes. La liberación de Ca²⁺ desde el retículo endoplasmático (RE) hacia el citosol a través de receptores de inositol 1,4,5-trifosfato (RIP3s) es una componente clave dentro de los mecanismos de señalización por Ca²⁺. Los RIP3s necesitan unir IP3 y Ca²⁺ para abrirse por lo que la liberación de Ca²⁺ a través de un único RIP3 puede inducir la apertura de otros canales vecinos, mecanismo que se conoce como liberación de calcio inducida por calcio o CICR por las siglas en inglés. Los RIP3s aparentemente se organizan en cúmulos sobre la membrana del RE (clusters). Si el CICR se encuentra limitado a un cluster, las señales pueden permanecer localizadas (puffs). En caso contrario, pueden convertirse en ondas que se propagan entre clusters. Los puffs son los ladrillos de construcción de esas señales más globales que se propagan por toda la célula. Por este motivo, existe un gran interés en la determinación de las propiedades de los puffs, especialmente en vista de la actual controversia sobre la distribución espacial de los RIP3s activables. Las señales de calcio, por otro lado, pueden remodelarse a través de varios mecanismos, entre ellos, el atrapado del Ca²⁺ por parte de buffers. Éstos no sólo disminuyen la concentración de Ca²⁺ libre sino que modifican su distribución espacio-temporal de distintos modos dependiendo de su cinética. Los puffs de Ca²⁺ se han observado en células intactas con técnicas ópticas mostrando que son intrínsecamente estocásticos. La obtención de una imagen correcta de la dinámica de los eventos entonces implica ser capaz de detectar todo el rango de tama~ nos de puffs. Éstos se observan usando indicadores de Ca²⁺ de una longitud de onda visible y buffers exógenos lentos (por ej; EGTA) para disrumpir el CICR entre clusters. Los indicadores de única longitud de onda aumentan su uorescencia al ligar calcio. De esta manera, generan imágenes que dependen fuertemente de su cinética, transporte y propiedades fotofísicas. Por este motivo, es de particular importancia determinar los artefactos que generan las condiciones del experimento. La propia existencia de los puffs depende de que los RIP3s están organizados en cúmulos. Una distribución uniforme de receptores debería dar lugar típicamente a señales propagantes tipo ondas. Los ovocitos de Xenopus laevis son un sistema experimental ventajoso para estudiar estas señales. Durante la fertilización se evoca una onda de Ca²⁺ que se propaga por toda la célula. La fertilización ocurre en el huevo maduro. Se ha observado que, al madurar el ovocito, su RE se configura y la distribución de los RIP3s parece ser más uniforme. Esto tiene un correlato en las características de las señales evocadas en los ovocitos maduros. En esta Tesis se combinaron experimentos, un análisis teórico y simulaciones numéricas para evaluar de qué modo la geometría de la distribución de canales se combina con alguno de los otros aspectos que in uyen sobre la distribución de calcio libre para determinar las características de las señales. El primer aporte fue introducir un método que permite establecer clases equivalentes de experimentos de obtención de imágenes realizados en condiciones diferentes, donde la clase está determinada por la relación señal-ruido que predice el método. Éste también puede utilizarse para estimar el tamaño de las señales más pequeñas que pueden observarse de manera confiable con cada arreglo y para generar imágenes de uorescencia numéricamente con ruido realista. Esta Tesis también contribuyó a estudiar si la presencia del indicador o del EGTA en distintas condiciones experimentales altera la dinámica intracelular de Ca²⁺, en particular, analizar si son capaces de detectar puffs de Ca²⁺ con similar precisión y de qué modo las distintas configuraciones experimentales afectan las propiedades de los puffs observados y la dinámica del Ca²⁺ subyacente. Se pudo determinar que aunque el indicador o el EGTA no alteran la dinámica intracluster del Ca²⁺, el conjunto de eventos observables del experimento es diferente dependiendo del grado de acoplamiento entre clusters. El estudio, por otro lado, permitió inferir que los puffs con mayor liberación de Ca²⁺ provienen de cúmulos donde los RIP3s están muy cerca unos de otros. Para estudiar en más detalle la disrupción del CICR entre clusters vecinos que inducen los buffers lentos, se realizaron experimentos utilizando simultáneamente dos indicadores de calcio de distinta cinética. Utilizando el método introducido pudimos confirmar nuestra conclusión previa sobre cómo se modifica el conjunto de eventos que se evoca en presencia de buffers lentos. Por otro lado, determinamos que la presencia de buffers rápidos da lugar a liberaciones de Ca²⁺ más prolongadas tal vez debido a que reducen el efecto inhibidor del Ca²⁺ sobre los RIP3s. En relación a la razón por la que los buffers lentos disrumpen el acoplamiento entre clusters pudimos concluir que su presencia disminuye el Ca²⁺ basal, aunque no tanto como para explicar la disrupción. El análisis de la diferente distribución espacio-temporal de los buffers lentos y rápidos parecería indicar la presencia de RIP3s en el espacio entre clusters que podrían ser "silenciados" por los buffers lentos evitando así la propagación de las señales entre cúmulos. Finalmente, en la Tesis se han mostrado también resultados preliminares de señales de calcio que se observan en células maduradas, cuyos cambios pueden explicarse en términos de una distribución espacial distinta de RIP3s.

El desenlace de la infección por Trypanosoma cruzi (T. cruzi) es el resultado de una compleja serie de interacciones donde los mismos mecanismos que se ponen en marcha para contener al parásito son también capaces de inducir daño tisular. En función de ello es evidente que el desarrollo de la respuesta anti-infecciosa estará acompañado de una respuesta reguladora inmuno- endócrina orientada a reducir las consecuencias patológicas de esta tripanosomiasis. En este proceso de auto-control podrían tener un papel particular las células T reguladoras (Tregs) y los glucocorticoides (GCs). Los linfocitos Tregs CD4+FoxP3+ constituyen una población inmunosupresora que puede actuar sobre poblaciones efectoras por contacto directo o mediante la secreción de citocinas inmunoreguladoras. Por otra parte, las citocinas pro-inflamatorias producidas durante un proceso inflamatorio o infeccioso, activan el eje hipotálamo pituitario adrenal (HPA) con la consiguiente liberación de GCs, los que ejercen efectos inmunosupresores sobre la respuesta inmune. A su vez Los GCs podrían favorecer el desarrollo de las Tregs durante procesos nflamatorios, sin embargo esta posibilidad no se ha investigado en profundidad en procesos infecciosos. En nuestro laboratorio se han caracterizado dos modelos de infección experimental murina con T. cruzi que muestran una diferente resolución de la enfermedad aguda. Mientras que los animales C57BL/6 presentan un 100% de mortalidad como consecuencia de una respuesta inflamatoria exacerbada, la cepa BALB/c es parcialmente resistente a la infección y exhibe una respuesta defensiva más balanceada. El objetivo de este trabajo fue evaluar el papel que las Tregs podrían desempeñar en el patrón de susceptibilidad/resistencia previamente observado y en las alteraciones inmunológicas que tienen lugar a nivel tímico durante la infección con T. cruzi. Los estudios también apuntaron a analizar la relación que se establece entre las células Tregs y los GCs, como así también a la manipulación de la población Treg como potencial estrategia inmuno-moduladora en la infección chagásica. Los resultados obtenidos indican que el perfil de resistencia observado en los animales BALB/c se asocia a mayores niveles basales de Tregs en la periferia y a una expansión más eficiente de esta población, lo cual se refleja en un mejor balance homestático entre células Treg y células T efectoras (Tef). Por el contrario, en los animales C57BL/6, la mayor susceptibilidad se asocia a un cierto grado de parálisis de la población de células Tregs, lo cual sugiere que los mecanismos supresores serían largamente superados por la respuesta efectora. Además, y en relación a esto último, mostramos que los GCs endógenos serían necesarios para mantener el balance Tef/Treg durante el curso de la infección. Por último, revelamos que la administración de Dex+IL-2 puede modular positivamente el balance Tef/Treg e influenciar de forma diferencial el curso de la infección. Estudios futuros que recurran a esta estrategia permitirían optimizar terapias que expanden específicamente a las Tregs en otros contextos inflamatorios.