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Los glóbulos rojos (GRs) constituyen un interesante modelo para estudiar el envejecimiento celular debido a la facilidad de obtención de la muestra, su constante remoción y la carencia de núcleo y otras organelas subcelulares. El término “senescencia” se utiliza para los hematíes que muestran la mayor cantidad de cambios dependientes del tiempo y representan la población de eritrocitos que ha sido condenada a muerte. En un individuo con 5 litros de sangre, aproximadamente 10 hematíes son formados y removidos cada día. El eritrocito maduro se halla desprovisto de mecanismos de síntesis, iniciando desde el reticulocito, un proceso de envejecimiento progresivo que termina aproximadamente a los 115 días de su salida de médula ósea. Actualmente se ha propuesto que durante este proceso de senescencia, se producen modificaciones en algunas moléculas de la membrana que alteran sus funciones y las vuelven inmunogénicas. Estos antígenos de senescencia eritrocitaria son reconocidos por autoanticuerpos fisiológicos iniciando el proceso de remoción de los glóbulos rojos senescentes (GRSe) por las células del sistema mononuclear fagocítico (SMF). Sin embargo, la identidad molecular de estos neoantígenos y la naturaleza de los procesos que inducen a su expresión no han sido totalmente dilucidadas. La oxidación de las proteínas de membrana sería uno de los mecanismos más aceptados. Las modificaciones conformacionales o estructurales de la proteína Banda 3, podrían conducir a la formación o exposición de un sitio antigénico. Kay asignó el antígeno de senescencia eritrocitario (ASE) específicamente a la proteína Banda 3. Además, algunos autores han observado en GRSe, una pérdida de la asimétrica lipídica como resultado de la translocación de fosfatidilserina (FS) a la monocapa externa de la membrana plasmática. Los lípidos de la membrana eritrocitaria podrían ser considerados como el primer blanco oxidativo en el proceso de senescencia del hematíe. Experimentos in vitro, en los cuales se evaluaron el tiempo de almacenamiento de la sangre y la depleción metabólica del eritrocito, han demostrado un aumento en la fragilidad de la membrana del GRSe con la posterior liberación de microvesículas. Las vesículas son rápidamente removidas por células del SMF en un proceso mediado por receptores en los macrófagos que unen FS y probablemente también por autoanticuerpos específicos contra el ASE. Debido a que la membrana del eritrocito experimenta una fuerte interacción con el ambiente extracelular, las modificaciones en sus moléculas podrían ser responsables de la remoción selectiva de los hematíes. Actualmente se considera que los GRSe o dañados son removidos de la circulación in vivo por células fagocíticas en un proceso conocido como eritrofagocitosis. Algunos cambios en los GRs estarían involucrados en su eliminación por fagocitosis, aunque los detalles exactos de los procesos de señalización no son aún totalmente conocidos. Las modificaciones en la Banda 3 mayoritariamente debidas a procesos oxidativos aumentarían la afinidad por los anticuerpos naturales anti-Banda 3 que se encuentran normalmente en circulación. Estos anticuerpos autólogos junto con el depósito de fragmentos del Complemento principalmente C3, serían fácilmente reconocidos por receptores específicos de las células fagocíticas. Los eritrocitos son protegidos normalmente de la lisis mediada por complemento por proteínas de superficie reguladoras de la actividad del complemento. El factor acelerador de la degradación o DAF (CD55) inhibe la ruptura de C3 y C5 aumentando el decaimiento de la convertasa C3 y C5. El inhibidor de membrana de la lisis reactiva (CD59), impide la formación del complejo de ataque a la membrana mediante su unión a C8 y C9. La disminución de la expresión de las proteínas CD55 y CD59 en la superficie de los GRSe, conduciría a un aumento de la lisis mediada por el Sistema del Complemento. Por otro parte, el hematíe maduro en la circulación enfrenta un medio ambiente dinámico y es sometido a distintas fuerzas en sus pasajes por los vasos sanguíneos. Diferentes moléculas de adhesión participan en la regulación de esta interacción. En humanos, la glicoproteína CD47 está asociada con los antígenos Rhesus y ambos forman parte del complejo macromolecular Banda 3. CD47 inhibe la fagocitosis de los eritrocitos por los macrófagos del SFM a través de la unión a las proteínas regulatorias de las señales (SIRPα) en el macrófago. Un modelo experimental propone que durante el envejecimiento se induce un cambio conformacional en CD47, que le permite unirse a la trombospondina (TSP-1) creando un nuevo sitio de unión para SIRPa, que es capaz de reconocer a CD47 como una señal de fagocitosis en lugar de una señal inhibitoria de este mecanismo. La Hipótesis de este trabajo de Tesis es que durante el proceso de senescencia del hematíe, se producen cambios en algunas moléculas de la membrana plasmática, que actuarían como marcadores en la superficie celular activando la remoción selectiva de los GRSe. Por otra parte, considerando que las preguntas sobre los mediadores que determinan la captura de los GRs por las células del SMF y los procesos propios de la eritrofagocitosis siguen actualmente sin respuesta, el estudio propuesto en este trabajo de Tesis permitirá profundizar los conocimientos sobre los mecanismos biológicos involucrados en la senescencia celular y en la destrucción eritrocitaria. Como objetivos generales nos proponemos: investigar las modificaciones de moléculas de la membrana eritrocitaria durante el envejecimiento de los GRs y analizar la participación de estos cambios en la remoción selectiva de los GRSe. En una etapa inicial de este trabajo de Tesis, separamos las poblaciones de GRs de distintas edades por medio de gradientes de densidad. Debido a que la senescencia es un proceso continuo que no produce ningún cambio crítico que permita identificar con precisión las diferentes poblaciones eritrocitarias, evaluamos la separación por gradientes de densidad de Percoll, mediante el estudio de parámetros hematológicos (Volumen Corpuscular Medio (VCM) y % de Reticulocitos) y parámetros bioquímicos (concentración de creatina). En las poblaciones de GRJ obtenidas, los valores de VCM y el % de Reticulocitos, fueron significativamente mayores que los observados en las suspensiones de GRSe. Estos resultados verifican la eficacia en la obtención de fracciones eritrocitarias homogéneas, porque los hematíes envejecidos presentan menor tamaño. El aumento de la densidad de los hematíes en función del tiempo, se produce por una pérdida preferencial de los constituyentes más livianos de la solución citoplasmática, que conduce a una reducción del volumen. El mayor % de R en las suspensiones de GRJ, es un hallazgo esperable porque esta fracción representa los hematíes de menor edad. Los valores promedios de concentración de creatina en las poblaciones de GRSe, significativamente menores que los observados en los glóbulos rojos jóvenes (GRJ) se deben a una disminución en los intermediarios fosforilados del metabolismo energético que ocurre en el envejecimiento. También realizamos la cuantificación de las proteínas de membrana en las suspensiones de GRSe y GRJ, sin hallar diferencias significativas respecto a la edad del hematíe en la concentración de proteínas. En trabajos recientes se ha propuesto, que el proceso de oxidación de proteínas de membrana tendría un rol central en las modificaciones que se producen durante la senescencia eritrocitaria, debido a que los GRs son especialmente susceptibles a la injuria por oxidación al estar expuestos constantemente a altas concentraciones de O2. Por ello, estudiamos la formación de grupos carbonilos en las distintas poblaciones eritrocitarias, como marcadores de estrés oxidativo debido a su formación relativamente temprana y la estabilidad de las proteínas carboniladas. Los resultados obtenidos revelaron que el contenido de grupos carbonilos es significativamente mayor en los GRSe, confirmando un incremento del nivel de oxidación de las proteínas de membrana durante el envejecimiento. Por lo tanto, teniendo en cuenta que la senescencia eritrocitaria es un proceso multifactorial de enorme complejidad, que se caracteriza por alteraciones a nivel celular de aspectos fisicoquímicos y biológicos, estos resultados contribuyen a destacar la relevancia de los cambios oxidativos en las proteínas de la membrana involucrados en el proceso de reconocimiento y remoción selectiva de los GRSe de la circulación. Considerando que el parámetro fisiológico más importante del envejecimiento eritrocitario es la presencia de IgG autóloga, continuamos nuestra investigación determinando la concentración de IgG en GR intactos. Desarrollamos una técnica que mide el consumo de anti-IgG humana marcada con una enzima por células que contienen IgG unida a su superficie, realizando posteriormente la cuantificación de los anticuerpos anti-IgG no unidos. Los resultados obtenidos mostraron un aumento significativo en el contenido de IgG en las suspensiones de GRSe con respecto a los valores observados en los GRJ. Además, confirmamos el incremento de IgG autóloga sobre la membrana eritrocitaria en las poblaciones de GRSe mediante imágenes obtenidas por microscopía confocal, visualizando en forma directa la mayor cantidad de anticuerpos unidos a las células de mayor edad. El escaso número de IgG eritrocito específico encontrado bajo condiciones fisiológicas in vivo indica que la remoción de los GRSe es un proceso eficiente y muy bien regulado. Debido a que se ha propuesto que la acumulación de IgG provee un mecanismo directo para la remoción selectiva de los GRSe mediante la unión a receptores específicos sobre las células del SFM utilizamos un ensayo funcional de monocapa de monocitos (EMM) como parámetro evaluador de los fenómenos que ocurren in vivo. Los resultados obtenidos en esta prueba funcional confirman el incremento en la fagocitosis de GRSe que ha sido demostrada por otros autores utilizando técnicas más laboriosas y de mayor costo. Además evaluamos la pérdida de ácido siálico, utilizando el EMM con hematíes tratados con enzimas desialinizantes. Los resultados obtenidos indican que el tratamiento con neuraminidasa aumenta la interacción entre los eritrocitos y las células del SFM. En cambio, la actividad desialinizante de la tripsina no fue suficiente para producir variaciones en la fagocitosis. Estos hallazgos confirman que la pérdida de ácido siálico participa en la destrucción del hematíe, constituyendo una vía alternativa del principal proceso de fagocitosis selectiva de los GRSe que se produce por depósito de IgG autóloga en la superficie eritrocitaria . Considerando que en la obtención de células de diferentes edades por métodos separativos, la manipulación y la cantidad de muestra son limitaciones en estas investigaciones, estudiamos distintos marcadores de senescencia en sangre entera por Citometría de Flujo, por las ventajas que presenta esta metodología. Validamos el empleo de esta técnica analizando la presencia de IgG autóloga en poblaciones de GRs separadas por gradiente de densidad y en muestras de sangre entera sin separación física de las células. Posteriormente evaluamos la participación de proteínas reguladores de la actividad del Complemento (C3, CD55, CD59) y de la molécula de adhesión CD47. Las modificaciones en el nivel de expresión de las proteínas mayoritarias de los GRs: Banda 3 (CD233) y Glicoforína A (CD235a) en las diferentes poblaciones etáreas, podrían ser el resultado del proceso de microvesiculización y reducción del VCM. Los resultados obtenidos indicaron que estas poblaciones de GRs, pueden estudiarse sin realizar una separación física de las células de distintas edades. La evaluación directa de los GRSe por Citometría de Flujo, permite utilizar pequeñas cantidades de muestras y evita las manipulaciones de las técnicas separativas. Los resultados obtenidos en este trabajo de Tesis desde un punto de vista general, serán útiles a la investigación básica y aplicada vinculada al envejecimiento celular y en particular, profundizarán el conocimiento sobre los mecanismos de la senescencia eritrocitaria. Los avances obtenidos permitirán establecer la participación de los componentes intracelulares en los diferentes cambios en la superficie eritrocitaria que determinan su reconocimiento específico y los mediadores inmunológicos que conducen a la remoción selectiva de los GRSe. Además, la correcta descripción del proceso de senescencia eritrocitaria contribuirá al conocimiento sobre la etiología y desarrollo de algunas eritropatías y a la realización de un diagnóstico más precoz y adecuado. También, teniendo en cuenta que se ha postulado que en los GRs almacenados en los bancos de sangre se producen modificaciones similares a las observadas durante el envejecimiento eritrocitario in vivo, que podrían contribuir a los efectos adversos de las transfusiones, la identificación de los cambios en los GR envejecidos aportará nuevos enfoques para optimizar el mantenimiento metabólico y la integridad celular de los eritrocitos transfundidos. La correcta descripción del proceso de envejecimiento eritrocitario permitirá mejorar la eficacia transfunsional y la conservación de las fracciones eritrocitarias en los bancos de sangre.

La proto-oncoproteína c-Fos es un factor de transcripción tipo AP-1 cuya función fue descripta hace más de 25 años (Curran & Morgan 1987). En su función canónica, c-Fos forma heterodímeros funcionales con proteínas de las familias Jun, ATF o JDP, que se unen a regiones específicas del ADN y promueven la transcripción de múltiples genes blanco (Hess et al. 2004). Esta actividad AP-1 ha sido involucrada en la transformación de señales de crecimiento de corta duración en cambios de larga duración al regular la expresión de genes involucrados en el crecimiento celular. Evidencias previas del laboratorio han demostrado que la proteína c-Fos, de manera independiente de su actividad como factor de transcripción tipo AP-1, activa la síntesis de fosfolípidos al asociarse al retículo endoplásmico (Caputto et al. 2014). El objetivo principal de esta Tesis fue estudiar la actividad no genómica de c-Fos por la es capaz de activar la síntesis de lípidos, y en particular el mecanismo molecular por el cual c-Fos ejerce este efecto. Encontramos que para alcanzar el incremento en el marcado radioactivo de todas las especies de fosfolípidos analizadas, c-Fos afecta positivamente solo etapas metabólicas específicas. Utilizando homogeneizados de células NIH3T3 quiescentes, encontramos que c-Fos recombinante activa in vitro la actividad de CDP-diacilglicerol sintasa, Lipin 1 y fosfatidilinositol 4-quinasa tipo II pero no fosfatidilinositol sintasa. La constante cinética Vmax se incrementó para todas las enzimas analizadas mientras que no se observó ningún efecto en Km, una medida de la afinidad de la enzima por su sustrato. Más aún, hemos probado la activación in vitro en un sistema purificado que contiene sólo a c-Fos, Lipin 1 y membranas modelo compuestas de micelas mixtas de Triton X-100/PA. En este sistema altamente simplificado, encontramos que c-Fos incrementa la actividad enzimática de Lipin1 sin modificar la afinidad de esta por las membranas modelo. En orden de explicar el mecanismo de activación enzimática, realizamos ensayos de interacción proteína-proteína. Mediante ensayos de co-inmunoprecipitación y de microscopía FRET establecimos una interacción física entre c-Fos y las enzimas que activa mientras que esta no se produce con aquellas enzimas cuya actividad c-Fos no regula. El empleo de mutantes de deleción permitió determinar que la región involucrada en la activación enzimática es diferente de la región responsable de la unión a enzimas específicas, y que estas regiones de asociación/activación son comunes a todas las enzimas estudiadas. Mientras que la región de activación es el dominio básico de c-Fos, la región de asociación se encuentra en el N-terminal de la proteína. Los resultados apoyan nuestra hipótesis de un mecanismo compartido en la activación de la síntesis de fosfolípidos en el que c-Fos se asocia físicamente con las enzimas responsables de la síntesis de fosfolípidos que es capaz de activar modificando su eficiencia catalítica sin alterar la afinidad de la enzima blanco por su sustrato. A su vez, refuerzan el concepto de una proteína que posee dos funciones diferenciales como lo son la de su actividad como factor de transcripción y la capacidad de incrementar actividades enzimáticas claves per se, para de esta forma sostener eventos de proliferación o diferenciación celular.

Diversas evidencias experimentales demostraron que el desarrollo de insulinorresistencia (IR) se acompaña de cambios en la actividad del eje hipotálamo-hipófiso_adrenal (HHA) que se traducen en variaciones en los niveles sanguíneos de glucocorticoides (GC), tanto en pacientes como en modelos animales de la enfermedad. En trabajos previos de nuestro laboratorio demostramos un aumento en los niveles de GC en animales tratados con una dieta rica en sacarosa (DRS) durante 7 semanas que se asoció con una respuesta adrenal disminuida en la prueba de estimulación con la hormona adrenocorticotropina (ACTH). Dado que la principal hormona reguladora de la secreción de GC es la ACTH, el objetivo central de este trabajo de tesis consistió en evaluar los efectos de la administración de DRS sobre la producción de ATCH en distintos estadios del dearrollo de IR y estudiar los mecanismos subyacentes a las alteraciones encontradas a nivel adenohipofisario. En ese marco, evaluamos los efectos del tratamiento antioxidante sobre cambios tempranos inducidos por el consumo de DRS y del ejercicio moderado como medida preventiva de los efectos de la exposición prolongada a la dieta. Los resultados obtenidos indicaron que en el modelo animal de IR por la administración de DRS, los animales presentaron cambios en la secreción de ACTH y corticosterona. En etapas tempranas del tratamiento (3 semanas) encontramos un aumento en la actividad del eje HHA, que fue previa a la detección de cambios en la insulinosensibilidad sistémica (evidente a partir de la séptima semana del inicio del consumo de DRS). Sin embargo, en animales tratados por períodos más prolongados (15 semanas) observamos una disminución de los niveles circulantes de ACTH y de corticosterona. Postulamos que la hiperactivación temprana del eje podría estar asociada con la generación de estrés oxidativo a nivel adenohipofisario, dado que el tratamiento antioxidante sistémico previno tanto el aumento de marcadores de este proceso como la hipersecreción de ACTH. La disminución en la actividad del eje HHA detectada en etapas más tardías del tratamiento podría ser consecuencia de la exposición crónica del tejido hipofisario al estrés oxidativo, inducido por concentraciones elevadas de ácidos grasos no esterificados (AGNE) circulantes, un efecto que podría ser medido por la inducción de autofagia. Demostramos que el ejercicio moderado previno la inducción de estos procesos y la inhibición de la secreción de ACTH en animales alimentados con DRS durante 15 semanas, además de evitar el incremento de AGNE. Finalmente, estudiamos con mayor profundidad estos procesos en células adenohipofisarias en cultivo evaluando el efecto de la incubación de células de la línea ArR-20 con ácido palmítico (C16:O) y con inductores de estrés oxidativo y autofagia. En suma, nuestros resultados indican que la administración de una DRS produce un incremento temprano en la expresión de Pomc y ACTH posiblemente mediada por la generación de estrés oxidativo tisular. Una exposición prolongada del tejido a niveles incrementados de nutrientes, como los ácidos grasos, adicionalmente induce el proceso autofágico, lo que lleva a una hipofunción de la glándula. Los GC afectan el metabolismo estimulando la movilización de las reservas energéticas. Sin embargo, un aumento sostenido de los niveles de estas hormonas podría contribuir al agravamiento de las características metabólicas del síndrome de IR, y precipitar la aparición de las complicaciones a largo plazo relacionadas con la enfermedad. En nuestro modelo, el estado de IR crónico se correlacionó con una inhibición de la actividad basal del eje HHA, lo que contribuiría al restablecimiento de la homeostasis metabólica. Sin embargo, también podría dar lugar a complicaciones adicionales, como la insuficiencia adrenal, afectando la respuesta del organismo frente a situaciones de estrés, lo que representaría otro factor de riesgo para los pacientes con IR.

Fil:Valli, Eduardo. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

La interleuquina-1β (IL-1β) es una citoquina proinflamatoria central en procesos fisiopatológicos, sintetizada como un precursor (proIL-1β) que debe ser procesado proteolíticamente para la generación de su forma activa. En esta Tesis determinamos que los neutrófilos humanos altamente purificados liberan IL-1β en respuesta a estímulos infecciosos como el lipopolisacárido (LPS) y estériles, como los cristales de urato monosódico (MSU), así como también frente al primado con LPS y posterior estimulación con ATP. Los efectos de inhibidores específicos y la capacidad de los agonistas de inducir la activación de la caspasa-1 sugirieron que la secreción de IL-1β es dependiente de caspasa-1 y de las serinproteasas elastasa y/o proteinasa 3. Nuestros hallazgos realizados con neutrófilos de pacientes incapaces de activar a la enzima generadora de intermediarios reactivos del oxígeno (IRO) NADPH oxidasa, con una línea celular neutrofílica carente de actividad de esta enzima, y con un inhibidor específico de la misma, sugirieron que el evento de secreción de IL-1β madura de la célula requiere de la actividad de la NADPH oxidasa. Sin embargo, el procesamiento de la proIL-1β es regulado negativamente por los IRO, los cuales ejercen un efecto inhibitorio sobre la caspasa-1. Esta compleja regulación de la secreción de IL-1β que depende del estado rédox celular podría constituir un mecanismo fisiológico de control de procesos inflamatorios dependientes de IL-1β donde el neutrófilo cumple un papel destacado.

Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2016

Los neutrófilos son leucocitos que cumplen un papel clave en la defensa antimicrobiana. Éstos constituyen las células más numerosas de la sangre periférica, con una producción que se incrementa dramáticamente durante la inflamación o infección sistémicas. Tradicionalmente se les ha adjudicado un papel microbicida en la respuesta inmune, pero estudios recientes demostraron que pueden modular el curso de las mismas a través de la secreción de citoquinas entre las cuales se encuentra la Interleuquina-1β (IL-1β). Ésta es una citoquina proinflamatoria central en procesos fisiopatológicos que ejerce efectos pleiotrópicos tanto sobre el sistema inmune innato como el adaptativo. La IL-1β es sintetizada como un precursor inactivo que requiere clivaje proteolítico para ser activado. En respuesta a la estimulación con LPS y ATP, los neutrófilos humanos sintetizan pro-IL-1β y median la generación de su forma activa a través de la caspasa-1 tras la activación del inflamasoma. La IL-1β carece de péptido señal, por lo que es sintetizada en el citoplasma y secretada por vías no convencionales de naturaleza controvertida, que son independientes de la vía canónica que involucra al retículo endoplásmico-aparato de Golgi. En este trabajo de tesis, a través de estudios cinéticos cuantitativos que involucraron inmunomarcaciones, técnicas de microscopía confocal y cuantificación de las imágenes, así como ensayos de ELISA específicos y western blot, aportamos evidencias que sustentan que un mecanismo de autofagia secretoria se encuentra involucrado en la exportación de IL-1β en neutrófilos humanos. Estos estudios también indicaron que aun cuando los neutrófilos humanos liberan pro-IL-1β, su secreción no está mediada por autofagia. Además, los resultados evidenciaron que las serinproteasas neutrofílicas regulan la secreción de la IL-1β. Nuestros hallazgos indicaron que la IL-1β es secretada mayoritariamente en forma soluble, y sólo en una mínima proporción dentro de microvesículas y exosomas. Los resultados son compatibles con un modelo que involucra la participación de la chaperona HSP-90 y de la gasdermina D en la translocación de la IL-1β a las vesículas. Nuestros hallazgos también sugirieron que la autofagia controla el destino de los inflamasomas. Teniendo en cuenta las diversas condiciones de naturaleza infecciosa e inflamatoria en las que los neutrófilos infiltran masivamente los tejidos, los resultados de esta tesis aportan blancos moleculares potenciales, que podrían ser sujeto de investigaciones en el futuro para el diseño de nuevas estrategias terapéuticas para mitigar la inflamación en patologías en las cuales la IL-1β neutrofílica cumpla un papel relevante en su patogénesis.