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El estradiol-β-D-glucuronido (E17G) es un metabolito endógeno del estradiol cuyos niveles plasmáticos aumentan durante el embarazo, habiendo sido postulado como responsable de la patogénesis de la colestasis intrahepática que ocurre en las mujeres susceptibles embarazadas. La administración de E17G a ratas hembras produce una colestasis dosis-dependiente, aguda y reversible, afectando las fracciones dependientes e independientes de sales biliares del flujo biliar. nuestro grupo demostró que la alteración secretora bibliar inducida por E17G en la rata es críticamente dependiente de la endocitosis de transportadores hepatocelulares canaliculares claves para la formación de bilis, como Bsep Mrp2. Asimismo demostramos que este fenómeno está mediado por la activación de varias vías de señalización intracelular, como aquellas dependientes de REα-cPKC-ERK1/2, PI3K-Akt-p38MAPK y GPR30-AC-PKA. Sin embargo, el mecanismo involucrado en la endocitosis de los transportadores canaliculares es desconocido, y su esclarecimiento representa el objetivo principal de esta tesis. En una primera etapa, y ante la necesidad de contar con un modelo hepatocelular polarizado para el estudio de estos mecanismos, hemos validado el cultivo primario de hepatocitos de rata en sándwich de colágeno (CPHS) para el estudio de drogas que afectan la formación de bilis a través de la inducción de endocitosis de transportadores canaliculares. Tratando los CPHS con los agentes coléstasico E17G y taurolitocolato, así copmo con el compuesto colerético y anticolestásico DBAMPc, demostramos la utilidad de este modelo in vitro para detectar y cuantificar cambios en la secreción canalicular tanto de tipo colestásico como colerético, así como los cambios en la localización intracelular de transportadores canaliculares causales de dichas alteraciones funcionales. En la segunda etapa, el uso de inhibidores especificos de las vías endocíticas depenmdientes de clatrina y de caveolinas en duplas aisladas de hepoatocitos aportó evidencia preelimiar que E17G induce la endocitosis de Bsep y Mrp2 por un mecanismo dependiente de clatrina. Se obtuvo evidencia adicional de este mecanismo en hígados aislados y perfundidos, donde un inhibidor especifico de esta vía endocítica, monodansilcadaverina, previno la caída en el flujo biliar y la excreción biliar de sustrato de Bsep y Mrp2, así como la endocitosis de dichos transportadores evaluada por microscopía confocal. A modo confirmatorio de la dependencia de clatrina en la endocitosis de estos transportadore inducida por E17G, observamos que el bloque de esta vía mediante knock-down por RNA interferente de la expresión de AP2 (componente clave de la maquinaria endocítica dependiente de clatrina) en CPHS, llevó a una prevención completa de la función de transporte y de la endocitosis Bsep y Mrp2. En forma adicional, demostramos que E17G altera la localización de membrana de estos transportadores (originalmente enriquecidos en microdominois raft, ricos en colesterol y caveolina), llevando a un enriquecimiento de los mismos en microdominios canaliculares ricos en clatrina (no rafts), desde donde puede producirse la endocitosis dependiente de la misma. Por ultimo, como una primera aproximación a la identificación de los blancos celulares de aquellas proteínas quinasas activadas por E17G que conducen en última instancia a la endocitosis dependiente de clatrina de los transportadores canaliculares, se realizaron estudios de fosfoproteómica para identificar proteínas que modifiquen su grado de fosforilación frente al tratamiento con este estrógeno. Esto llevo a la identificación de numerosas proteínas que incrementan su fosforilación por E17G, dejando abierta así la posibilidad de realizar experimentos tendientes a evaluar su posible rol como intermediarios entre las vías de señalización pro-colestásicas y el proceso final de endocitosis de transportadores canaliculares conducente a la alteración colestásica.

Mediante la aplicación de diferentes enfoques de Biología Computacional, en esta Tesis se abordaron tres proyectos genoma de tomate: i) el genoma mitocondrial del cultivar élite Heinz se secuenció, ensambló y anotó; ii) se ancló la secuencia completa del genoma de la especie silvestre de tomate Solanum pennellii, el padre donante de la conocida población de líneas de introgresión (IL), al mapa genético y iii) mediante genómica comparativa y análisis de QTL (loci de caracteres cuantitativos) se identificaron genes candidatos asociados a variaciones en la fotosíntesis y en caracteres relacionados con el crecimiento de las plantas. Los resultados del ensamblado del genoma mitocondrial del tomate mostraron que las inserciones nucleares de origen mitocondrial (del inglés, numts: nuclear mitochondrial DNA segments) están presentes aún en los tomates contemporáneos. Este hallazgo fue validado por hibridación fluorescente in situ la cual mostró un número particularmente elevado de numts en el cromosoma 11 del cultivar Heinz. En la segunda parte de esta Tesis se presenta la secuencia completa del genoma de S. pennellii la cual fue ensamblada de novo en 4.591 scaffolds, de los cuales, el 97,1% fueron anclados (mediante una base de datos interna de 16.940 marcadores moleculares) al mapa genético del tomate. Por último, en el capítulo final de esta Tesis, el potencial como herramientas para la investigación y el mejoramiento de cultivos de las secuencias genómicas aquí presentadas, se demostró por el genoma del cultivar S. lycopersicum M82, ensamblado por referencia. En esta parte, se identificaron 87 genes candidatos involucrados en la determinación de loci de caracteres cuantitativos responsables de variaciones en la fotosíntesis y en caracteres relacionados con el crecimiento de la planta presentes en 11 regiones (BINs) de las líneas de introgresión de tomate.

Las abejas nativas del género Augochlora fueron estudiadas desde el punto de vista sistemático y biológico a través de observación de nidos en condiciones naturales y nidos artificiales en laboratorio. Se encontraron cinco especies en el área central de Argentina y Uruguay: A. iphigenia, A. amphitrite , A. nausicaa , A. phoemonoe y A. daphnis para las que se presentan re-descripciones, datos de distribución y clave taxonómica. La estructura de nidificación de A. amphitrite y A. phoemonoe consiste en racimos de celdas sostenidos por pilares a una cavidad, aunque es posible encontrar celdas apoyadas al sustrato sin pilares. Esta variabilidad, no exhibida por otros Augochlorinos que nidifican en el suelo, estaría relacionada a la dureza del sustrato. Fue observada la convivencia y cooperación entre la hembra fundadora del nido, madre reproductora, y una o más hijas adultas dentro del mismo nido. Se observaron interacciones entre este grupo de hembras y división de tareas indicando la existencia de un grado de socialidad verdadera. El análisis polínico de las reservas indica que ambas especies son polilécticas. Los resultados obtenidos permitieron conocer el comportamiento eusocial en un subgénero que era considerado de especies solitarias; realizando un aporte de interés al estudio de la variación y evolución de la socialidad en Augochlorini. Estos resultados invitan a reconsiderar la rigidez de las categorías clasificatorias utilizadas en Augochlorinos. La cría artificial de estas especies constituye un aporte novedoso al manejo de abejas silvestres potencialmente utilizables como polinizadoras de cultivos en la región central de la Argentina.