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El objetivo de esta tesis fue dilucidar los mecanismos fisiológicos involucrados en el control de la dormición en aquenios de girasol (Helianthus annuus L.) y derivar tecnologías para su eliminación a escala industrial. Se utilizó una línea endocriada y un híbrido comercial y los resultados permitieron identificar que, en ambos genotipos, la dormición está impuesta por el pericarpio (uno de los tejidos que recubre al embrión) y su expresión ocurre sólo a altas temperaturas de incubación (i.e., 30°C). Sin embargo, no fue posible derivar un único patrón de comportamiento fisiológico para ambos genotipos. Estos patrones se encuentran gobernados por la temperatura a la que se hayan expuestos los aquenios durante la incubación (sólo se expresan a 30ºC), pero varían los componentes intervinientes en la respuesta a la dormición en cada genotipo. El pericarpio impuso limitación de oxígeno al embrión (hipoxia) y estos genotipos exhibieron diferencias en su sensibilidad embrionaria a la hipoxia a 30°C. En la línea endocriada, la principal limitación para la germinación del aquenio estuvo impuesta por la alta sensibilidad embrionaria a la hipoxia (mediada por una interferencia en la sensibilidad al ABA), que aumenta a 30ºC, la cual, en combinación con el aumento del consumo de oxígeno por la actividad (respiración) microbiana, resultó en expresión de la dormición. En aquenios del híbrido comercial, en cambio, la principal limitación para la germinación provino principalmente de la presencia del pericarpio que representa una severa restricción cuando la actividad microbiana en el pericarpio es aumentada por la alta temperatura de incubación. Esta tesis, además, permitió desarrollar una herramienta tecnológica aplicable a escala industrial, que fue la utilización del hipoclorito de sodio (agente oxidante), y, a su vez, planteó la posibilidad de aplicar un tratamiento de fungicidas y bactericidas durante el curado de las semillas en la industria semillera.

La búsqueda de genes relacionados con la patogenicidad de Beauveria bassiana, se llevó a cabo siguiendo la estrategia de estudiar la expresión de una cepa virulenta del hongo, cultivada in vitro, en condiciones nutricionales similares a las que este patógeno se encuentra sometido durante la penetración del hospedante. Para ello se utilizó como única fuente orgánica de crecimiento, una preparación de la cutícula del insecto Diatraea saccharalis, el sustrato natural cuya degradación es requerida para el establecimiento de la infección. Se aplicó la técnica de Differential display para la detección de genes que se expresaran en forma diferencial bajo esta condición. Por comparación entre los productos de amplificación de ADNc, obtenidos por RT-PCR del ARN extraído del hongo cultivado con cutícula, o sin ella, se detectaron fragmentos únicamente presentes en el primer caso. Los patrones de bandas se obtuvieron utilizando un primer oligo-dT, en combinación con decámeros de secuencia arbitraria. Se desarrolló una metodologia que consistió en la marcación de los productos de PCR con grupos fluorescentes, y su análisis en un sistema de secuenciación automática. Los fragmentos amplificados diferencialmente fueron utilizados como sondas, para estudiar el nivel de expresión de los transcriptos correspondientes, por la técnica de northern. Paralelamente, se determinó el número de copias de los genes respectivos, en el genoma de B. bassiana, mediante la técnica de southern. Se construyó una genoteca de ADN genómico de B. bassiana en un vector de sustitución derivado del fago λ. El screening de la misma con una sonda de expresión diferencial, permitió identificar un gen que codifica para una proteína deducida de 495 aminoácidos. La secuencia de la misma, presentó homología con una familia de proteínas de transporte a través de membrana, de especificidades diversas. Adyacente a dicho gen, en posición aguas arriba de la secuencia genómica, se identificó otro gen de copia única y de expresión concertada con el anterior, que codifica para la enzima quitosanasa. Con la secuencia del ADNc se comprobó la existencia de dos intrones en la estructura primaria del gen. La proteína deducida, de 232 aminoácidos, presenta 74% de identidad de secuencia con la misma enzima de otro hongo entomopatógeno, Metarhizium anisopliae. Otras tres secuencias fúngicas completan el grupo de quitosanasas eucariotas conocidas, separado de las enzimas de origen bacteriano, por análisis de agrupamiento en base a similitud de secuencia. Se propone la participación de esta enzima en la degradación de la cutícula de los insectos, por parte de los hongos entomopatógenos.