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Fil:McAllister, Claudia Beatriz. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

El Síndrome Urémico Hemolítico (SUH), enfermedad caracterizada por anemia hemolítica, trombocitopenia y falla renal aguda, está asociado a infecciones enterohemorrágicas con Escherichia coli productores de toxina Shiga (Stx) (STEC). Si bien el daño endotelial, generado por Stx, ha sido reconocido como el principal evento que conduce al estado protrombótico en el SUH, existen otros mecanismos que todavía no han sido completamente identificados. La interacción entre la respuesta trombótica e inflamatoria ha sido recientemente reportada en diversas patologías y dada la importancia de ambas en el SUH, hipotetizamos que podría tener un rol destacable en su desarrollo. En efecto, nuestro objetivo fue evaluar los mecanismos de activación de la respuesta trombótica y su interacción con la respuesta inflamatoria en el SUH. Utilizando un modelo murino de SUH, detectamos que Stx2 indujo directa o indirectamente una marcada activación plaquetaria que contribuyó con la respuesta inflamatoria a través de la activación del sistema de complemento y la formación de complejos entre Plaquetas y leucocitos polimorfonucleares (PMN). Por otro lado, en un sistema in vitro, se vió que Stx2 indujo un daño endotelial que derivó en la activación y adhesión plaquetaria. Por último, en ambos modelos, se observó la capacidad del antioxidante N-acetil-L-Cisteína (NAC) de prevenir los efectos protrombóticos de Stx2. En conclusión, en esta tesis hemos descripto como Stx2, mediante el daño endotelial, activa la respuesta trombótica y como el estrés oxidativo contribuye a este proceso. Asimismo hemos probado la participación de las plaquetas en la activación de la respuesta inflamatoria. Finalmente, dados los efectos preventivos de la NAC proponemos su uso en la etapa prodrómica de la diarrea.

Existe numerosa evidencia que indica que los progestágenos están involucrados en el control de la tumorigénesis mamaria. A pesar de ello, los mecanismos por los cuales las hormonas esteroideas estimulan el crecimiento de células de cáncer de mama no han sido todavía descifrados completamente. Uno de los mecanismos propuestos ha sido la regulación de la expresión de factores de crecimiento que actuarían como mitógenos de las células tumorales. En particular, se ha demostrado previamente en el laboratorio que Heregulina (HRG), ligando de receptores con actividad de tirosina quinasa (RTK) tipo I, estimula el crecimiento de células epiteliales provenientes de cultivos primarios del tumor mamario progestágeno-dependiente C4HD y potencia los efectos mitogénicos del acetato de medroxiprogesterona (MPA) (Balañá et al., 1999; 2001). La primera parte del presente trabajo se centró en el estudio de interacciones entre los caminos de señalización activados por progestágenos y por RTKS tipo I y II en el modelo de carcinogénesis mamaria inducida por acetato de medroxiprogesterona en ratones Balb/c (Molinolo et al., 1987; Lanari et al., 1989). El tratamiento de las células C4HD con MPA indujo tanto el aumento de los niveles proteicos de ErbB-2 como el aumento de su fosforilación. Habíamos demostrado anteriormente que el receptor tipo I del factor de crecimiento similar a la insulina (IGF-IR) y el ErbB-2 están involucrados en la proliferación de estas células mediada por MPA. Al estudiar el bloqueo simultáneo de ErbB-2 y IGF-IR sobre la proliferación inducida por MPA, no se observaron efectos aditivos ni sinérgicos. Efectos aditivos hubieran sido esperados si IGF-IR y ErbB-2 activaran vías de señalización independientes. Una interacción sinérgica hubiera existido si el camino de transducción de señales activado por uno de los receptores potenciara el del otro receptor. Por lo tanto tan sólo un mecanismo que involucrara una interacción jerárquica entre IGF-IR y ErbB-2, en el cual uno de ellos es esencial para la activación de del otro, podía explicar nuestros resultados. En efecto, al suprimir la expresión del IGF-IR, la fosforilación del ErbB-2 inducida por MPA se vio totalmente inhibida. Sin embargo, el bloqueo de la síntesis de ErbB-2 no afectó la fosforilación del IGF-IR. Estos resultados muestran la existencia de una interacción jerárquica entre IGF-IR y ErbB-2; por medio de la cual IGF—IR dirige la activación de ErbB-2. Se demostró, por primera vez, que esta interacción involucra la asociación física de ambos receptores en un complejo heteromérico. Es más, experimentos de microscopía confocal laser mostraron que el MPA fue capaz de inducir la co-localización de ErbB-2 y IGF-IR. El propósito de la segunda parte del trabajo fue el de investigar la capacidad de HRG de activar al receptor de progesterona (RP) utilizando el mismo modelo experimental que en la primera parte. Es así que pudimos observar que HRG fue capaz de regular las características bioquímicas del RP en forma similar a la efectuada por la activación del receptor luego de la unión a un progestágeno. Se encontró que HRG fue capaz de inducir una disminución de los niveles proteicos de ambas isoformas, A y B, del RP y de disminuir la cantidad de sitios específicos de unión a progestágenos. Además, el tratamiento con HRG produjo un aumento de la proporción de RP con localización nuclear. Estudios posteriores nos permitieron saber que el tratamiento con HRG podía también inducir la unión del RP a su elemento respondedor en el ADN(PRE) y aumentar la transcripción de un gen reportero que contenía dos PRE en su promotor. Un antiprogestágeno como el RU486 provocó la inhibición de la activación transcripcional del RP mediada por HRG. Al profundizar en los mecanismos moleculares que estaban involucrados en los efectos de la HRG sobre el RP, pudimos observar que era necesaria la presencia de ErbB-2 funcional así como de proteínas quinasas activadas por mítógenos (MAPK) en su estado activo. Es más, MAPKs activadas por HRG tuvieron la capacidad de fosforilar al RP en ensayos de fosforilación in vitro. Los mismos estudios se realizaron en la línea de carcinoma mamario humano T47D obteniéndose resultados similares. Nuestros resultados mostraron que, en ausencia de progestágenos, HRG activa al RP tanto murino como humano mediante un mecanismo que requiere la presencia de ErbB-2 funcional así como la activación de MAPKs.

Uno de los desafíos de la biología tumoral consiste en la búsqueda de mecanismos que vinculen fenómenos de hipoxia y angiogénesis. En función del papel crítico de galectina- 1 (Gal1) en la progresión tumoral investigamos su relevancia en fenómenos de neovascularización. El análisis funcional del perfil de glicosilación de células endoteliales reveló una amplificación preferencial del repertorio de glicanos críticos para la unión de Gal1 en células endoteliales expuestas a estímulos tolerogénicos, proliferatívos e hipóxicos típicos de microambientes tumorales. De acuerdo a estos hallazgos, observamos que Gal1 interacciona con células endoteliales principalmente en N-glicanos promoviendo proliferación, migración/invasión y tubulogénesis a través de mecanismos dependientes de las vías de señalización de VEGFR2, PI3K-Akt y Erk1/2, mimetizando de este modo el efecto biológico del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF). Por otro lado, verificamos que Gal1 se encuentra asociada a Nglicanos presentes en VEGFR2 e induce su activación y segregación en estructuras tipo "lattices". En tal sentido, los fenómenos de migración y tubulogénesis inducidos por Gal1 fueron bloqueados al utilizar anticuerpos anti-VEGFR2 o al inhibir la disponibilidad de N-glicanos complejos en células endoteliales. A los fines de evaluar la regulación de la expresión de Gal1 en células tumorales se incubaron células de Sarcoma de Kaposi (KS) en condiciones de hipoxia (1% O2), observándose un incremento marcado en la expresión de esta lectina a través de mecanismos dependientes de la activación del factor de transcripción NF-κB y especies reactivas del oxígeno (ROS) e independientes del factor inducible por hipoxia (HIF)-1α. Dicha expresión fue crítica para el crecimiento y la neovascularización de tumores humanos KS y murinos B16 in vivo. La relevancia fisiopatológica de estos hallazgos fue determinada a través de la inhibición de la expresión de Gal1 utilizando estrategias de silenciamiento (shRNA). El bloqueo de la expresión génica de Gal1 logró inhibir la capacidad pro-angiogénica de tumores KS in vivo e in vitro. El análisis por inmunohistoquímica de diversas patologías vasculares humanas reveló que Gal1 se expresa selectivamente en patologías malignas, confirmando el impacto clínico de nuestros hallazgos. Finalmente, y con el objetivo de validar una estrategia terapéutica basada en el bloqueo de Gal1 en el microambiente tumoral, desarrollamos un panel de anticuerpos monoclonales anti-Gal1 bloqueantes los cuales lograron neutralizar los efectos pro-angiogénicos e inmunosupresores de esta lectina in vitro e in vivo. En forma notable, el bloqueo de Gal1 en tumores B16 logró remodelar la vasculatura tumoral e inducir un marcado incremento en el infiltrado inflamatorio, el cual fue capaz de montar respuestas antitumorales dependientes de células Th1 y Th17. Este efecto fue asociado no sólo al bloqueo de la capacidad inmunosupresora de Gal1 sino también a un efecto ‘normalizador’ sobre el endotelio permitiendo la maduración de pericitos y el influjo de células T al parénquima tumoral. En conjunto, los resultados del presente trabajo de tesis demuestran que Gal1 participaría activamente en la generación de un microambiente tumoral pro-angiogénico e inmunosupresor, en el cual la hipoxia, a través de la expresión de esta lectina y sus glicanos, modularía compartimientos inmunológicos y vasculares, favoreciendo fenómenos de angiogénesis y crecimiento tumoral. De este modo, el presente estudio permite vincular, a partir del reconocimiento de lectinas y sus ligandos específicos fenómenos de hipoxia con programas inmunológicos y de neovascularización. A su vez sugiere nuevos enfoques en el diagnóstico y tratamiento de tumores, dando luz a la primera herramienta terapéutica capaz de modular en forma específica la interacción entre Gal1 y sus glicanos interrumpiendo simultáneamente fenómenos de angiogénesis y escape tumoral.

Ya que nuestro conocimiento de los sistemas naturales se basa, en buena medida, en las propiedades de las membranas artificiales, comenzamos por analizar las características polimórficas, la estructura y la dinámica de organizaciones lipídicas. La complejidad crece en cada caso al mezclar lípidos con cabezas polares químicamente distintas, longitudes de cadena y grados de insaturación variables. Naturalmente, surgen las atracciones y repulsiones de las moléculas de fosfolípidos entre sí y con el colesterol, conduciendo a separaciones laterales de fases en el plano de la membrana. Las proteínas interrumpen la organización lamelar, modificando las propiedades físicas de los lípidos y presentando ellas mismas cambios en su conformación, generados por las moléculas del entorno. Si avanzamos un poco más, vemos que hasta la funcionalidad de la molécula proteica depende de su interacción con los demás componentes de la membrana: la actividad enzimática está modulada por la interacción lípido-proteína. Estas interacciones son estudiadas, generalmente, con proteínas purificadas en sistemas reconstituidos. Es cierto que este procedimiento permite el desarrollo de experimentos en condiciones controladas, así como la evaluación independiente de la relación causa-efecto para las distintas variables del sistema. Pero también es cierto que el método de purificación-re constitución destruye la compleja riqueza de la regulación en la membrana nativa. Las membranas naturales aparecen como estructuras dinámicas y altamente heterogéneas en el plano lateral y transversal, donde conviven estructuras lamelares con no-lamelares, gradientes de fluidez con "ánulus" inmovilizados, creando todos ellos el medio propicio, para la expresión de la actividad catalítica de las enzimas de membrana. Y es en una membrana natural donde se llevaron a cabo los experimentos para conocer las relaciones que vinculan la composición lipídica, la estructura dinámica y la cinética de enzimas de membrana, que se detallan en el presente trabajo.

En este trabajo se estudian los sistemas nebulares (gas ionizado) localizados en las regiones más externas de potentes radiogalaxias y conocidos como Regiones Extendidas con Emisión de Líneas (EELR). Fueron descubiertos en forma sistemática mediante observaciones con el Telescopio Espacial Hubble (HST). Las propiedades que las definen desde su propio nombre son las grandes distancias hasta las cuales es posible localizarlas, superando el alcance de la componente estelar en las mismas imágenes del HST, y el tipo de líneas de emisión que componen su espectro. El estudio consta de la determinación del proceso de ionización dominante en la zona, mediante la comparación de los dos principales mecanismos posibles: la ionización de las nebulosas por parte del campo de radiación emitido por la fuente central, y la ionización por ondas de choque radiativas, desencadenadas por la interacción de la radiofuente, en particular, sus jets, con el medio que atraviesa (sólo en un objeto los procesos de choque estarían desencadenados por otro mecanismo). Los análisis requieren de la evaluación de las propiedades físicas del sistema gaseoso, ya sea la profundidad óptica, la distancia que las separa de la fuente puntual, el comportamiento espacial de la emisión o sus características cinemáticas, para poder estudiarlas bajo las hipótesis de cada modelo. El rol que desempeñe el núcleo activo nunca será despreciable, sin embargo, el interés por el estudio sistemático de la interacción entre los jets y el material interestelar radica en que este mecanismo podría explicar el estado de ionización de las EELR de la mano de su estado cinemático. La técnica empleada fue la espectroscopía óptica de ranura larga (long-slit). Todos los espectros nebulares se tomaron especialmente para el desarrollo de esta Tesis con el instrumento GMOS del Telescopio Gemini Norte (TGN). La excelente calidad de los datos obtenidos permitió completar las tres líneas principales de la investigación: el análisis espectroscópico, el comportamiento espacial de la emisión y la cinemática de la región. El objetivo principal fue obtener una explicación tan global como fuera posible sobre las características multibanda de la emisión, con especial énfasis en la relación espacial que pudiera haber entre la emisión y la cinemática en las distintas bandas del espectro, y en la relación de alineamiento entre las estructuras en óptico y en radio. Los modelos se analizaron según sus predicciones sobre las estructuras de ionización y con la información contenida en los cocientes de líneas (diagramas de diagóstico). En general, la estructura de ionización no puede resolverse espacialmente en ninguno de los dos escenarios, pero la información contenida en el comportamiento espacial de las líneas de emisión fue determinante para evaluar el dominio de una región sobre otra y, consecuentemente, de un mecanismo de ionización sobre el otro. Se encontraron fuentes donde se puede asegurar el dominio de un mecanismo concreto, y fuentes donde se necesita la contribución de ambos para poder explicar tanto las características espectrales, como la intensidad de la radiación observada. En la mayoría de los objetos analizados (cinco de siete) la EELR está alineada con los radio-jets. Sin embargo, los resultados son compatibles no con la dirección de alineación radio-óptico sino con la información contenida en los campos de velocidades. En los casos donde se puede asegurar que la ionización ocurre predominantemente como consecuencia de procesos de choque, el campo de velocidades siempre muestra importantes indicios de movimientos de perturbación con velocidades altas. En los casos donde domina la fotoionización del campo central, las perturbaciones cinemáticas nunca son significativas.

La estructura y el funcionamiento de las comunidades vegetales dependen de la disponibilidad de nutrientes para las plantas y del consumo de biomasa por los herbívoros, que generan efectos opuestos sobre la vegetación. Para comprender el resultado de la interacción entre el pastoreo y los nutrientes sobre la vegetación es necesario considerar las distintas vías que son modificadas en simultáneo por ambos controles. El objetivo general fue estudiar la interacción entre el pastoreo doméstico y la disponibilidad de nutrientes sobre la estructura, el funcionamiento y la estabilidad temporal de la vegetación de pastizales y los mecanismos involucrados en su respuesta. Se realizó un experimento factorial en el que se manipuló la presencia de ganado doméstico y la disponibilidad de nutrientes (fertilización con N, P y K + micronutrientes; n = 6 bloques) durante 5 años en un pastizal natural bajo uso ganadero (Pampa Deprimida, Argentina). La fertilización incrementó la productividad primaria neta aérea (PPNA) bajo pastoreo, lo que combinado con aumentos en la calidad de los tejidos vegetales intensificó el consumo por el ganado y redujo la biomasa vegetal en pie. En cambio, en las exclusiones al ganado la fertilización no produjo cambios, posiblemente porque el crecimiento vegetal se encontraba limitado por la luz. Los cambios de la composición vegetal debidos al pastoreo y la fertilización, principalmente incrementos de la dominancia, se relacionaron con aumentos de la biomasa aérea. Por último, el pastoreo y la diversidad de especies y grupos funcionales de plantas promovieron la estabilidad de la PPNA, mientras que los niveles intermedios de dominancia de especies la disminuyeron. Esta tesis avanzó en el conocimiento de los mecanismos que regulan la interacción entre el pastoreo doméstico y los aumentos crónicos de nutrientes sobre la estructura, funcionamiento y estabilidad de la vegetación, lo que va a permitir mejorar las estrategias de manejo y conservación de los pastizales templados.

Tesis (Doctor en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2013

Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2016

El genotipo (G), el ambiente (A)y la interacción G x A pueden influir de manera diferente sobre las característica que definen la calidad comercial e industrial de trigo pan. Los objetivos de esta tesis fueron: 1)Caracterizar el rendimiento y a sus componentes en cultivares de trigo pertenecientes a diferentes grupos de calidad, expuestos a ofertas de nitrógeno contrastantes. 2)Estudiar el impacto de distinta disponibilidad de nitrógeno sobre los componentes fisiológicos del llenado de los granos (i.e tasa y duración)en distintaas variedades de trigo pan y su posible efecto sobre los parámetros de calidad. 3)Caracterizar y cuantificar la interacción genotipo por ambiente sobre la expresión de los parámetros que determinan el rendimiento y la calidad comercial e industrial del trigo pan en ambientes con diferentes disponibilidades de nitrógeno. Se realizaron ensayos en dos localidades, durante dos años, utilizando seis variedades de distinta aptitud panadera (2 de cada grupo de clasificación por grupo de calidad -GC-), aplicando cuatro tratamientos de fertilización nitrogenadas. Se evaluó el efecto genético, ambiental y la interacción G x A, sobre el rendimiento y sus componentes, el peso de los granos y sus componentes y sobre los parámetros de calidad comercial e industrial. Los resultados mostraron que el rendimiento y sus componentes (número de granos, biomasa aérea, eficiencia de uso de la radiación interceptada acumulada)fueron afectados principalmente por el ambiente y el manejo nutricional dentro de de cada ambiente. Para el peso de los granos y sus componentes (tasa y duración)el efecto del manejo del nitrógeno no fue importante, aunque sí lo fue el efecto genotipo. Para los parámetros de calidad el efecto genotipo fue más importante solo para la tenacidad, mientras que el peso hectolítrico, gluten húmedo, fuerza panadera, la relación de equilibrio (P/L)y volumen de pan fueron modificados principalmente por el efecto ambiente no manejable como son el año y la localidad, en tanto la proteína fue afectada principalmente por el factor ambiental asociado al manejo nutricional. La interacción GxA fue el efecto que explicó en mayor medida las variaciones de rendimiento de harina, absorción de agua y tiempo de amasado. La fuerte interacción GxA observada para la mayoría de los parámetros de calidad determinó que variedades de un determinado GC cambien de grupo asociado principalmente a factores ambientales como la localidad y el año, mientras que el manejo nutricional tuvo un impacto menor