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Estudio de las bases moleculares de la Fibrosis Quística y la enfermedad de Sandhoff: Ensayos IN VITRO en modelos de mutaciones intrónicas del gen hexb

Julia Mugnaini ; Ana María Oller de Ramírez

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Tesis - Doctor en Ciencias de la Salud - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Médicas. Secretaría de Graduados en Ciencias de la Salud, 2018
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Estudio de las bases moleculares de la interacción P. vulgaris-R. etli durante las etapas tempranas de la simbiosis

María Virginia Dalla Vía ; Flavio Blanco ; Mario Aguilar

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En el presente trabajo se mostró que la expresión de versiones mutantes de RabA2 y ARFA1 en raíz interfirió en su localización subcelular y afectó el tráfico de vesículas entre membranas. Esto remarca la importancia del tráfico de vesículas en eventos de crecimiento polar que tienen lugar en la simbiosis. En particular, los resultados obtenidos en raíces transgénicas de P. vulgaris que expresan variantes mutantes de RabA2 sugieren que la maquinaria molecular implicada en el crecimiento polar durante la infección por el IT es la misma que participa en otros procesos de crecimiento polares, como el que tiene lugar en el pelo radical y en el crecimiento del tubo polínico. Los resultados obtenidos para esta GTPasa monomérica en P. vulgaris proveen evidencias esta proteína está implicada en mecanismos moleculares que determinan la preferencia de cepas más eficientes durante la formación del IT. El conocimiento de estos procesos es clave para la manipulación genética en leguminosas que genere plantas capaces de discriminar y seleccionar las cepas de rizobios más eficientes. En la última etapa de la tesis, se realizó un análisis de transcriptómica por RNAseq para analizar los mecanismos moleculares asociados a la señalización por rizobio. Los datos generados a partir de RNAseq constituyen una fuente de información valiosa para analizar los procesos biológicos que ocurren en etapas tempranas de la nodulación. El análisis permitió detectar que las moléculas de EPS, LPS y NF modulan vías de señalización por hormonas, probablemente implicadas en la regulación de las respuestas de defensa de la planta. Además, es posible hipotetizar que los receptores identificados en este análisis participen en el reconocimiento del rizobio en las etapas de la infección. Otro resultado de interés fue la gran proporción de genes diferenciales que codifican TFs y proteínas de remodelación de pared celular regulados por NF, EPS y LPS. Los resultados permiten especular sobre los procesos que tienen lugar durante la infección, sin embargo, será indispensable realizar ensayos de RT-qPCR para validar los datos de RNAseq y realizar análisis funcionales para estudiar la participación de los genes candidatos en la simbiosis fijadora de nitrógeno. Asimismo, logramos identificar dos genes diferenciales que participan en el mecanismo de acción de sRNAs que participan en producción de tasiRNAs y en la modificación de la cromatina (argonautas y metilasas de DNA), que constituye un proceso biológico poco explorado en simbiosis.
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Estudio de las bases moleculares de la resistencia a la terapéutica antiviral en la infección por el virus de hepatitis B.

Amalia Inés Castillo ; Verónica Mathet

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La infección por el virus de la hepatitis B (HBV) constituye un importante problema de salud a nivel mundial, utilizándose análogos de nucleósidos (ANs) y/o inmunomoduladores para su tratamiento. Sin embargo, la terapia con estos fármacos a largo plazo puede tornarse ineficaz dada la frecuente aparición de mutantes resistentes. Actualmente se está estudiando la resistencia a fármacos no solo como un evento asociado a la aparición de mutaciones en el genoma viral, sino también a alteraciones en la expresión y actividad de bombas transmembrana en las células del hospedador. Se ha reportado que la proteína X del HBV (HBx) es un potente transactivador de genes virales y celulares. Es por esto que se decidió evaluar in vitro la capacidad del HBV para afectar la expresión de algunas bombas transmembrana de la familia ABC (MRP4 y BCRP), involucradas en la detoxificación celular y cuya sobreexpresión está directamente asociada a una alteración en la sensibilidad a las drogas en las células infectadas, impidiendo que se alcance la concentración intracelular necesaria y suficiente para que sea eficaz. Llamativamente, se documentó un aumento en la actividad del promotor del gen ABCC4 (MRP4) en células con sobreexpresión de HBx. A su vez, se observó un aumento en la expresión de la proteína MRP4 en un sistema de replicación in vitro del HBV, donde también está alterada la expresión de la proteína BCRP. Sin embargo, no se descarta que el virus pudiera afectar (a través de HBx u otras proteínas virales) más genes de esta familia constituyendo un mecanismo de resistencia a drogas antivirales poco estudiado hasta el momento. Teniendo en cuenta el rol de las bombas ABC en la resistencia a antivirales, en el presente trabajo se evaluó la actividad antiviral de compuestos capaces de interactuar con membranas biológicas, como lo son los co-polímeros de poli(óxido de etileno) y poli(óxido de propileno) y de su combinación con un AN, así como su efecto sobre la expresión de genes ABC involucrados en la detoxificación celular. Uno de estos compuestos, el poloxámero F127, presentó capacidad antiviral intrínseca, sin afectar la expresión de los genes ABC estudiados, por lo cual consideramos que estos estudios constituyen un antecedente relevante para analizar su futura incorporación a la terapéutica anti-HBV actualmente en uso.
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Estudio de las bases moleculares de los ritmos circadianos en C. elegans mediante un sistema reportero luminiscente

María Eugenia Goya ; Diego Andrés Golombek ; María Fernanda Ceriani ; Inés Carrera Garese ; Diego Hernán Rayes

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Goya, M. E. (2018). Estudio de las bases moleculares de los ritmos circadianos en C. elegans mediante un sistema reportero luminiscente. (Tesis de posgrado). Universidad Nacional de Quilmes, Bernal, Argentina.
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Estudio de las bases moleculares responsables de los fenotipos D negativo y D variante del sistema Rh en la población argentina: Importancia clínica

Carolina Trucco Boggione ; Carlos Cotorruelo

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El sistema Rh es el grupo sanguíneo más complejo y polimórfico de la membrana eritrocitaria. Presenta un gran interés clínico en Medicina Transfusional, Obstetricia y Hematología, debido a la participación de sus anticuerpos en los procesos de destrucción inmune de los glóbulos rojos. Los antígenos Rh desempeñan un papel central en las reacciones hemolíticas transfusionales, en la inmunización de pacientes politransfundidos, en la patogénesis de la Enfermedad Hemolítica Fetoneonatal y en algunas Anemias Hemolíticas Autoinmunes. El locus RH está compuesto por dos genes denominados RHD y RHCE que codifican para las proteínas transmembranales RhD y RhCE portadoras de los antígenos D y C, c, E, e, respectivamente. La presencia o ausencia del gen RHD en el ADN humano determina las bases moleculares del polimorfismo asociado a los fenotipos D positivo y D negativo. Los individuos D positivo poseen uno o dos genes RHD por célula; mientras que el fenotipo D negativo resulta de la ausencia del gen RHD, siendo las personas D negativo homocigotas para la deleción de este gen. Sin embargo, se ha reportado que existen numerosas variantes alélicas responsables de un fenotipo D negativo que dan origen a proteínas RhD que no expresan los epitopes del antígeno D o no se ensamblan en la membrana eritrocitaria. Además, se han descripto fenotipos D variante (Dvar) generados por distintos eventos moleculares que conducen a una expresión alterada de la proteína RhD. Dentro del fenotipo Dvar, las variantes cualitativas o fenotipo D parcial se caracterizan por la ausencia de algunos epitopes D mientras que las variantes cuantitativas, fenotipo D débil, presentan una expresión disminuida de todos los epitopes D. Los individuos con fenotipo D parcial pueden desarrollar aloanticuerpos anti-D hacia los epitopes que no poseen si son desafiados con eritrocitos D positivo. Por el contrario, las personas con fenotipo D débil no son susceptibles de desencadenar eventos de aloinmunización. Debido a la incapacidad de los métodos serológicos para discriminar entre fenotipo D parcial y D débil, los pacientes con un fenotipo Dvar deben ser considerados D negativo para transfusiones o embarazos. Por otro lado, el fenotipo DEL se caracteriza por presentar una expresión mínima del antígeno D en la membrana del glóbulo rojo. Debido a la dificultad para identificar el fenotipo DEL mediante las técnicas serológicas convencionales, la mayoría de los donantes portadores de estas variantes son tipificados erróneamente como D negativo, con el riesgo potencial de inducir una aloinmunización en receptores D negativo. El gran número de variantes fenotípicas descriptas y la elevada variabilidad en los patrones de reactividad que éstas presentan con los antisueros monoclonales restringen la aplicación de métodos serológicos para su correcta determinación. La caracterización molecular de las variantes alélicas resulta un recurso apropiado para resolver los problemas en aquellas situaciones clínicas donde la serología presenta limitaciones. Debido a la elevada variabilidad genética interpoblacional del sistema Rh, es de fundamental importancia establecer el polimorfismo molecular del locus RH en individuos de nuestro país con miras a implementar un abordaje inmunohematológico basado en estudios moleculares. En este trabajo de Tesis hemos investigado las bases genéticas del locus RH en nuestra población para aportar nuevos conocimientos sobre los mecanismos moleculares responsables del fenotipo D negativo y fenotipos con expresión débil del antígeno D. Se analizaron 1120 muestras de donantes que concurrieron a bancos de sangre y efectores de salud de Tucumán, Córdoba, Rosario, La Plata y CABA. Dentro de este grupo, se estudiaron 796 muestras con fenotipo D negativo portadoras de los antígenos C y/o E y 324 muestras con fenotipo D variante. Además, se investigó la presencia del marcador genético RHDΨ, característico de individuos de la etnia africana, en 221 muestras con fenotipo dccee provenientes de Tucumán y 1200 de Rosario, y el alelo DI*A, marcador genético de la etnia amerindia en 178 muestras de Tucumán y 150 provenientes de Rosario. En todas las muestras se realizaron estudios serológicos y moleculares. Se evaluó la presencia de los antígenos del sistema Rh mediante técnicas de hemaglutinación. Los fenotipos DEL fueron identificados por ensayos de adsorción y elución. Además, se realizaron estudios de los niveles de expresión del antígeno D por citometría de flujo. Se investigó la presencia del gen RHD mediante una estrategia de PCR multiplex basada en el polimorfismo de longitud del intrón 4 y en la presencia de una secuencia específica en la región 3' no codificante del gen RHD. Se diseñaron diferentes estrategias moleculares de PCR para caracterizar los mecanismos moleculares responsables de los fenotipos D observados. También se utilizaron técnicas de microarreglos de ADN y secuenciación para definir nuevos polimorfismos. Los estudios de detección del gen RHD por la estrategia de PCR multiplex realizados en este trabajo de Tesis permitieron identificar la presencia de fragmentos del gen RHD en 133 (16,71%) de las 796 muestras con fenotipo D negativo estudiadas (muestras D-/RHD+). Estos resultados mostraron que el fenotipo D negativo no es generado sólo por un evento de deleción del gen RHD en individuos de nuestra población. A través de las distintas estrategias moleculares utilizadas en este trabajo se caracterizaron variantes RHD nulas y DEL generadas por eventos de conversión génica entre alelos RHD y RHCE, deleción e inserción de nucleótidos, mutaciones de cambio de sentido y mutaciones sin sentido en muestras D negativo C/E positivo. Los estudios realizados detectaron 98 individuos (12,31%) portadores de alelos RHD nulos y 19 (2,39%) portadores de alelos DEL. Dentro de este grupo se caracterizaron las variantes alélicas no reportadas RHCE(1-2)-RHD(3361_371del11-10), RHD(329T>C)-CE(3-9)-D, RHD(581insG) y RHD(1001T>A) responsables de un fenotipo D negativo y el alelo RHD*1248insG que origina un fenotipo DEL. Se observó que la prevalencia de individuos portadores del nuevo alelo nulo RHD*581insG, responsable de la generación de la una proteína RhD truncada que no expresa epitopes D en la membrana eritrocitaria, fue significativamente mayor en las muestras provenientes de Tucumán que en las del resto de las regiones analizadas. Por otro lado, en este trabajo de Tesis se analizó la distribución del marcador genético DI*A, característico de la etnia amerindia con ascendencia asiática, en muestras provenientes de Tucumán y de Rosario. Los resultados mostraron una proporción significativamente mayor de individuos portadores de la variante DI*A en muestras de Tucumán, sugiriendo un aporte superior de la etnia amerindia a esta población. Considerando que la variante RHD*581insG no ha sido reportada en poblaciones caucásicas europeas, africanas ni asiáticas y que fue detectada con una alta prevalencia en una región donde el aporte amerindio al acervo genético de la población es mayor que en otras áreas geográficas, el nuevo alelo RHD*581insG podría asociarse a la etnia amerindia. Por otro lado, la variante alélica híbrida RHD-CE-Ds, característica de individuos de la etnia africana, fue detectada en el 43,61% de las muestras D-/RHD+ de todas las regiones estudiadas, siendo Tucumán la región con el mayor porcentaje observado. Además, los estudios de secuenciación permitieron caracterizar los mecanismos moleculares responsables del alelo DEL RHD*46C en muestras con expresión del antígeno E. Esta variante alélica fue detectada con mayor prevalencia en muestras provenientes de Rosario y Tucumán. En el grupo de muestras con fenotipo D negativo C/E positivo se detectaron también 15 portadoras del alelo híbrido RHD-CE(3-9)-D. En 7 de estas muestras se identificó el SNP característico del alelo RHD*DVII. Estos hallazgos permiten suponer que la nueva variante híbrida RHD(329T>C)-CE(3-9)-D es producto de una conversión génica entre los alelos RHD*DVII y RHCE*Ce. Debido a que ambas variantes son características de individuos caucásicos, los resultados sugieren que el nuevo alelo surge del aporte europeo a la población de nuestro país. Por otro lado, en este trabajo de Tesis se caracterizaron los eventos moleculares responsables de la generación de las nuevas variantes alélicas RHCE(1-2)-RHD(3361_371del11-10) y RHD*1001A, responsables de un fenotipo D negativo. Hemos demostrados por estudios de adsorción elución que ambas variantes codifican para un polipéptido RhD aberrante y no expresan epitopes D. Estos nuevos alelos fueron incorporados al grupo de las variantes RHD nulas. Además, se identificó una muestra portadora del nuevo alelo RHD*1248insG responsable de un fenotipo DEL. Esta variante alélica genera una proteína RhD de mayor tamaño. Estudios de adsorción-elución permitieron detectar cantidades mínimas del antígeno D en la membrana eritrocitaria. Estos hallazgos sugieren que la proteína RhD aberrante sería capaz de integrarse en la membrana del glóbulo rojo y expresar epitopes D. Los resultados obtenidos en este trabajo de Tesis demuestran la importancia de conocer la variabilidad alélica que subyace en el locus RH de individuos de nuestra población para desarrollar estrategias de genotipificación RHD que disminuyan la posibilidad de obtener resultados falsos positivos. El diseño de estudios moleculares que incluyan la caracterización de alelos RHD nulos optimizará el diagnóstico prenatal no invasivo del genotipo RHD, asegurando una estricta correlación entre el genotipo y el fenotipo fetal. Además, el conocimiento de las bases moleculares de los alelos DEL asociados a los diferentes grupos étnicos resulta fundamental para desarrollar estrategias de genotipificación en individuos D negativo. En este trabajo de Tesis hemos identificado un 2,39% de individuos portadores de alelos DEL. Estos hallazgos demuestran la importancia de implementar estrategias moleculares en las muestras D negativo C/E positivo para detectar polimorfismos responsables de fenotipos aparentes D negativo capaces de generar una aloinmunización en receptores D negativo. Por otro lado, hemos investigado los mecanismos moleculares del polimorfismo del locus RH en individuos portadores de variantes alélicas RHD responsables de fenotipos con expresión débil del antígeno D en nuestra población. Utilizando estrategias de biología molecular se identificaron alelos D parcial generados por conversión génica entre alelos RHD y RHCE o por SNPs y alelos D débil producto de mutaciones de cambio de sentido. Debido a la dificultad para discriminar serológicamente a las variantes cualitativas, actualmente los pacientes portadores de un fenotipo Dvar se consideran en riego de desarrollar una inmunización anti-D y por lo tanto, son tratados como D negativo para transfusiones o embarazos. Sin embargo, numerosas evidencias clínicas han demostrado que individuos portadores de los alelos D débil tipo 1, 2 y 3 no son susceptibles de aloinmunización anti-D ante una exposición a glóbulos rojos D positivo. Los estudios moleculares de las muestras con fenotipo Dvar mostraron que un 58,02% de los individuos resultaron portadores de alelos D débil tipo 1, 2 o 3. Los resultados indican que más del 60% de los individuos pertenecientes a las ciudades de la región central del país presentaron una expresión aberrante del antígeno D producto de estas variantes alélicas. Sin embargo, en Tucumán la distribución fue menor al 37%. Los análisis estadísticos indicaron que la probabilidad de encontrar un individuo portador de estos alelos en las muestras provenientes de Tucumán fue significativamente menor que para las otras 4 ciudades analizadas donde esta proporción no mostró diferencias significativas. El predominio de alelos D débil tipo 1, 2 y 3, característicos de caucásicos, indicaría un mayor aporte de europeos al acervo genético de la población de la región central del país. La implementación de estrategias moleculares que permitan detectar estas variantes en pacientes que presentan un fenotipo Dvar permitirá optimizar el uso de las escasas unidades D negativo disponibles en los servicios de Medicina Transfusional y reservarlas exclusivamente para los pacientes que se encuentran en riesgo real de desarrollar una respuesta aloinmune hacia el antígeno D. Además, en el grupo de muestras con fenotipo Dvar se caracterizaron los mecanismos moleculares responsables de variantes alélicas D parcial. Los resultados obtenidos mostraron una alta prevalencia de individuos portadores de alelos RHD parcial RHD*DVI (4,63%). Debido a que estas variantes alélicas generan una proteína RhD que carece de algunos epitopes D, los individuos portadores de estos alelos son susceptibles de desarrollar aloinmunización anti-D. La caracterización molecular de las variantes cualitativas en los servicios de Medicina Transfusional de nuestra población evitará posibles incompatibilidades Rh. Por otro lado, se identificaron variantes genéticas RHD producto de mutaciones de cambio de sentido no reportadas. Uno de los nuevos alelos identificados fue registrado y denominado D débil tipo 93 por la Sociedad Internacional de Transfusión Sanguínea (ISBT). Cabe destacar que, de las 31 muestras portadoras de la nueva variante hallada en este trabajo de Tesis, 20 (64,52%) corresponden a donantes provenientes de Tucumán. Teniendo en cuenta que el marcador genético DI*A demostró una mayor influencia amerindia en la región norte del país, la presencia de este alelo podría atribuirse al aporte de esta etnia al acervo genético de la población tucumana. Además, se identificaron 4 nuevas variantes alélicas RHD*325G, RHD*763A, RHD*764A y RHD*911A. Las sustituciones aminoacídicas generadas por estos SNPs provocarían alteraciones en el plegamiento de la proteína RhD que modificarían el correcto ensamblaje del polipéptido RhD en el complejo Rh alterando la expresión de los epitopes D. La discriminación entre variantes cuantitativas y cualitativas es de fundamental importancia en los bancos de sangre para optimizar la compatibilidad transfusional y garantizar la provisión de sangre segura, y en Obstetricia para definir estrategias de intervención médica en las embarazadas. Los hallazgos obtenidos en este trabajo de tesis sobre los mecanismos genéticos responsables de la variabilidad alélica del locus RH en la población argentina, tendrán su correlato en la implementación de estrategias moleculares como herramientas de laboratorio para la asignación precisa e inequívoca de las variantes antigénicas de importancia clínica. Teniendo en cuenta los estudios sobre el polimorfismo molecular del locus RH en nuestra población realizados en este trabajo de Tesis, se diseñó y evaluó un protocolo de genotipificación RHD fetal no invasivo con el objetivo de implementar a futuro una estrategia que contribuya al diagnóstico de la EHFN en embarazadas aloinmunizadas con anti-D y que permita optimizar el uso de la inmunoprofilaxis en mujeres D negativo no sensibilizadas. Considerando la alta prevalencia de alelos RHD silentes y DEL en nuestra población, el diseño de la estrategia de genotipificación prenatal debe tener en cuenta la variabilidad alélica del locus RH para asignar un correcto fenotipo. El algoritmo diseñado en este trabajo propone el estudio del ADN genómico materno para detectar mujeres embarazadas portadoras de alelos RHD y el análisis del ADN genómico paterno en aquellas situaciones donde los resultados obtenidos en el estudio del ADN libre por PCR en tiempo real no son concluyentes. Se realizaron estudios serológicos y moleculares en la sangre de los recién nacidos para correlacionar con los hallazgos moleculares obtenidos en el ADN libre con el fenotipo D eritrocitario de los neonatos. Los resultados obtenidos permitieron asignar el genotipo RHD fetal en el 98,99% de las muestras de plasma materno estudiadas. La correlación entre los resultados moleculares y serológicos mostró que la estrategia de genotipificación RHD prenatal presenta una sensibilidad del 100% al no obtener resultados falsos negativos y una especificidad del 98,81% al detectarse sólo un falso positivo, debido a la presencia de una variante alélica responsable de un fenotipo D negativo. El protocolo diseñado para la detección del gen RHD en ADN fetal libre en plasma materno demostró ser una herramienta útil para la determinación del estatus D del feto en nuestra población. La correcta genotipificación RHD prenatal permitirá diagnosticar fetos en riesgo real de EHFN y definir estrategias de administración de la profilaxis con inmunoglobulina anti-D exclusivamente a embarazadas cuyos fetos son D positivo.
tesis Acceso Abierto

Estudio de las boraginaceae de la sub-familia boraginoideae en la República Argentina

Roman Luis Perez Moreau

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Fil:Perez Moreau, Roman Luis. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.
tesis Acceso Abierto

Estudio de las briofitas de turberas de Tierra del Fuego (Argentina) desde el Último Máximo Glacial a la actualidad y su relación con las fluctuaciones climáticas y ambientales

María Adolfina Savoretti ; Juan Federico Ponce ; Fernando Omar Zuloaga

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Cobertura temática

En la presente tesis doctoral se da a conocer el contenido de macrorrestos de briofitas recuperado de testigos de turberas ubicadas en las localidades Estancia Harberton y Punta Moat, sureste de la provincia de Tierra del Fuego, Argentina. Se estudió estratigráfica y cuantitativamente el cambio de la composición de los taxones de briofitas y su relación con los cambios paleoambientales y paleoclimáticos. Las edades basales son 19.445 años cal. A.P. para E. Harberton y 10.226 años cal. A.P. para P. Moat. Se reconocieron 25.139 macrorrestos vegetales: 17.155 de briofitas, de las cuales 16.797 fueron asignadas a musgos, 358 a hepáticas y 7.984 a plantas vasculares. A su vez, se identificaron restos de invertebrados (288), algas (1), líquenes (24) y de carbón vegetal producto de paleoincendios (279). Se han identificado macrorrestos de briofitas pertenecientes a las Divisiones Bryophyta y Marchantiophyta. Entre las Bryophyta, se han reconocido 2 Clases (Sphagnopsida y Bryopsida), 6 Órdenes, 9 Familias (Sphagnaceae, Grimmiaceae, Dicranaceae, Ditrichaceae, Meesiaceae, Bryaceae, Plagiotheciaeae, Hypnaceae, Amblystegiaceae), 11 géneros y 8 especies. Entre las Marchantiophyta, se reconoció una Clase (Jungermanniopsida), 1 Orden, 3 Familias (Adelanthaceae, Cephaloziellaceae, Blepharidophyllaceae), 3 géneros y 2 especies. Las especies de briofitas se han reconocido formando diferentes asociaciones vegetales en las turberas de Tierra del Fuego en los últimos 20.000 años cal. A.P. Los macrorrestos vegetales estudiados presentan buena preservación y corresponden a taxones actuales. Por lo que, a partir del conocimiento de la brioflora actual y de las condiciones ambientales bajo las cuales se desarrollan, se ha podido utilizar a los taxones para realizar inferencias paleambientales. De esta manera se ha logrado establecer en ambas turberas una secuencia evolutiva conformada por tres ambientes principales: lacustre-fluvial periglacial inicial, minerotrófico y finalmente ombrotrófico. A partir de los resultados de los análisis de agrupamiento de los restos vegetales (briofitas, plantas vasculares, algas y líquenes) preservados en los testigos estudiados se han podido registrar cambios composicionales que se han vinculado con los principales cambios climáticos reconocidos durante el Tardiglacial y Holoceno para dos ambientes diferentes del área de estudio. Las interpretaciones surgidas son en gran medida correlacionables con interpretaciones generadas a partir de estudios polínicos llevados a cabo por otros autores. Estos resultados demuestran que el estudio de los macrorrestos vegetales y en particular de briofitas en turberas son de gran relevancia en las interpretaciones paleoclimáticas/paleoambientales del Cuaternario y demuestran ser un excelente complemento a los estudios basados en otros proxies.
tesis Acceso Abierto

Estudio de las características bio-ecológicas de un aislamiento autóctono del entomonemátodo Heterorhabditis bacteriophora (Nematoda:Heterorhabditidae) y su potencialidad como agente bioregulador de insectos

Daiana Pamela Eliceche ; María Fernanda Achinelly ; Nora Beatriz Camino

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Algunos nematodos parásitos de insectos tienen relaciones simbióticas con bacterias que son responsables de matar rápidamente a los insectos parasitados. A causa de esta muerte rápida, el termino entomopatógenos es utilizado para describir a estos nematodos. Los nematodos entomopatógenos de las familias Heterorhabditidae forman una simbiosis mutualista con bacterias patógenas de insectos de la familia Enterobacteriaceae, específicamente del genero Photorhabdus. Los juveniles infectivos (JIs) permanecen en el suelo en busca de un insecto hospedador adecuado. Tras la entrada a través de la cutícula o las aberturas naturales del hospedador, los JIs liberan las bacterias simbióticas en el hemocele de los insectos, provocando la muerte del mismo dentro de las 24-48 hs. Los nematodos se alimentan de las bacterias simbióticas, completan 1-3 generaciones en el cadáver del hospedador y, a medida que se agotan los recursos alimenticios, se producen nuevos JIs que se dispersan en busca de nuevos hospedadores. La variabilidad del complejo nematodo-bacteria, condiciona su virulencia, la cual a su vez se relaciona con el área de procedencia. Las especies nativas son consideradas en programas de control biológico de plagas respecto a especies introducidas, ya que se espera estén adaptadas a las condiciones locales, incluyendo a la propia plaga. El relevamiento de muestras de suelo provenientes de una huerta orgánica del cinturón hortícola platense, reveló la presencia de un nuevo aislado de Heterorhabditis bacteriophora, estudios morfológicos y moleculares, mostraron que las características morfológicas fueron cualitativamente similares a la de otras poblaciones de Heterorhabditis citadas y los análisis bioinformáticos permitieron determinar que este nematodo fuera un nuevo aislamiento de H. bacteriophora, el cual fue designado como Heterorhabditis bacteriophora SUP. Esta población representa un nuevo registro para el cinturón hortícola platense. A su vez, mediante estudios de morfología de las colonias, pruebas bioquímicas, biotipificación y análisis moleculares se caracterizó la bacteria endosimbionte asociada a este aislamiento como Photorhabdus luminescens. El uso excesivo de agroquímicos y la carencia de productos para control de plagas constituye uno de los principales problemas en el cinturón hortícola bonaerense por lo cual los enemigos naturales (parásitos, patógenos y depredadores) constituyen una alternativa de control de plagas de importancia agroeconómica. La caracterización de los diferentes aislados es necesaria para la búsqueda de nuevas alternativas al uso de agroquímicos para el control de plagas en la región. El uso y éxito de estos organismos a campo como agentes de biocontrol exige una metodología eficiente de producción que proporcione altas densidades de JIs sin alterar su virulencia. Cuando se aísla un agente de control biológico a partir de un ambiente natural y es criado en el laboratorio, o producido en masa con fines comerciales, sus atributos biológicos pueden alterarse dando lugar a la disminución y pérdida de la patogenia y la longevidad durante los procesos de producción, desarrollo y formulación, afectando laviabilidad de los productos comerciales. Varios factores podrían afectar su eficacia, entre ellos, la selección del hospedador para la cría in vivo. Tenebrio molitor se mostró susceptible a H. bacteriophora SUP cuya infectividad resultó ser mayor conforme al aumento de concentración de JIs, obteniéndose menores tiempos letales, sin embargo, la mayor producción de JIs se obtuvo con las menores concentraciones de exposición evaluadas. Dada la susceptibilidad de las larvas de T. molitor a la cepa en estudio, el uso de estos insectos como insectos de cría para la producción in vivo de H. bacteriophora representa una alternativa viable respecto al uso de Galleria melonella, debido a la facilidad para criarlos en el laboratorio y a los bajos costos económicos asociados. En este sentido, para maximizar la producción de este aislamiento deberían utilizarse las concentraciones más bajas. La viabilidad es otro factor a considerar, durante sus condiciones de almacenamiento, la temperatura y la densidad afectaron la supervivencia media de los JIs almacenados, resultando esta menor conforme aumenta la temperatura y a su vez por incremento de la densidad; resultando más adecuadas para su almacenamiento las temperaturas de 4 y 16°C y bajas concentraciones de JIs. A pesar de garantizar una amplia supervivencia, la temperatura de 4°C redujo significativamente la virulencia de los nematodos almacenados sin pasar por un hospedador. En cuanto a la eficacia de los JIs, la infectividad de la cepa en estudio fue mayor a superficies intermedias de exposición, obteniéndose mayores porcentajes de mortalidad con una concentración de 1000 JIs en capsulas de 10 cm respecto a 5 y 25 cm. En concordancia con la zona de origen de este aislamiento, caracterizada por un clima templado a cálido con un promedio anual de temperatura de 17°C, la viabilidad de la cepa, reproducción, actividad, infectividad y supervivencia resultaron óptimas en un rango de temperatura de 16 a 25°C, siendo 16°C la temperatura más adecuada para su mantenimiento en el laboratorio en pos de asegurar una alta longevidad, supervivencia y virulencia sostenida en el tiempo. La infectividad de los JIs podría estar relacionada con la viabilidad de su bacteria endosimbionte, en este sentido, las pruebas de viabilidad en medio líquido para P. luminescens, permitieron establecer un rango de temperatura de 16 a 25°C en el cual las bacterias sobrevivieron por más de 20 semanas. La utilización de enemigos naturales constituye uno de los pilares del manejo integrado de plagas, cuyo objetivo es reducir por debajo del nivel de daño económico la población de una plaga por medio de la utilización de diferentes estrategias de control, entre las que se encuentran el control biológico. En la Provincia de Buenos Aires la horticultura es una de las actividades agrícolas más importantes. Los reportes de plagas emergentes en huertas de producción orgánica, como el coleóptero Lobiopa insularis en cultivos de frutilla y Phyrdenus muriceus en cultivos de berenjena hace necesaria la búsqueda y evaluación de enemigos naturales para su uso en control biológico. La susceptibilidad de estos coleópteros al aislamiento caracterizado en este estudio fue probada. El aislamiento nativo H. bacteriophora SUP resultó ser infectivo sobre L. insularis, registrándose una susceptibilidad decreciente de 77,10; 56,67 y 25,00%, para larvas, pupas y adultos, respectivamente. La mayor susceptibilidad de larvas y pupas, sumado al comportamiento de estos insectos de dirigirse al suelo para empupar, los convierte en un blanco adecuado para el control con nematodos entomopatógenos. H. bacteriophora SUP pudo completar el ciclo en todos los estados de desarrollo de L. insularis, lo cual mejoraría el establecimiento y la propagación de este aislamiento tras una aplicación en el campo. Dada la susceptibilidad registrada y la factibilidad de su empleo en el control de los estados del coleóptero, se realizó una evaluación a campo, la cual incluyó la liberación de los JIs en la estación experimental Julio Hirschhorn ubicada en Los Hornos, Provincia de Buenos Aires para evaluar el efecto de control sobre L. insularis en cultivos de frutilla. Previo a la liberación se realizó un monitoreo en el cual se registró el número de frutillas presentes en el cultivo, se contabilizaron y clasificaron las frutillas por estado de maduración (verde, roja y fermentada) y se contabilizó el número de coleópteros por fruta examinada. La aplicación se realizó por medio de suspensiones acuosas de JIs. Se trataron un total de 6 parcelas, utilizando una concentración de 10.000 JIs por planta, y se marcaron otras 6 como controles. Los registros post-aplicación no arrojaron diferencias significativas entre parcelas tratadas y controles. Sin embargo, al comparar los registros pre-aplicación y post-aplicación, se detectaron diferencias significativas en el porcentaje de frutillas atacadas, 32% para los registros pre-aplicación y 28 y 17% para parcelas control y tratadas post-aplicación, respectivamente. Estas diferencias podrían ser atribuidas a una reducción del número de frutas disponibles como fuentes de alimento, y/o a la dispersión de los JIs desde las parcelas aplicadas hacia los controles. Los resultados indicaron que el 93,14% de los coleópteros se encontraron en las frutillas fermentadas, y que la proporción de frutillas fermentadas atacadas fue mayor a los otros estados. Por otro lado, la infectividad en trampas cebo colocadas en el campo demostró la persistencia de los nematodos durante el periodo evaluado (8 meses) y su dispersión a lo largo del cultivo. A los tres meses de ser aplicado se lo encontró en el 92% de las muestras de suelo colectadas, encontrándolos a lo largo de todos los camellones, incluidos los no tratados. H. bacteriophora SUP demostró varios atributos como potencial agente de control de L. insularis: se trata de una población adaptada a las condiciones ambientales y climáticas locales, provocó la muerte de los tres estados de la plaga, demostró un amplio poder de dispersión por medio de movimientos activos y/o pasivos, y a su vez pudo persistir en el ambiente. Las pruebas de laboratorio demostraron la susceptibilidad del coleóptero Phyrdenus muriceus a H. bacteriophora SUP, demostrando mayor virulencia frente a larvas y pupas, probablemente debido a la baja movilidad de estos estados respecto a los adultos. El nematodo pudo completar su ciclo en todos los estados evaluados. Dada la susceptibilidad de la plaga al aislamiento estudiado, la escasez de enemigos naturales y el nivel de daño ocasionado por los coleópteros en el momento de la plantación de los cultivos, pruebas de campo fueron realizadas con el objetivo de evaluar el control sobre P. muriceus. La liberación de H. bacteriophora SUP se realizó empleando dos metodologías de aplicación. El monitoreo de la plaga se estimó a partir del daño producido en las hojas, contabilizando el número de agujeros (daño) por hoja producidos por los gorgojos al alimentarse de la planta. Las evaluaciones realizadas luego de la primera aplicación, no mostraron un efecto positivo sobre la reducción de las poblaciones de P. muriceus. Los registros de daño en hojas no mostraron diferencias significativas entre tratamientos y controles, el rango de daño fue de 5,4- 6,1 agujeros/hoja; mientras que luego de una segunda aplicación de JIs, se detectaron diferencias significativas entre los tratamientos, cuyo rango de daño promedio fue de 26,4 -42 agujeros/hoja. Estas diferencias detectadas sumadas a la colecta de adultos de P. muriceus infectados con H. bacteriophora, permitieron determinar la eficacia de este nematodo sobre el control de esta plaga. A su vez, muestras de suelo fueron evaluadas mensualmente con el fin de conocer la persistencia y dispersión de los JIs aplicados en este cultivo. A partir de los datos obtenidos, se observó que dos meses después de la aplicación, los JIs se dispersaron a las parcelas asignadas como controles, ubicadas a 3 metros de los puntos de aplicación. Esto pudo deberse en parte al movimiento activo de los NEPs, y a su vez, a los movimientos pasivos, a través de hospedadores infectados, foresis y el agua. A partir de las muestras de suelo procesadas se pudo comprobar que durante siete meses el nematodo pudo persistir en el ambiente, lo cual podría deberse a la tolerancia de la larva dauer a la desecación y/o a la infección de nuevos hospedadores. Sin embargo, la dispersión fue menor a la registrada en el cultivo de frutilla. Esto podría deberse a una distribución insuficiente de la humedad a lo largo del cultivo dado el tipo de riego utilizado, el cual se realiza por surcos de inundación, cuya eficiencia puede ser tan baja que puede llegar a menos del 40% del cultivo. Los resultados obtenidos indicarían que H. bacteriophora SUP, podría ser un potencial agente de control de P. muriceus, dada la susceptibilidad demostrada en condiciones de laboratorio, la reducción del daño foliar registrado en el campo en los tratamientos realizados, y la recuperación de ejemplares infectados con el nematodo aplicado. Heterorhabditis bacteriophora SUP representa el primer registro de un nematodo entomopatógeno asociado a cultivos de tomate en el cinturón hortícola platense, sumándose a la lista de los enemigos naturales presentes en este cultivo, considerándose como un potencial agente de control de coleópteros plaga. Los resultados demostraron su potencialidad como biocontrolador de diferentes plagas agrícolas, debido a la factibilidad de producción en el laboratorio a la capacidad de infección, establecimiento y dispersión en condiciones naturales en dos agroecosistemas distintos.
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Fil:García, Augusto F.. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.