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Los cardiomiocitos poseen en la membrana diferentes transportadores iónicos encargados de regular el pH intracelular (pHi). Cuando el pHi es ácido existen dos mecanismos alcalinizantes responsables de dicha regulación: el intercambiador Na+/H+ (NHE) y el co-transportador Na+/HCO3- (NBC). Estudios previos describen la isoforma 1 de un NBC electrogénico (NBCe1) que en miocardio presenta una estequiometría 1 : 2 (Na+ : HCO3-) y que, además, posee dos bucles extracelulares con propiedades regulatorias (bucles 3 y 4). Experimentos realizados en miocitos aislados demuestran que el bloqueo del bucle 3 inhibe la actividad del NBCe1 y que el bloqueo del bucle 4 la aumenta.Las anhidrasas carbónicas (AC) son una familia de metaloenzimas que catalizan la hidratación reversible del dióxido de carbono (CO2) para producir ácido carbónico (H2CO3) que espontáneamente se hidroliza en HCO3- y H+. Resultados previos demuestran que las AC interaccionan con NHE y NBC formando lo que se conoce como metabolón de transporte iónico. De esta manera, las AC proveen de los iones necesarios para el funcionamiento de dichos transportadores, favoreciendo así la actividad de los mismos.Durante la isquemia-reperfusión (I/R) se producen cambios de pHi, que llevan a la activación de NHE y NBC, a la acumulación intracelular de Na+ y secundariamente a la de Ca2+, por activación del modo reverso del intercambiador Na+/Ca2+. La sobrecarga de Ca2+ es uno de los factores responsables de las alteraciones por I/R. Por lo tanto, las ¨intervenciones cardioprotectoras¨ han sido asociadas a una disminución de la concentración intracelular de este ion. Una de ellas es la llamada ¨reperfusión ácida (RA)¨. En la RA se perfunde al corazón con una solución de pH ácido, lo que reduce la actividad de los mecanismos alcalinizantes como consecuencia de la reducción del gradiente de H+ entre el citoplasma y el exterior celular. Esta menor actividad lleva a una menor sobrecarga de Na+ y por lo tanto, a una menor sobrecarga de Ca2+.El exceso de Ca2+ citosólico determina el aumento de la concentración de este ion en la mitocondria, que conduce a la formación y/o apertura de un poro de alta conductancia denominada poro de permeabilidad transitoria mitocondrial (PPTM). Este evento está ligado a las alteraciones mitocondriales por I/R y a la liberación de factores involucrados en la muerte celular.Distintos mediadores impactan sobre la membrana de los cardiomiocitos y producen la activación de cascadas de señalización que culminan en la mitocondria. Estas cascadas involucran a diferentes proteínas quinasas, entre ellas a las activadas por mitógenos (MAPK), perteneciendola p38 a una de sus subfamilias. Con respecto a esta proteína quinasa, existen estudios que muestran su papel cardioprotector, mientras que otros señalan su participación en la injuria generada por la I/R.Por todo lo expuesto, el objetivo general de este trabajo de tesis fue examinar la contribución del NBCe1 y de la AC a las alteraciones miocárdicas y mitocondriales producidas por I/R, analizando las vías de señalización involucradas. Específicamente, nuestro estudio se abocó a determinar los efectos de bloqueantes de NBCe1 y AC sobre el tamaño de infarto, la función miocárdica post-isquémica, la capacidad de retención de Ca2+ mitocondrial, la sensibilidad del PPTM al Ca2+ y el potencial de la membrana mitocondrial (Δψm). Otro de los objetivos de esta investigación fue analizar la participación de la p38MAPK en los efectos observados en las distintas intervenciones.Para cumplir con estos objetivos corazones aislados de rata Wistar de 4 a 5 meses de edad, perfundidos por el sistema de Langendorff, fueron sometidos a una isquemia global normotérmica de 30 minutos y luego reperfundidos durante 1 hora. Otros corazones fueron tratados durante los primeros 10 minutos de la reperfusión con un anticuerpo contra el bucle 3 del NBCe1 (a-L3) o con benzolamida (BZ, inhibidor de AC). En otro grupo experimental los corazones fueron tratados durante los 10 minutos previos a la isquemia y los primeros 10 minutos de la reperfusión con 6-etoxozolamida (ETX, inhibidor de AC). Para el protocolo de RA, los corazones fueron perfundidos durante los primeros 3 minutos de la reperfusión con una solución de pH = 6.4. En este grupo la reperfusión se completó hasta alcanzar los 60 min con la solución de pH = 7.4.La aplicación de 30 minutos de isquemia global y 60 minutos de reperfusión produjo un tamaño de infarto de aproximadamente 32 %. Este valor disminuyó significativamente con los tratamientos aplicados, llegando a aproximadamente 10, 6, 11 y 9 % en los grupos a-L3, BZ, ETX y RA, respectivamente.La función sistólica miocárdica disminuyó aproximadamente un 80 % al final del período de reperfusión. El tratamiento con a-L3, BZ, ETX y RA mejoró la recuperación post-isquémica del miocardio y los parámetros evaluados alcanzaron valores mayores a los obtenidos en el CI y S (62, 71, 62 y 55 % respectivamente vs. 20 %). La función diastólica también mejoró con todos los tratamientos. El aumento de la presión diastólica final observado durante la reperfusión fue significativamente menor en los corazones tratados con a-L3, BZ, ETX y RA.Las alteraciones mitocondriales detectadas en la reperfusión fueron significativamente atenuadas por los tratamientos. Así, la despolarización mitocondrial (Δψm aproximadamente -95mV) observada en el grupo no tratado fue revertida totalmente, adquiriendo en los grupos tratados con a-L3, BZ, ETX y RA valores aproximados a -140 mV, que fueron similares a los obtenidos en corazones no isquémicos. Las muestras mitocondriales procedentes de los corazones tratados también mostraron una recuperación de la capacidad de retención de Ca2+ y de la respuesta a dicho ion asociada a una menor apertura del PPTM.Con respecto a la p38MAPK, su expresión disminuyó a 41 % en los corazones sometidos a I/R pero aumentó significativamente en presencia de a-L3, BZ, ETX y RA, adquiriendo valores de alrededor de un 135 %. Con el objeto de determinar una posible vía de activación de p38MAPK y un posible blanco de dicha quinasa, evaluamos la expresión de calcineurina (fosfatasa dependiente de Ca2+) y la proteína de choque térmico 27 (en inglés Heat Shock Protein 27, HSP27) en todos los grupos experimentales. Nuestros datos muestran que la expresión de calcineurina aumentó mientras que la de HSP27 disminuyó en los corazones no tratados. El bloqueo del NBCe1, la inhibición de AC y la RA disminuyeron el contenido de calcineurina y aumentaron el de HSP27.Los datos de este trabajo de tesis también muestran que la administración de SB202190, inhibidor de p38MAPK, anula todos los efectos beneficiosos observados en los corazones tratados con a-L3, BZ, ETX y RA.Por lo tanto, los resultados obtenidos en este trabajo de tesis muestran que el bloqueo del bucle extracelular 3 del NBCe1 con a-L3, la inhibición de AC con BZ o ETX y la RA:1- Disminuyen el tamaño del infarto y aumentan la recuperación post-isquémica de la función sistólica y diastólica miocárdicas.2- Mejoran el estado mitocondrial, atenuando la despolarización y recuperando la capacidad de retención y de respuesta al Ca2+.3- Promueven una disminución de la expresión de calcineurina Aβ y un aumento del contenido de P-p38MAPK y P-HSP27.Estos datos indican que una reducción en la sobrecarga de Ca2+, consecuente a una actividad reducida de los mecanismos alcalinizantes, podría producir una menor activación de calcineurina y una activación de la vía p38MAPK-HSP27 que llevaría a la mejora mitocondrial, blanco final de la cardioprotección. Además, estos resultados sugieren que los tratamientos aquí ensayados podrían servir como posibles herramientas terapéuticas para atenuar los daños miocárdicos y mitocondriales producidos por la I/R.

Los cardiomiocitos poseen en la membrana diferentes transportadores iónicos encargados de regular el pH intracelular (pHi). Cuando el pHi es ácido existen dos mecanismos alcalinizantes responsables de dicha regulación: el intercambiador Na+/H+ (NHE) y el co-transportador Na+/HCO3- (NBC). Estudios previos describen la isoforma 1 de un NBC electrogénico (NBCe1) que en miocardio presenta una estequiometría 1 : 2 (Na+ : HCO3-) y que, además, posee dos bucles extracelulares con propiedades regulatorias (bucles 3 y 4). Experimentos realizados en miocitos aislados demuestran que el bloqueo del bucle 3 inhibe la actividad del NBCe1 y que el bloqueo del bucle 4 la aumenta. Las anhidrasas carbónicas (AC) son una familia de metaloenzimas que catalizan la hidratación reversible del dióxido de carbono (CO2) para producir ácido carbónico (H2CO3) que espontáneamente se hidroliza en HCO3- y H+. Resultados previos demuestran que las AC interaccionan con NHE y NBC formando lo que se conoce como metabolón de transporte iónico. De esta manera, las AC proveen de los iones necesarios para el funcionamiento de dichos transportadores, favoreciendo así la actividad de los mismos. Durante la isquemia-reperfusión (I/R) se producen cambios de pHi, que llevan a la activación de NHE y NBC, a la acumulación intracelular de Na+ y secundariamente a la de Ca2+, por activación del modo reverso del intercambiador Na+/Ca2+. La sobrecarga de Ca2+ es uno de los factores responsables de las alteraciones por I/R. Por lo tanto, las ¨intervenciones cardioprotectoras¨ han sido asociadas a una disminución de la concentración intracelular de este ion. Una de ellas es la llamada ¨reperfusión ácida (RA)¨. En la RA se perfunde al corazón con una solución de pH ácido, lo que reduce la actividad de los mecanismos alcalinizantes como consecuencia de la reducción del gradiente de H+ entre el citoplasma y el exterior celular. Esta menor actividad lleva a una menor sobrecarga de Na+ y por lo tanto, a una menor sobrecarga de Ca2+. El exceso de Ca2+ citosólico determina el aumento de la concentración de este ion en la mitocondria, que conduce a la formación y/o apertura de un poro de alta conductancia denominada poro de permeabilidad transitoria mitocondrial (PPTM). Este evento está ligado a las alteraciones mitocondriales por I/R y a la liberación de factores involucrados en la muerte celular. Distintos mediadores impactan sobre la membrana de los cardiomiocitos y producen la activación de cascadas de señalización que culminan en la mitocondria. Estas cascadas involucran a diferentes proteínas quinasas, entre ellas a las activadas por mitógenos (MAPK), perteneciendo la p38 a una de sus subfamilias. Con respecto a esta proteína quinasa, existen estudios que muestran su papel cardioprotector, mientras que otros señalan su participación en la injuria generada por la I/R. Por todo lo expuesto, el objetivo general de este trabajo de tesis fue examinar la contribución del NBCe1 y de la AC a las alteraciones miocárdicas y mitocondriales producidas por I/R, analizando las vías de señalización involucradas. Específicamente, nuestro estudio se abocó a determinar los efectos de bloqueantes de NBCe1 y AC sobre el tamaño de infarto, la función miocárdica post-isquémica, la capacidad de retención de Ca2+ mitocondrial, la sensibilidad del PPTM al Ca2+ y el potencial de la membrana mitocondrial (Δψm). Otro de los objetivos de esta investigación fue analizar la participación de la p38MAPK en los efectos observados en las distintas intervenciones. Para cumplir con estos objetivos corazones aislados de rata Wistar de 4 a 5 meses de edad, perfundidos por el sistema de Langendorff, fueron sometidos a una isquemia global normotérmica de 30 minutos y luego reperfundidos durante 1 hora. Otros corazones fueron tratados durante los primeros 10 minutos de la reperfusión con un anticuerpo contra el bucle 3 del NBCe1 (a-L3) o con benzolamida (BZ, inhibidor de AC). En otro grupo experimental los corazones fueron tratados durante los 10 minutos previos a la isquemia y los primeros 10 minutos de la reperfusión con 6-etoxozolamida (ETX, inhibidor de AC). Para el protocolo de RA, los corazones fueron perfundidos durante los primeros 3 minutos de la reperfusión con una solución de pH = 6.4. En este grupo la reperfusión se completó hasta alcanzar los 60 min con la solución de pH = 7.4. La aplicación de 30 minutos de isquemia global y 60 minutos de reperfusión produjo un tamaño de infarto de aproximadamente 32 %. Este valor disminuyó significativamente con los tratamientos aplicados, llegando a aproximadamente 10, 6, 11 y 9 % en los grupos a-L3, BZ, ETX y RA, respectivamente. La función sistólica miocárdica disminuyó aproximadamente un 80 % al final del período de reperfusión. El tratamiento con a-L3, BZ, ETX y RA mejoró la recuperación post-isquémica del miocardio y los parámetros evaluados alcanzaron valores mayores a los obtenidos en el CI y S (62, 71, 62 y 55 % respectivamente vs. 20 %). La función diastólica también mejoró con todos los tratamientos. El aumento de la presión diastólica final observado durante la reperfusión fue significativamente menor en los corazones tratados con a-L3, BZ, ETX y RA. Las alteraciones mitocondriales detectadas en la reperfusión fueron significativamente atenuadas por los tratamientos. Así, la despolarización mitocondrial (Δψm aproximadamente -95 mV) observada en el grupo no tratado fue revertida totalmente, adquiriendo en los grupos tratados con a-L3, BZ, ETX y RA valores aproximados a -140 mV, que fueron similares a los obtenidos en corazones no isquémicos. Las muestras mitocondriales procedentes de los corazones tratados también mostraron una recuperación de la capacidad de retención de Ca2+ y de la respuesta a dicho ion asociada a una menor apertura del PPTM. Con respecto a la p38MAPK, su expresión disminuyó a 41 % en los corazones sometidos a I/R pero aumentó significativamente en presencia de a-L3, BZ, ETX y RA, adquiriendo valores de alrededor de un 135 %. Con el objeto de determinar una posible vía de activación de p38MAPK y un posible blanco de dicha quinasa, evaluamos la expresión de calcineurina (fosfatasa dependiente de Ca2+) y la proteína de choque térmico 27 (en inglés Heat Shock Protein 27, HSP27) en todos los grupos experimentales. Nuestros datos muestran que la expresión de calcineurina aumentó mientras que la de HSP27 disminuyó en los corazones no tratados. El bloqueo del NBCe1, la inhibición de AC y la RA disminuyeron el contenido de calcineurina y aumentaron el de HSP27. Los datos de este trabajo de tesis también muestran que la administración de SB202190, inhibidor de p38MAPK, anula todos los efectos beneficiosos observados en los corazones tratados con a-L3, BZ, ETX y RA. Por lo tanto, los resultados obtenidos en este trabajo de tesis muestran que el bloqueo del bucle extracelular 3 del NBCe1 con a-L3, la inhibición de AC con BZ o ETX y la RA: 1- Disminuyen el tamaño del infarto y aumentan la recuperación post-isquémica de la función sistólica y diastólica miocárdicas. 2- Mejoran el estado mitocondrial, atenuando la despolarización y recuperando la capacidad de retención y de respuesta al Ca2+. 3- Promueven una disminución de la expresión de calcineurina Aβ y un aumento del contenido de P-p38MAPK y P-HSP27. Estos datos indican que una reducción en la sobrecarga de Ca2+, consecuente a una actividad reducida de los mecanismos alcalinizantes, podría producir una menor activación de calcineurina y una activación de la vía p38MAPK-HSP27 que llevaría a la mejora mitocondrial, blanco final de la cardioprotección. Además, estos resultados sugieren que los tratamientos aquí ensayados podrían servir como posibles herramientas terapéuticas para atenuar los daños miocárdicos y mitocondriales producidos por la I/R.

Trabajo final de posgrado (Especialización en Contabilidad Superior y Auditoría) -- Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Económicas; Argentina, 2017.

Acinetobacter baumannii es una bacteria Gram-negativa de alta relevancia clínica por su creciente incidencia en infecciones nosocomiales y elevada morbimortalidad asociada, especialmente en individuos inmunocomprometidos o sometidos a procesos poli-traumáticos. En las últimas décadas las infecciones debidas a A. baumannii han aumentado rápidamente en frecuencia como consecuencia de la diseminación de un creciente número de cepas que exhiben resistencia a diferentes grupos de antimicrobianos, o multirresistencia (MR). Recientemente, la Organización Mundial de la Salud (OMS) ha incluido a A. baumannii en la lista de microorganismos prioritarios, recomendando el avance en estrategias de investigación y desarrollo enfocadas al control y prevención de la diseminación tanto de los clones asociados a infecciones como de plataformas y elementos genéticos móviles (EGM) portadores de determinantes de resistencia. Como causas que contribuyen a la rápida evolución de MR en A. baumannii se proponen una combinación de factores intrínsecos que incluyen elevada plasticidad genómica, facilidad de adquirir material genético de bacterias del entorno, y elevada persistencia en el ambiente hospitalario. Es en este contexto que la emergencia en el ambiente nosocomial de cepas de A. baumannii con resistencia añadida a carbapenemas, última generación de β-lactámicos, de amplio espectro y elevada resistencia a la mayoría de β-lactamasas, constituye un grave problema global. Los mecanismos prevalentes de resistencia a carbapenemas en A. baumannii incluyen la producción de distintas serino-β-lactamasas tipo D u oxacilinasas (OXA) con actividad hidrolítica sobre carbapenemas (CHDL), con contribuciones menores de otros factores como reducciones en la permeabilidad de membrana externa (ME), bombas de eflujo, mutaciones en proteínas de unión a penicilina (PBP), y aún diferencias en genes metabólicos. Las principales CHDL descriptas a la fecha en cepas clínicas de A. baumannii pertenecen a los subgrupos OXA-23, OXA-24 y OXA-58, y sus genes son adquiridos mayoritariamente mediante transferencia horizontal de genes (THG). Aun así, los mecanismos que median la evolución y movilización de plataformas genéticas conteniendo los distintos genes blaOXA en la población clínica de A. baumannii son poco comprendidos en la actualidad. En estudios que comenzaron previamente en nuestro grupo de trabajo y continuaron durante el presente Trabajo de Tesis se caracterizaron cepas clínicas locales MR de A. baumannii clonal y epidemiológicamente relacionadas sin y con resistencia añadida a carbapenemas, incluyendo las cepas Ab244 sensible a carbapenemas (carbS ), y las Ab242 y Ab825 resistentes a las mismas (carbR ). Todas ellas pertenecen al complejo clonal 104 (CC104) prevalente en nuestra región. En este Trabajo de Tesis se caracterizó en detalle, a partir de la secuenciación de genomas completos, amplificación y clonado de fragmentos de ADN, como así también ensayos microbiológicos, a los plásmidos presentes en las cepas arriba mencionadas con especial énfasis en la dilucidación de los mecanismos de diseminación de determinantes de resistencias. Los estudios de pirosecuenciación, análisis in silico, y verificación de ensamblado de contigs mediante PCR y caminata genómica permitieron definir la estructura de los plásmidos presentes de las cepas clonales Ab244, Ab242 y Ab825, así como identificar sus módulos de replicación, estabilidad, adaptabilidad y transferencia. Esta caracterización permitió en principio detectar tres nuevos grupos de homología entre estos plásmidos basados en la comparación de las secuencias de replicasas codificadas en los mismos. Asimismo, permitió la identificación en las cepas carbR Ab242 y Ab825 de plásmidos de 25 kpb y 36 kbp (pAb242_25 y pAb825_36, respectivamente) portadores ambos de una estructura similar: i) un transposón defectuoso ISAba3 portador de un arreglo que consiste en el gen blaOXA-58 asociado a una ISAba825 corriente arriba, que resulta en la sobreproducción de la CHDL; 2) un transposón compuesto TnaphA6 que contiene el gen de una aminoglucósido acetiltransferasa. Esta estructura representa así un nuevo módulo de adaptabilidad que otorga a estos plásmidos la capacidad de conferir resistencia simultánea a carbapenemas y aminoglucósidos a su hospedador, a juzgar por ensayos de transformación sobre cepas sensibles de A. nosocomialis M2 y A. baylyi ADP1. Los estudios de secuenciación permitieron asimismo detectar en las cepas estudiadas otros plásmidos carentes de genes de resistencia, incluyendo uno de 9 kpb (pAb242_9) y otro de 12 kpb (pAb242_12) en Ab242, uno de 12 kpb idéntico a pAb242_12 en Ab825 (p Ab825_12), y uno de 7 kpb en la cepa carbS Ab244. Este último mostró elevada homología de secuencia con pAb242_9, excepto por la falta de una región de aproximadamente 2 kpb correspondiente al módulo de estabilidad. En pAb825_36 fue detectado asimismo un nuevo transposón compuesto constituido por dos IS26 bordeando al gen aac(3)-IIa que codifica para una aminoglucósido acetiltranferasa al que denominamos Tnaac(3)-IIa, el cual no se halla inserto en el módulo de adaptabilidad arriba descripto. Los estudios de pirosecuenciación permitieron revelar que pAb825_36 representa un producto de fusión entre un plásmido de 9 kpb idéntico a pAb242_9, y otro de 27 kbp (pAb825_27) formado por un plásmido de elevada homología a pAb242_25 excepto por la presencia de Tnaac(3)-IIa y la inversión del módulo de adaptabilidad arriba descripto. Estos resultados aportan evidencia sobre un importante flujo de plásmidos entre cepas clínicas de A. baumannii filogenética y epidemiológicamente relacionadas de nuestro entorno, sugiriendo que dichos EGM evolucionan en este ámbito mediante adquisición y pérdida de genes así como re-arreglos estructurales mediados por eventos de transposición y recombinación durante su tránsito por diferentes hospedadores bacterianos. Analizamos posibles eventos de recombinación involucrados en re-arreglos estructurales en los plásmidos de las cepas de A. baumannii en estudio, con el fin de evaluar el rol de estos procesos en la movilización entre EGM de estructuras portadoras de determinantes de resistencia antimicrobiana. Detectamos en todos los plásmidos de las cepas analizadas la presencia de varias secuencias cortas de 28 nucleótidos con homología con el sitio dif presente en el cromosoma bacteriano, el cual participa en procesos de recombinación específica de sitio para la resolución de dímeros formados durante la replicación del cromosoma. Estas secuencias se encuentran organizadas en dos secciones de 11 pb en los extremos, separadas por una región central, que actúan como sitios de reconocimiento de las tirosina-recombinasas del hospedador (XerC y XerD, respectivamente), y por tanto designados también sitios XerC/XerD. Numerosos plásmidos poseen un sitio equivalente y utilizan la maquinaria XerC/D del hospedador para resolver especies multiméricas formadas por procesos de recombinación homóloga las cuales, de persistir, llevan a la pérdida segregacional durante la replicación del hospedador (o “catástrofe del dímero”). Una búsqueda exhaustiva de los sitios XerC/XerD realizada en los plásmidos de las cepas estudiadas detectó un total de 17 sitios diferentes en los 3 plásmidos de Ab242, 8 de los cuales están en las proximidades o dentro del módulo de adaptabilidad presente en pAb242_25 (o en pAb825_36), que contiene los genes de resistencia blaOXA-58 y aphA6. Esta elevada cantidad de sitios XerC/XerD por plásmido sugiere fuertemente que los mismos cumplen otros roles además de participar en la resolución de formas multiméricas de los plásmidos individuales. Así, mediante experimentos de transformación con plásmidos totales de Ab242 sobre cepas sensibles de A. nosocomialis M2 carentes de plásmidos y selección por imipenem (IPM) encontramos que la especie transformante con capacidad de replicar y conferir resistencia a ese nuevo hospedador consistió en un co-integrado formado por la fusión de los plásmidos pAb242_25 y pAb242_12 (i.e., pAb242_36) a través de un evento intermolecular de recombinación sitio-específica mediado por un par particular de sitios XerC/XerD. Además, encontramos que este co-integrado se resuelve en el nuevo hospedador también mediante recombinación sitio-específica intramolecular utilizando el nuevo par de sitios XerC/XerD formado durante la fusión. Ello sugiere una dinámica novedosa para los plásmidos de Ab242 representada por un equilibrio activo entre estructuras resultantes de procesos de recombinación sitioespecífica inter- e intramolecular mediada por pares de sitios XerC/XerD. Ensayos de hibridización, PCR y caminata genómica permitieron claramente confirmar en los plásmidos totales de Ab242 la presencia del co-integrado formado por la fusión de pAb242_25 y pAb242_12, indicando efectivamente la presencia de dicho equilibrio, si bien, desplazado hacia la resolución de los co-integrados. Los resultados anteriores nos llevaron a analizar en detalle la estructura del plásmido pAb825_36 identificado en Ab825 y la posibilidad de que el mismo derive de eventos de recombinación sitio-específica mediados por sitios XerC/D. Análisis de comparación de secuencias, sumados a ensayos de PCR y caminata genómica nos permitieron identificar los diferentes eventos de recombinación sitio-específica intra- e intermoleculares que generaron la estructura localizada en Ab825. Uno de ellos fue mediado por un par de sitios XerC/XerD localizados en los bordes del módulo de adaptabilidad que contiene los genes blaOXA-58 y aphA6 y que ocurrió en un ancestro de pAb827_27, el cual condujo a la inversión de dicho módulo en este plásmido respecto a la misma estructura localizada en pAb242_25. El segundo consistió en un evento intermolecular de fusión también mediado por un par de sitios XerC/D activos localizados uno en pAb827_27 y otro en pAb825_9, el cual condujo finalmente a la estructura de pAb825_36 localizada en Ab825. Aun así, numerosos ensayos, incluyendo hibridación, PCR y caminata genómica sobre plásmidos totales de Ab825, indicaron que pAb825_36 se encuentra mayoritariamente resuelto en esta cepa, indicando asimismo la existencia de equilibrios activos de fusión y resolución de plásmidos mediados por recombinación sitio-especifica entre pares activos de sitios XerC/D. De hecho, estudios de transformación sobre cepas sensibles de A. nosocomialis M2 con plásmidos totales de Ab825 indicaron que la especie transformante con capacidad de replicar y conferir resistencia a imipenem estaba formada por un co-integrado entre pAb825_27 y pAb825_12, derivado de la recombinación sitio-específica intermolecular mediada por otro par de sitios XerC/XerD, resuelto asimismo rápidamente en este nuevo hospedador. En este trabajo, el análisis comparativo de los genomas completos de las cepas clínicas locales MR contribuyó a una mayor comprensión de los EGM involucrados en la adquisición de resistencia a carbapenemas y de los potenciales mecanismos de su diseminación, revelando a la recombinación sitio-específica mediada por pares de sitios XerC/XerD como mecanismo que promueve una elevada plasticidad genómica. El hallazgo reportado aquí de que los plásmidos de A. baumannii contienen un número elevado de sitios XerC/XerD capaces de conformar pares recombinacionalmente activos que median fusiones, resoluciones, e inversiones tiene un impacto significativo en la dinámica de estos elementos móviles y la diseminación de las estructuras de resistencia que éstos llevan. En principio, ciertamente abre la posibilidad de formación de cointegrados entre plásmidos temporalmente coexistentes en los que uno de los constituyentes está dotado de capacidades de auto-transferibilidad, lo que permite la diseminación de otros plásmidos como “cargo” mediante el proceso de conducción. La resolución rápida de los co-integrados una vez en la nueva célula hospedadora mediada por pares de sitios XerC/XerD por recombinación sitio-específica intramolecular demostrada en este Trabajo de Tesis, ciertamente agrega soporte a esta posibilidad. Además, la generación de co-integrados por fusión entre diferentes plásmidos así como los eventos de inversión aumentan las posibilidades de reordenamientos intramoleculares adicionales tales como resoluciones, eliminaciones y/o inversiones dependiendo de las ubicaciones y orientaciones de los nuevos pares disponibles de sitios XerC/XerD. Plásmidos de A. baumannii formados por más de un replicón se han reportado anteriormente, lo que sugiere que la fusión del replicón puede ser relativamente frecuente en esta especie y proporcionarían ventajas selectivas para la diseminación del plásmido y/o de los determinantes de resistencia que estos portan. De hecho, la fusión de replicones puede expandir el rango de hospedadores al proporcionar funciones de establecimiento y/o estabilidad que faciliten su permanencia exitosa en un nuevo hospedador independientemente del mecanismo de diseminación del co-integrado (conjugación, transformación, transducción, o THG no canónica). En este contexto, hemos observado que el co-integrado entre pAb242_25 y pAb242_12, y no el plásmido pAb242_25 solo, o el co-integrado formado entre pAb825_27 y pAb825_12, pero no entre pAb825_27 y pAb825_9, fueron las especies con capacidad de establecerse con éxito en A. nosocomialis cuando este organismo fue usado como hospedador para la transformación. Es importante considerar que, aunque las posibilidades de rearreglos de plásmidos mediadas por recombinación específica de sitio utilizando los sitios XerC/XerD presentes en los plásmidos reportados pueden ser enormes, todo el proceso se encuentra “filtrado” por la selección ambiental y solo algunas estructuras exitosas tomarán eventualmente el control para continuar su diseminación y evolución en la población bacteriana. Las medidas de control de diseminación de cepas MR de A. baumannii y de sus determinantes de resistencia deben considerar ciertamente el efecto de la fuerte presión de selección provocada por el tratamiento con antimicrobianos como las carbapenemas sobre la rápida selección de dichas estructuras, y la necesidad imperiosa de un uso racional de estas últimas armas contra infecciones por bacterias MR.

Este trabajo de Tesis, tal como su título lo indica "Contribución del laboratorio al estudio de los trastornos de absorción de las grasas" ha sido realizado con el objeto de proponer una serie de técnicas ordenadas que puedan en conjunto orientar a la Clínica hacia un presunto diagnóstico. El examen de las heces, especialmente en lo referente a las grasas de la excreta, para establecer si existen trastornos da absorción intestinal, constituye un dato de fundamental importancia, por ser precisamente el tipo de alimento que mas se presta para el estudio. Sin embargo según nuestra forma de pensar, convalidada por la opinión do coprólogos de gran experiencia, no es suficiente concretarse a valorar la cantidad do grasas excretadas y su fórmula correspondiente, sino también valorar y concatenar otros datos del examen coprológico y en algunos casos incluso, si fuera necesario, estimar las modificaciones sanguíneas relacionadas con los trastornos de absorción. Con esa idea guía, hemos tratado de exponer en forma ordenada las distintas técnicas de laboratorio que consideramos mas prácticas, sencillas y de comprobada eficacia para el estudio de estos problemas. Durante el desarrollo del tema seguimos un plan preconcebido de trabajo, que consideramos útil a fin de exponer los hechos y que detallamos seguidamente: Plan te tesis. Ia.Parte.-Estudio de los lípidos desde el punto de vista químico IIa.Parte.-La digestión y absorción de los alimentos en el organismo IIIa.Parte.-El examen de las heces en el estudio de los trastornos de absorción intestinal IVa.Parte.- Métodos utilizados en la identificación y evaluación de grasas. Fundamentos y técnicas. Aparatos y reactivos. Va.Parte.-Investigaciones realizadas. Comentarios y conclusiones. Bibliografía. En lo que sigue pasaremos a exponer las diferentes partes por separado

Fil:Torre, Mario. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

La familia Podocarpaceae, biogeográficamente disyunta en Sudamérica, permite analizar hipótesis acerca de los patrones de divergencia intra e interespecíficos en respuesta a los cambios climáticos y tectónicos ocurridos en el sur de Sudamérica durante el Neógeno y Cuaternario. En esta tesis se evalúan las características genéticas poblacionales, filogeográficas y filogenéticas de Podocarpus parlatorei que habita el Bosque Montano de Yungas (BMY) y P. nubigena, P. saligna, Saxegothaea conspicua y Prumnopytis andina del Bosque Templado Austral (BTA). Para P. parlatorei y para P. nubigena, se analizaron hipótesis históricas en relación a los desplazamientos de las especies a causa de los cambios climáticos ocurridos durante el Pleistoceno. Se estudiaron las características genéticas de las especies sobre un total de 46 poblaciones utilizando isoenzimas y secuencias de regiones no codificantes de ADN del cloroplasto en relación a la amplitud de su distribución geográfica y la continuidad de las poblaciones. En base a electroforesis isoenzimática se calcularon parámetros de diversidad poblacional, y a nivel de especie, la distribución jerárquica de la diversidad genética y los niveles de endogamia. Los resultados obtenidos a partir del análisis isoenzimático de P. parlatorei utilizando 25 loci arrojó un polimorfismo del 57%. La evidencia apoya la hipótesis de refugios interglaciarios al sur de la distribución y hacia mayores alturas sobre los cordones montañosos, mientras que durante los períodos más fríos las poblaciones se habrían desplazado hacia el norte y el este, hacia las zonas más bajas en respuesta a la disminución global de la temperatura. Las secuencias de la región del espaciador intergénico del ADN del cloroplasto trn L-F revelaron ocho haplotipos y un sector genéticamente diferente al sur de la distribución. La evidencia isoenzimática en P. nubigena arrojó un polimorfismo del 92%. Los resultados sugieren divergencia genética entre las poblaciones al norte y al sur de la latitud 43º S, en respuesta a los cambios tectónicos del Neógeno. Además, las poblaciones habrían sobrevivido localmente a las últimas glaciaciones en poblaciones de relativamente baja altura las cuales presentan mayor diversidad y alta divergencia en relación a las poblaciones de mayor altitud. Los resultados para P. saligna, especie de rango restringido y que presenta una distribución fragmentada en la cordillera de los Andes y la Costa, sugieren que mantiene limitado flujo génico y elevada variación genética lo que podría reflejar una distribución más amplia en el pasado. Los niveles de variación genética en Prumnopytis andina son los esperados para especies con distribución restringida. En cambio, los resultados isoenzimáticos obtenidos para Saxegothaea conspicua indican relativamente baja diversidad genética que no reflejaría sus características de distribución geográfica ni de sistema reproductivo. Posiblemente esta especie se vio afectada por cuellos de botella y deriva génica durante las últimas glaciaciones, lo que empobreció su acervo genético. Se realizaron análisis filogenéticos moleculares mediante dos marcadores del cloroplasto y uno nuclear y en base a caracteres morfológicos entre las especies de Podocarpus y se estimó la distancia genética mediante isoenzimas. Los análisis filogenéticos para datos moleculares apoyan el origen monofilético del género Podocarpus. Especies morfológicamente similares, como P. parlatorei y P. saligna, y que ocupan ambientes con características ecológicas similares, presentaron mayor afinidad en el análisis cladístico morfológico y de distancias genéticas. Se puede afirmar a partir de los caracteres morfológicos que existió un ancestro común para las especies de Podocarpus tolerantes a climas templado-cálidos, que extendieron su distribución a los climas subtropicales montanos del sur de Sudamérica. En contraposición P. nubigena, con tolerancias ecológicas templado-frías, permaneció restringida al Bosque Templado Austral, pero pudo mantener altos niveles de variación genética más allá de los posibles cuellos de botella sufridos durante las glaciaciones. Las características genéticas de las especies analizadas no sólo reflejan sus rangos de distribución geográfica y la continuidad de sus poblaciones, sino que junto con sus relaciones filogenéticos, sugieren posibles eventos de vicarianza y o dispersión relacionados con las características de tolerancia térmica de las especies.

Fil:Yuhjtman, Eva C.. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.