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Conocer la diversidad genética de Azotobacter en suelos de Argentina es de gran interés científico-tecnológico debido a su uso actual y futuro en la agricultura. Por otra parte, los mecanismos de promoción del crecimiento vegetal de Azotobacter aún no han sido completamente elucidados. En este trabajo se llevó a cabo el aislamiento y la caracterización genotípica y fenotípica de cepas de Azotobacter. La especie más frecuentemente aislada fue A. chroococcum, mientras que reportamos por primera vez la presencia de A. salinestris y A. armeniacus en suelos argentinos. La producción de sideróforos, la solubilización de fosfatos y la producción de auxinas se evaluaron en 21 de los aislamientos obtenidos. Todas las cepas evaluadas produjeron sideróforos y auxinas, con diferencias entre ellas en la cantidad producida de auxinas, mientras que ninguna cepa solubilizó fosfatos. Se seleccionaron 6 cepas con valores contrastantes de producción de auxinas y se determinó su capacidad de producir ácido indol-3-acético (AIA), ácido giberélico (GA3)y zeatina (Z)por cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas, la capacidad de fijar N2 por la reducción de acetileno-etileno y la capacidad de promover la germinación y el crecimiento temprano de plántulas de trigo. Las 6 cepas seleccionadas produjeron distintos niveles de AIA, GA3 y Z y difirieron en la capacidad de fijar N2. La mayor producción de AIA correlacionó con un mayor desarrollo de raíces seminales y pelos radicales de las plantas inoculadas, y esas respuestas fueron reproducidas por la aplicación exógena de AIA. Además, se observaron efectos positivos de la inoculación sobre el crecimiento aéreo, los cuales no pudieron ser atribuidos a la producción de auxinas. Los resultados obtenidos demuestran que las fitohormonas producidas por Azotobacter jugarían un rol muy importante en la promoción temprana del crecimiento de las plántulas de trigo

El presente trabajo de tesis se ha focalizado en el estudio del comportamiento de Bordetella bronchiseptica frente a una condición de estrés ambiental como lo es la acidez. La elección de esta temática responde a que este patógeno respiratorio, capaz de inducir un conjunto de enfermedades denominadas bordetellosis, enfrenta y sobrelleva esta condición de estrés durante su ciclo de vida. La capacidad de resistir a a condiciones de acidez podría permitir a B. bronchiseptica inducir estadíos crónicos de la enfermedad, los cuales garantizan no sólo la sobrevida del patógeno dentro del huésped sino posibilitan la continuación de la circulación del mismo dentro de una población. Este estadío de cronicidad constituye por ello un problema para la salud. La profundización de este conocimiento relacionado a la sobrevida de B. bronchiseptica en condiciones de estrés, contriburía a un mejor manejo sanitario de este patógeno, capaz de inducir enfermedades en un amplio rango de huéspedes que incluye al hombre. En este contexto, en mi trabajo de tesis doctoral he abordado los siguientes objetivos específicos: • Evaluación del crecimiento de B. bronchiseptica en diferentes condiciones de acidez. Determinación de los valores de pH límite para el crecimiento • Evaluación de la capacidad B. bronchiseptica de desarrollar una respuesta de tolerancia a la acidez (ATR). • Impacto de los fenotipos virulento y avirulento de B. bronchiseptica en el proceso de resistencia/adaptación a la condición de estrés estudiada. • Identificación de componentes proteicos asociados al proceso de resistencia/adaptación mediante espectrometría de masas del tipo UV-MALDI TOF y TOF/TOF. Análisis proteómico de expresión diferencial 2D-PAGE. • Análisis y discusión del posible rol de los marcadores de respuesta a la acidificación del medio encontrados sobre el ciclo biológico del patógeno.

Objetivo general. Abordar la caracterización molecular y funcional de un sistema binario de plásmidos crípticos involucrados en la transferencia horizontal de genes por conjugación en la bacteria fijadora de nitrógeno y simbionte de alfalfa, Sinorhizobium meliloti. Objetivos específicos. En el marco del objetivo precedente abordaremos el estudio de las funciones que hacen a la transferencia conjugativa y a la replicación del plásmido críptico modelo pSmeLPU88b de S. meliloti descripto previamente por Pistorio et al., (2003) según el siguiente esquema: - Identificación y caracterización de elementos estructurales y genes involucrados en la movilización del plásmido modelo pSmeLPU88b. - Caracterización del complejo Dtr (DNA transfer and replication). - Clonado, y caracterización de la región génica del plásmido pSmeLPU88b asociada al módulo Dtr. Búsqueda y caracterización del gen de la relaxasa y de su producto de traducción como una de las proteínas centrales de la transferencia de ADN via conjugativa. - Identificación y caracterización funcional del origen de transferencia (oriT). - Evaluación con herramientas moleculares del grado de ubicuidad de funciones de movilización (Dtr) en S. meliloti. - Identificación y caracterización de los módulos de replicación del plásmido pSmeLPU88b. - Clonado de los módulos de replicación, secuenciamiento, estudios de incompatibilidad. - Evaluación de la transmisibilidad del plásmido pSmeLPU88b en el medio suelo, en condiciones de laboratorio y de campo.

Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2014

La sialidasa asociada a membranas Neu3 está involucrada en el catabolismo de glicoconjugados, especialmente de gangliósidos, e interviene en numerosos procesos biológicos tales como diferenciación, proliferación, migración y adhesión celular, regulando principalmente vías de transducción de señales. Dado que el mecanismo de asociación de Neu3 con membranas biológicas no se conoce, uno de los objetivos de este trabajo fue proveer más información sobre ese aspecto. Se encontró que Neu3 localiza principalmente en membrana plasmática, y también en endomembranas de compartimientos endosomales. Utilizando diferentes metodologías se demostró que el extremo C-terminal de la proteína está expuesto hacia el lado citosólico, y que otra porción de Neu3 está expuesta hacia el espacio extracelular, sugiriendo que la sialidasa posee las características de una proteína transmembrana. Sin embargo, análisis in silico y modelado molecular predijeron que la sialidasa no contiene segmentos α-hélices transmembrana en su secuencia, y que comparte la estructura de β-propeller, típica de las sialidasas virales y bacterianas. En la búsqueda de modificaciones post-traduccionales de Neu3, se encontró que la misma está S-acilada, y dado que la S-acilación está restringida al lado citosólico de las membranas, este descubrimiento apoya la idea de que la sialidasa contiene un dominio expuesto al citosol. Aunque aún queda por determinar exactamente cómo esta enzima atraviesa la bicapa lipídica, la primera parte de este estudio provee una nueva visión sobre la topología de Neu3 y se discuten algunas posibles configuraciones.Por otro lado, se estudiaron aspectos funcionales de la enzima no descriptos con anterioridad, como ser su participación en eventos endocíticos. Se observó que células que sobreexpresan Neu3 endocitan menos transferrina (Tf), un típico ejemplo de molécula que ingresa a la célula por endocitosis mediada por clatrina (CME). Dicha disminución en la endocitosis de Tf se observó también en células con reducido nivel de expresión de glicoesfingolípidos, sugiriendo que el efecto observado es independiente de la acción de Neu3 sobre gangliósidos. La disminución en la internalización de Tf, como así también de otras moléculas que ingresan por CME, pudo ser explicada debido a una distribución subcelular alterada del adaptador de clatrina AP-2, el cual se observó formando agregados en células que sobreexpresan Neu3. Por el contrario, clatrina, el fosfoinosítido PIP2 y caveolina mostraron una distribución normal. En conjunto estos resultados sugieren un rol específico de Neu3 en CME.

Gomphrena perennis es una maleza con metabolismo C4 y presencia de un sistema radicular con yemas capaces de rebrotar, lo que dificulta la siembra de cultivos estivales. Amplias zonas productivas de Argentina registran infestación con G. perennis tolerantes a glifosato. Los objetivos de la tesis fueron caracterizar morfo-anatómicamente las hojas de G. provenientes de lotes de Banderas, Santiago del Estero (Lat.28°28'00"S; Long.62°06'00"W) y de Marcos Juárez, Córdoba (Lat.32°41'00"S; Long.62°09'00"W), dos de las áreas donde la maleza constituye una importante problemática para el productor agrícola. Además, determinar si las estructuras presentes en la epidermis podrían comportarse como barreras mecánicas para la absorción y posterior traslado del herbicida, cuantificadas por la acumulación de ácido shikimico (AS) y otros parámetros metabólicos. Semillas de ambas procedencias se sembraron y se cultivaron en invernadero (INFIVE) y en intemperie. Cuando las plantas alcanzaron 4 hojas expandidas se aplicaron diferentes dosis de glifosato (0; 180; 360; 720, 1440, 2880 y 5760 g.e.ácido/ha) Se evaluó contenido de AS en raíces (R), hojas basales (HB) y hojas apicales (HA). A los 7 días post-aplicación (DPA) se midió la fotosíntesis neta (PN), transpiración (E) y conductancia estomática (CS) en plantas control (T) y tratadas con la dosis recomendada (DR:1440 g.e.a/ha). Se registró la supervivencia (S) a los 15 y 30DPA. El diseño fue aleatorizado con tres repeticiones y los datos fueron analizados por medio de la prueba de Anova (p<0,05 y p<0,01). Las dos poblaciones fueron tolerantes a glifosato, si bien la de Banderas manifestó una mayor sensibilidad a la DR del herbicida respecto a la de Córdoba. G. perennis posee baja área foliar, con ceras epicuticulares, y abundantes tricomas, los cuales se comportarían como barreras físicas reduciendo la eficacia del glifosato, lo que explicaría la tolerancia al herbicida. Banderas mostró mayor densidad de tricomas por unidad de superficie que la de Córdoba, si bien éstas últimas tuvieron mayor cantidad de drusas. La mayor susceptibilidad a la DR en Banderas se manifestó por presentar clorosis y necrosis en hojas apicales a partir de 2DPA, mientras que Córdoba manifestó esos síntomas con menor severidad y luego de mayor cantidad 7 de DPA. En ambas poblaciones se observó ruptura de dominancia apical cuando se aplicó la DR del herbicida y superiores. Esta respuesta indujo la actividad de yemas basales del xilopodio, causando rebrote y desarrollo de nuevas ramificaciones aéreas. Estas modificaciones por efecto del herbicida serían causadas por la alteración en el modelo del traslado de asimilados, cambiando los destinos hacia los órganos subterráneos. Siete DPA de la DR del herbicida se observó reducción en la PN, E y CS en ambas poblaciones. Dicha disminución fue más acentuada en Banderas evidenciando mayor sensibilidad a la aplicación del herbicida. Éstos resultados indican que el glifosato afecta los parámetros metabólicos en plantas susceptibles, si bien la DR no resulta efectiva debido al rebrote de las yemas axilares del xilopodio observado a los 15DPA. El conocimiento de la morfología y ecofisiología de esta especie, como así también la dinámica de la germinación y crecimiento de las plántulas proporcionarían las pautas necesarias para tomar las decisiones técnicas para un manejo adecuado de control.

Tesis (Doctor en Ciencias Agropecuarias) -- UNC- Facultad de Ciencias Agropecuarias, 2017

Tesis en Ciencias de la Salud -- Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Médicas

En un ambiente complejo y heterogéneo, el éxito de los individuos y de su descendencia depende de la capacidad de localizar los recursos y las condiciones necesarias para su supervivencia. El encuentro de los recursos y la evaluación de las condiciones se logran a través de la percepción de estímulos o claves, y particularmente en los insectos, los estímulos químicos juegan un rol central en estos procesos. En los parasitoides, la búsqueda y localización de los hospedadores, los cuales constituyen el recurso fundamental en su vida, puede involucrar diferentes tipos de estímulos, pero en particular son las claves químicas volátiles las que están mayormente implicadas en este comportamiento. El moscardón cazador de abejas Mallophora ruficauda es un parasitoide solitario de larvas de coleópteros de la familia Scarabaeidae (gusanos blancos del suelo) y una plaga de la apicultura de la Región Pampeana Argentina. En estado adulto es depredador de insectos, en particular de abejas melíferas, y en estado larval parasita preferentemente a larvas de tercer estadio de Cyclocephala signaticollis. La localización del hospedador por M. ruficauda está compartida entre la hembra y la larva. En primer lugar, la hembra localiza el hábitat del hospedador y ovipone en sustratos altos maximizando la dispersión de su progenie por el viento. En una segunda fase, las larvas que llegan al suelo se entierran, mudan y buscan activamente a su hospedador por medio de claves químicas que se originan en el tubo digestivo del gusano blanco. Hasta el momento, existen algunos aspectos de este mecanismo de localización que se desconocen. Por tanto, en la presente Tesis se estudiaron aspectos asociados al comportamiento de localización del hospedador por parte de M. ruficauda, tales como las características morfológicas de las estructuras sensoriales de los adultos y las larvas, los aspectos fisiológicos y morfológicos de las larvas sociados al período de búsqueda, y el rol ecológico y origen de las claves químicas producidas por los hospedadores. Se encontró que las antenas de los adultos de M. ruficauda están especializadas en la captura e intercepción de estímulos químicos volátiles, posiblemente involucrados en los comportamientos de apareamiento y oviposición. Las larvas de primer y segundo estadio del parasitoide poseen una clara diferencia morfológica en sus estructuras cefálicas, lo que podría estar vinculado al comportamiento diferencial observado entre estos estadios durante el proceso de búsqueda del hospedador. Además el estudio del tamaño corporal de las larvas de primer estadio que nacen a lo largo de la temporada reproductiva sugiere que habría una asignación diferencial de recursos energéticos por parte de las hembras, pero no se ha encontrado un patrón claro al respecto. Por último, se determinó que tanto las larvas de estadio II de M. ruficauda como las de estadio III de C. signaticollis se orientan positivamente hacia extractos de la cámara de fermentación de las larvas de estadio III de C. signaticollis. Estos resultados sugieren que las larvas de M. ruficauda podrían estar explotando el sistema de comunicación química de su hospedador durante la búsqueda y localización. Se determinó indirectamente el origen de estas claves, observándose la presencia de microorganismos asociados al hospedador en esta región del tubo digestivo. Mediante experimentos comportamentales se demostró que los productos metabólicos de estos microorganismos serían las claves que orientan a las larvas del parasitoide durante la localización del hospedador. Sin embargo, no se determinó la función de estas sustancias químicas en las interacciones intraespecíficas de C. signaticollis. En conclusión, M. ruficauda presenta estructuras sensoriales especializadas vinculadas a la percepción de estímulos químicos volátiles, aspectos fisiológicos que permiten la sobrevida de las larvas hasta el encuentro con el hospedador, y el uso de claves altamente confiables y específicas durante la búsqueda, las cuales contribuyen a la eficiencia en la localización de recursos por larvas y hembras de M. ruficauda. Esta Tesis es una contribución al conocimiento de la historia de vida de M. ruficauda y un aporte al entendimiento de otras especies de parasitoides con características y estrategias de vida similares.

La visión de movimiento provee claves esenciales para guiar comportamientos críticos como la detección de presas, predadores y coespecíficos. En los decápodos crustáceos e insectos pterigotas, la codificación de la información visual de movimiento está asociado con el procesamiento visual en el tercer ganglio óptico, la lóbula. Allí, las neuronas tangenciales gigantes (LG) integran información visual de delgadas neuronas columnares y la envían al cerebro medio guiando las respuestas comportamentales correspondientes. A pesar de la importancia de estas neuronas columnares en la codificación visual, estas no habían podido ser estudiadas electrofisiológicamente dado su delgado calibre. En esta tesis, desarrollamos una aproximación experimental para realizar registros poblacionales in vivo de estas pequeñas neuronas con técnicas de imágenes funcionales de fluorescencia sensible a calcio. En primer lugar, estudiamos la citoarquitectura de la lóbula y caracterizamos cuatro estratos donde arborizan las neuronas columnares de entrada de la lóbula. Luego nos centramos en estudiar cómo distintos parámetros de un estímulo de movimiento afectan la actividad de las neuronas columnares. Las respuestas más intensas las obtuvimos al enfrentar al animal a estímulos oscuros que a frente estímulos claros, y frente a estímulos rápidos que a estímulos lentos. Además, estudiamos la respuesta comportamental de evitación de los cangrejos frente a las mismas características visuales con las que fueron estudiadas las neuronas transmedulares. Encontramos que la actividad en las neuronas transmedulares correlaciona fuertemente con la intensidad de la respuesta de escape evocada por dichos estímulos. Por otra parte, cuando un animal es confrontado a una repetición de estímulos de movimiento que resultan ser inocuos, la mayoría de los animales aprenden a ignorar el estímulo. A pesar de que muchos artrópodos se habitúan a la presentación reiterada de objetos en movimiento, los sitios y mecanismos neuronales que subyacen a éste fenómeno aún no han sido identificados. Encontramos aquí que las neuronas columnares que transmiten la información al segundo ganglio óptico persisten en responder frente a la estimulación reiterada de estímulos de movimiento. Sin embargo, las neuronas columnares que transmiten la información visual del segundo ganglio óptico al tercero, la lóbula, suprimen su actividad frente a la misma estimulación. Esta rápida reducción en la actividad de las neuronas aferentes a la lóbula, que es de corta duración y restringida únicamente al área entrenada de la retina, concuerda con los cambios comportamentales observados frente al mismo entrenamiento visual. Por último, nos propusimos estudiar si la adaptación en columnas visuales entrenadas a ciertos atributos se generaliza a objetos en movimiento novedosos. Entrenamos a los animales a un atributo visual y evaluamos la generalización a un nuevo atributo presentado en el mismo área de estimulación. Obtuvimos una recuperación parcial de la respuesta de calcio de neuronas adaptadas tanto a la dirección de movimiento como al contraste cuando fueron evaluadas con el atributo visual novedoso. La presentación de dos atributos visuales a la hora de la evaluación no mostró diferencias significativas respecto al cambio de un único atributo. Los resultados obtenidos en esta tesis son consistentes con la participación del tercer ganglio óptico en la codificación de estímulos de movimiento en artrópodos. Más aún, dado que las neuronas columnares se originan en el segundo ganglio óptico, la información visual de movimiento comenzaría a codificarse en el segundo neuropilo óptico. Nuestros resultados muestran que los comportamientos guiados por la visión de movimiento quedan determinados, en gran medida, por las propiedades de codificación de las neuronas columnares que comunican la médula con la lóbula.