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Las inundaciones y el pastoreo son disturbios importantes que modulan la estructura y el funcionamiento de pastizales húmedos. La inundación genera un ambiente anaeróbico en el suelo, disminuyendo la disponibilidad de oxígeno para las raíces, mientras que el pastoreo afecta a la vegetación mediante la defoliación selectiva del forraje. En primer lugar se investigaron los rasgos anatómicos y las respuestas fisiológicas relacionadas con el crecimiento bajo anaerobiosis de raíces de graminoides (Paspalidium geminatum, Cyperus eragrostis)y dicotiledóneas (Lotus tenuis, Rumex crispus)con distintos tipos de aerénquima. Se encontró que las graminoides mantienen la tasa de elongación de sus raíces bajo anaerobiosis, con alta proporción de aerénquima para conducir oxígeno y una barrera física (menor suberina)- constitutiva en P. geminatum e inducida en C. eragrostis - que limita la pérdida radial de oxígeno hacia la rizósfera. Por el contrario, las dicotiledóneas disminuyen la elongación radical en medio anaeróbico, a pesar de incrementar el aerénquima en sus raíces, asociado a una alta pérdida radial de oxígeno y una menor deposición de suberina en la corteza radical externa. En segundo lugar, se estudiaron las estrategias de crecimiento de L. tenuis y P. dilatatum bajo condiciones de sumersión parcial y completa de sus plantas (i.e. intensidad de inundación), con énfasis en el uso de carbohidratos de reserva. Se demostró que L. tenuis puede desarrollar dos estrategias de crecimiento: 'escape' del agua bajo sumersión parcial sin usar sus reservas y sobrevivir 30 días en estado de 'quiescencia' bajo sumersión completa utilizando sus reservas. Por el contrario, P. dilatatum sólo desarrolla 'escape' bajo sumersión parcial y no tolera (muere)la sumersión completa. En tercer lugar, se evaluaron las respuestas de L. tenuis y P. dilatatum frente a la combinación inundación/frecuencia de defoliación. Aquí se encontró que L. tenuis tolera los eventos sucesivos de defoliación bajo inundación, con un mínimo crecimiento, a partir de priorizar la emergencia de las hojas fuera del agua post-corte, utilizando exhaustivamente las reservas en coronas. Por el contrario, P. dilatatum no sobrevive a dos defoliaciones si se encuentra bajo anegamiento. De esta manera, si bien ambas especies toleran la inundación y la defoliación por separado, si estos estreses se combinan se compromete la supervivencia de la gramínea y el rebrote de la leguminosa. En consecuencia, resulta importante considerar el tiempo entre defoliaciones sucesivas, si el suelo está inundado, al momento de planificar las estrategias de manejo de estas especies en el pastizal

La mayor parte de las variaciones de rendimiento en maíz son explicadas por cambios en el número de granos fijados. El número de granos es dependiente de la biomasa acumulada en espiga (BE) alrededor de la floración. Ambos son caracteres cuantitativos influenciados por el ambiente. La determinación de las bases genéticas de los caracteres cuantitativos resulta compleja producto de interacciones genotipo x ambiente. Los modelos ecofisiológicos son una posible solución a este problema ya que están diseñados para predecir interacciones genotipo x ambiente basándose en respuestas dinámicas de la variable en estudio. En la presente tesis se estudiaron las regiones cromosómicas (QTL) asociadas a la determinación de número de granos en maíz a nivel de planta a través de dos análisis de QTL diferentes: (i) sobre los caracteres finales per se (números de granos por planta, NGP, y biomasa acumulada en la espiga al final del período de floración, BE) y (ii) sobre parámetros específicos de un modelo ampliamente documentado que describe la respuesta del NGP y la BE al crecimiento por planta alrededor de la floración. Se detectaron QTL para NGP, BE y los parámetros del modelo que relacionan NGP y BE con el crecimiento por planta para 125 RILs de la población IBM Syn4 (B73 x Mo17) evaluadas en dos ambientes. Posteriormente se evaluaron varias de estas RILs y otras líneas de la misma población que no estaban incluidas en el análisis de QTL con el objetivo de predecir la BE y el NGP basados en la información de QTL proveniente de cada análisis. La hipótesis a testear es que realizar un análisis de QTL sobre los parámetros del modelo ecofisiológico que describe la respuesta del NGP y la BE al crecimiento por planta alrededor de la floración permitirá predecir estos rasgos de manera más robusta que usar información QTL de los caracteres per se. Todos los caracteres mostraron variaciones significativas entre RILs y ambos análisis detectaron varios QTL para todos los caracteres. Los QTL asociados a BE y NGP per se no se localizaron en las mismas regiones que los QTL detectados para los parámetros del modelo. La información del QTL de los parámetros del modelo ayudó a predecir la BE y el NGP con mayor precisión (r2= 0,13 y 0,12, p<0,001, para BE y NGP, respectivamente) que predecir BE y NGP basados en los QTL detectados para los caracteres finales per se (r2<0,01 y <0,01, p>0,10, para BE y NGP, respectivamente). Hay que destacar que la incorporación de información sobre el crecimiento de las plantas estuvo relacionada a la mejora de las predicciones en el enfoque que emplea el modelo ecofisiológico. En síntesis, se identificaron regiones cromosómicas que incluyen genes potencialmente relevantes relacionados con la determinación de NGP en maíz y se empleó un enfoque que combina la información genética con modelo ecofisiológico para predecir el NGP. La información obtenida ayudó a predecir el NGP sólo parcialmente, sugieriendo que son necesarios otros enfoques.

El rendimiento del maíz se encuentra determinado por el número y peso individual de los granos cosechados por unidad de área. Si bien el número de granos tiene más impacto sobre el rendimiento final, cambios en el peso individual de los granos (PG) impactan sobre el mismo. Existe gran variabilidad genotípica en el patrón de crecimiento de los granos de maíz de híbridos comerciales y en líneas elite de mejoramiento.El conocimiento de las bases genéticas de los procesos fisiológicos que determinan el PG es relevante para mejorar el rendimiento del cultivo. Los objetivos generales de esta tesis fueron (i) caracterizar fenotípicamente una población de RILs de maíz para características de llenado de granos, y (ii) realizar una primera aproximación a las bases genéticas que determinan el peso de grano en una población de RILs de maíz. Se realizó un análisis de QTL sobre una población de 245RILs de maíz de la población IBM Syn4 (B73 x Mo17) que mostró grandes diferencias genotípicas en PG (p<0,001) en dos ambientes. La variabilidad en PG estuvo positivamente asociada a variaciones en tasa de llenado (TLL) y duración de llenado (DLL). Un total de 10 QTL conjuntos fueron detectados, mostrando generalmente efectos menores y no consistentes a través de los dos ambientes evaluados. La TLL y DLL no mostraron QTL en común, sugiriendo un control genético independiente. A través de información de uno de los dos padres de la población de RILsy los intervalos de confianza de los principales QTL se presentan posibles genes candidatos para futuras disecciones. También se evaluó la correlación entre líneas parentales e híbridos derivados para caracteres de llenado de grano. Tanto la heterosis como la correlación entre el valor medio de las líneas parentales y los híbridos derivados fueron significativas para todos los caracteres de llenado evaluados. Estos resultados confirman que el estudio de caracteres de llenado de grano en líneas endocriadas genera información valiosa para sus híbridos derivados. Los resultados obtenidos en esta tesis muestran la relación entre las bases genéticas del crecimiento del grano de maíz y sus mecanismos fisiológicos. Los resultados observados en líneas endocriadas son relevantes para estimar el comportamiento de sus híbridos derivados gracias a la alta correlación que se encontró en el desempeño entre ambos.

Virus patogénicos como Adenovirus, Papilomavirus y Poliomavirus poseen proteínas capaces de interactuar con el supresor de tumores Retinoblastoma (pRb), controlador central del ciclo celular eucariótico. Dichas interacciones se establecen en sitios utilizados por pRb para unir blancos endógenos como el surco A/B donde se une el factor de transcripción E2F y el surco LxCxE donde se unen proteínas que poseen el motivo LxCxE. Estos virus hacen mímica de motivos lineales de interacción altamente conservados, y generalmente presentes en regiones intrínsecamente desordenadas, para interferir efectivamente con la red celular y tomar el control de la célula huésped conduciendo en algunos casos a transformación celular y oncogénesis. La oncoproteína viral E1A del Adenovirus (AdE1A) es una proteína intrínsecamente desordenada (IDP) y se une a pRb a través de dos motivos lineales necesarios para desplazar a E2F, el motivo E2F y el motivo LxCxE , que se encuentran separados por una región de 70 residuos o “ linker ”. En este trabajo, sugerimos que ciertas características de esta proteína desempeñan un papel esencial en los mecanismos de desregulación de pRb. Dado el limitado conocimiento mecanístico y estructural de alta resolución con respecto a AdE1A, su interacción con pRb y la contribución de la región “ linker ” en esta interacción, nos propusimos caracterizarlos para revelar información que servirá para comprender mejor las interacciones virus-hospedador. En primer lugar, desarrollamos un protocolo de expresión recombinante de AdE1A y mutantes individuales de motivos, con rendimientos de 9 mg/L y pureza superior al 95%. Experimentos biofísicos evidenciaron que AdE1A es un monómero intrínsecamente desordenado con radio hidrodinámico extendido y migración anómala en gel. En segundo lugar, ensayos de interacción muestran que AdE1A se une a pRb con estequiometría 1:1 y una muy alta afinidad ( K D = 24 pM). Aunque los sitios individuales unen a pRb con menor afinidad (≈ K D = 110nM) que la E2F celular ( K D = 1 nM), el modelado del sistema como un arreglo de dos motivos unidos por un “ linker ” de longitud óptima y altamente flexible permite explicar la potenciación de su afinidad global y la efectividad de la proteína AdE1A en el desplazamiento de E2F. En tercer lugar, estudios estructurales de RMN permitieron la asignación completa de la cadena carbonada de AdE1A y su caracterización a nivel de estructura secundaria y propensiones conformacionales evidenciaron su naturaleza desordenada y flexible. AdE1A se une a pRb a través de dos sitios independientes conformados por residuos centrales de los motivos E2F y LxCxE modulados por residuos flanqueantes con función complementaria, más interacciones débiles en la región “ linker ”. El análisis de la región “ linker ”, sugiere que existe un fino balance entre repulsión de cargas y contactos hidrofóbicos débiles con pRb en regiones de interacción secundarias, las cuáles se encuentran altamente conservadas a nivel evolutivo y que contribuirían a su capacidad de interacción con múltiples blancos celulares. Los resultados del presente trabajo contribuyen a comprender las bases moleculares de las interacciones entre proteínas de virus y hospedador y los mecanismos mediante los cuales los virus toman control de la célula huésped, lo cual allana el camino para el desarrollo de estrategias terapéuticas contra el cáncer de etiología viral.

Tesis para obtener el grado de Doctora en Ciencias Agrarias, presentada en la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad Nacional de Mar del Plata, en marzo de 2018.

Las leguminosas establecen una asociación simbiótica fijadora de nitrógeno con bacterias del suelo conocidas como rizobios. Cuando la planta crece en condiciones limitantes de nitrógeno comienza un intercambio de señales químicas con especies de rizobios compatibles presentes en la rizósfera, que permite un reconocimiento mutuo muy específico. La bacteria se adhiere a la punta de los pelos radicales, y la planta genera una estructura tubular llamada hilo de infección que permite el avance de la bacteria hacia las células del córtex. Allí se activan las divisiones celulares formando un nuevo órgano llamado nódulo, donde los rizobios son internalizados al citoplasma de las células vegetales y se lleva a cabo la fijación de nitrógeno atmosférico a formas fácilmente asimilables por la planta. Phaseolus vulgaris (poroto) es una leguminosa de origen americano que ha diversificado genéticamente en dos centros geográficos independientes, el Andino y el Mesoamericano. El estudio molecular de la diversidad de rizobios presentes en nódulos ha permitido determinar que Rhizobium etli es la especie que ocupa predominantemente los nódulos de P. vulgaris. A su vez, los cultivares de origen Mesoamericano nodulan preferentemente y de manera más eficiente con cepas que poseen el alelo tipo α en el gen nodC, mientras que las plantas de origen Andino nodulan más eficientemente con cepas con un alelo tipo δ. Este sistema representa un excelente modelo experimental para el estudio de los determinantes moleculares que participan en el reconocimiento específico entre ambos simbiontes y lleva al establecimiento de una interacción preferencial y más eficiente. Estudios previos de nuestro laboratorio permitieron identificar y caracterizar a nivel funcional distintos genes implicados en esta respuesta. Uno de ellos codifica para la subunidad C1 del factor de transcripción NF-Y, el cual es un regulador transcripcional requerido tanto para la infección bacteriana y la organogénesis del nódulo, como para la nodulación preferencial por cepas nodC-α. La subunidad NF-YC1 interacciona con las subunidades NF-YA1 y NF-YB7 formando un trímero funcional en la simbiosis. A su vez, NF-YC1 interacciona físicamente con un factor de transcripción de la familia GRAS denominado SIN1, el cual es requerido para la infección y organogénesis del nódulo, así como también para el desarrollo de raíces laterales, siendo un excelente ejemplo de la interconexión de programas transcripcionales en el desarrollo de dos órganos diferentes. En la presente Tesis doctoral se abordó la caracterización de las bases moleculares de una interacción simbiótica eficiente mediante el análisis transcriptómico por secuenciación masiva de ARN de raíces de plantas de poroto de origen Mesoamericano y Andino inoculadas con cepas tipo nodC-α, nodC-δ o con medio de cultivo a modo de control. Este análisis permitió identificar genes que se expresen de manera diferencial frente a las cepas más eficientes, y además, distinguir las respuestas moleculares específicas de cada cultivar frente a cada cepa. Estos genes codifican proteínas involucradas en diferentes procesos de percepción y señalización, regulación de la transcripción, procesos rédox y en modificaciones de la pared celular y la membrana plasmática, los cuales son requeridos para la iniciación y progresión de los hilos de infección. En una segunda etapa de este trabajo de Tesis se identificaron genes que son regulados de manera directa por los factores de transcripción NF-YC1, NF-YA1 y SIN en etapas tempranas de la simbiosis entre P. vulgaris y R. etli. Para ello se utilizaron plantas que expresan de manera ectópica y constitutiva estos factores de transcripción como fusiones traduccionales al epitope FLAG, las cuales se utilizaron en experimentos de inmunoprecipitación de cromatina seguida de PCR (ChIP-PCR) para identificar genes regulados directamente por dichos factores transcripcionales. Esta aproximación experimental permitió identificar genes que participan en la activación de las divisiones mitóticas y de la infección rizobiana. Por último, para profundizar en el conocimiento sobre la vía de transducción de señales que involucra a NF-YC1, en nuestro laboratorio se realizó un screening de una biblioteca de doble híbrido de levadura para identificar proteínas que interaccionen físicamente con NF-YC1. Uno de los clones identificados codifica una proteína quinasa, a la cual denominamos NF-YC1 Interacting Protein Kinase (NIPK). La interacción física entre NF-YC1 y NIPK fue confirmada mediante ensayos de doble híbrido, complementación bimolecular de fluorescencia y ensayos de co-inmunopreciptación. Posteriormente se caracterizó la localización subcelular de NIPK detectándose tanto en el citoplasma como en la membrana plasmática. La caracterización fenotípica de plantas de P. vulgaris silenciadas en NIPK utilizando dos RNA de interferencia (RNAi) dirigidos a diferentes regiones del mRNA, revelaron que NIPK sería requerido para la organogénesis y desarrollo de los nódulos, así como también la frecuencia de la infección rizobiana. El conjunto de resultados obtenidos en este trabajo de Tesis no sólo contribuyen a comprender en mayor detalle los mecanismos moleculares que gobiernan el establecimiento de una simbiosis fijadora de nitrógeno eficiente entre P. vulgaris y R. etli, sino que también sienta las bases para futuros proyectos de investigación y desarrollo que permitan optimizar la fijación de nitrógeno en una planta de interés agronómico y alto valor social para los pueblos del Noroeste Argentino.

Los virus fitopatógenos producen alteraciones en el metabolismo y la fisiología de sus huéspedes provocadas principalmente por alteraciones en la expresión génica durante las infecciones. Numerosos cambios están asociados a respuestas de estrés y defensa y sus efectos secundarios son probablemente causantes de los síntomas. El uso de plantas transgénicas que expresan proteínas virales constituye un sistema útil para estudiar la complejidad de la interacción planta-virus. Con el fin de determinar patrones de expresión génica alterados, se emplearon líneas que expresan proteínas del TMV sin función supresora del silenciamiento: la proteína de cápside mutada (CPT42W), la proteína de movimiento (MP)y una línea co-expresante (MPxCPT42W)que mostró alteraciones morfológicas (semejantes a síntomas)y de acumulación de miARNs. Se realizó un microarreglo para detectar cambios transcripcionales asociados a la coexpresión de CPT42W y MP, utilizando como control una línea isogénica con ambos transgenes silenciados y fenotipo normal (mpxcpT42W*). Se estudiaron procesos biológicos cuyos genes mostraron alteraciones por la co-expresión de CPT42W y MP, focalizando en vías relacionadas a estrés oxidativo, inmunidad innata y vías degradación de ARN. Se demostró que CPT42W y MP modularon la defensa innata de un modo complejo: MP parecería actuar como inductor de defensa, alterando los niveles de ERO y SA mientras que CP jugaría un rol antagónico, inhibiendo la expresión de PR-1 y RDR1. Por otro lado, estudios funcionales en vías de degradación de ARN, demostraron que genes componentes del ARN exosoma, inducidos por la expresión de MP y CPT42W, estarían implicados en la alteración de miARNs y constituirían mecanismos alternativos subyacentes a la generación de síntomas en infecciones virales. Este trabajo constituye un importante aporte al entendimiento de los mecanismos de defensa antiviral y de producción de síntomas, proporcionando herramientas para diseñar nuevas estrategias biotecnológicas de control de virosis en cultivos de interés agronómico

Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2017

En Argentina la vacunación contra la tos convulsa comienza en los años setenta con la incorporación masiva de la vacuna celular triple bacteriana (DTP – Difteria, Tétanos y Pertussis) en el Calendario Nacional de Vacunación con tres dosis a los 2, 4 y 6 meses y un refuerzo a los 18 meses. La situación epidemiológica de la enfermedad motivó en los años ochenta la incorporación de un refuerzo al ingreso escolar y en el año 2009 un refuerzo en la población adolescente. Se espera que estas estrategias mejoren el control de esta enfermedad que para Argentina, al igual que para otros países, continúa siendo un problema para la salud pública. Varias son las hipótesis respecto de las causas de la situación epidemiológica actual de la enfermedad, la mayoría de ellas están asociadas a las vacunas: coberturas subóptimas, relativa baja efectividad de las vacunas en uso, corta duración de la inmunidad conferida por las vacunas ya sean celulares o acelulares, adaptación del agente causal a huéspedes inmunes, o combinaciones de cualquiera de las anteriores. En este contexto dentro de los objetivos planteados en el desarrollo de este trabajo de Tesis se encuentra la caracterización de la población de Bordetella pertussis circulante en nuestro país. En particular, nos dedicaremos a la evaluación de su divergencia y de su polimorfismo respecto de ciertos factores de virulencia implicados en la protección. Estos objetivos se extendieron a las cepas vacunales ya que nuestro grupo de investigación está involucrado de manera directa con un proyecto que persigue la reactivación de la producción nacional de vacunas. De manera complementaria a estudios realizados previamente en nuestro grupo, evaluamos la implicancia de la divergencia genómica en la funcionalidad bacteriana focalizando los estudios a las cepas vacunales, en particular a cuatro cepas con potencialidad de ser incluidas en una formulación producida en nuestro país. Para una mejor compresión de los experimentos realizados y los resultados alcanzados comenzaré este trabajo con una reseña histórica de la tos convulsa y con una descripción de las principales características de su agente causal. Me referiré luego a las vacunas anti-pertussis desarrolladas y empleadas para el control de la enfermedad. Presentaré datos sobre la epidemiología actual de pertussis en el mundo y en nuestro país y discutiré las hipótesis hasta ahora planteadas para explicar las causas de la resurgencia de la enfermedad de forma que a partir de allí se puedan plasmar los objetivos específicos abordados durante mi trabajo de Tesis. En los capítulos siguientes a la introducción presentaré los resultados alcanzados esperando que los mismos confluyan a las conclusiones finales de mi trabajo las cuales espero contribuyan al conocimiento sobre esta patología y sobre las estrategias de control hoy en uso.