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Las técnicas modernas de microscopía de fluorescencia requieren sondas cuyos comportamientos fotoquímicos, combinados con las características ópticas del equipamiento, permitan resolver estructuras de dimensiones menores al límite impuesto por la difracción natural de la luz. Además de ser brillantes, estables, pequeñas y compatibles con el medio biológico, las sondas ideales fluorescen y se tornan oscuras de manera controlada y conocida. En esta tesis se diseñaron nuevas sondas basadas en los diheteroariletenos oxidados (DHAOs) como plataforma de fluorescencia controlada. Los DHAOs son compuestos fotocrómicos que presentan dos isómeros fotoestables, uno fluorescente y uno oscuro, alcanzados por irradiación con luz ultravioleta y visible respectivamente. Las propiedades espectroscópicas de los DHAOs se optimizaron estudiando el efecto de sustituyentes dadores y aceptores de electrones sobre las mismas. La demandante caracterización espectrofotométrica de los DHAOs se abordó con un espectrofotómetro y fotomodulador de construcción propia, el cual permitió automatizar las mediciones y explorar sistemáticamente diferentes condiciones de fotoconversión. Se descubrió que al aumentar el carácter dador de electrones del sustituyente, se estabiliza particularmente el estado excitado del isómero fluorescente, resultando en un aumento del desplazamiento de Stokes y un pronunciado solvatocromismo del fluoróforo. El solvatocromismo se utilizó para estudiar el cambio de polaridad del entorno de monómeros de α-sinucleína durante su agregación. A fin de conservar la fluoresencia fotomodulable de los DHAOs en agua, se exploraron diversas estrategias de solubilización con modificaciones covalentes y no-covalentes. La inclusión en cavidades de ciclodextrina, la adsorción a albúmina, y la funcionalización con grupos hidrofílicos sirvieron para solubilizar efectivamente a los DHAOs en medios acuosos. Las propiedades de fluorescencia y fotoconversión se retuvieron exitosamente dentro de la cavidad de las proteínas de unión de ácidos grasos y mediante la conjugación a entidades protéicas de mayor tamaño, indicando la preferencia de los DHAOs a un entorno protegido del agua. Anticuerpos secundarios conjugados a DHAOs se utilizaron para marcar β-tubulina en neuronas, y se lograron fotoconvertir selectivamente distintas áreas de las muestras en un microscopio que incorpora un arreglo programable para generar patrones espaciales de excitación. El particular comportamiento fotoquímico de los diheteroariletenos permitió desarrollar una estrategia para aumentar la resolución microscópica combinando DHAOs con fotocrómicos no-fluorescentes. Utilizando el fenómeno de transferencia de energía por resonancia de Förster, se postulan sondas que requieren de múltiples estímulos para la activación de la emisión, disminuyendo el volúmen de activación por debajo del límite de difracción de la luz y aumentando la resolución axial. La aplicación de las sondas sintetizadas y la propuesta de nuevas estrategias relacionadas con los DHAOs denotan el potencial que tienen los mismos en la búsqueda de mayor resolución en la microscopía de fluorescencia.

Fil:Molina y Vedia, Luis Miguel. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.