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El objetivo principal de este trabajo de tesis ha sido el estudio de los mecanismos de defensa del girasol frente a la podredumbre basal causada por el hongo Sclerotinia sclerotiorum. El sistema experimental estuvo constituído por distintos estadios del ciclo de vida del hospedante que exhiben diferencias en su susceptibilidad al ser inoculadas con el hongo. La determinación de dicho sistema implicó la realización de curvas de susceptibilidad en función de la edad bajo dos condiciones lumínicas: 12 y 16 horas de luz diaria. Las edades estudiadas fueron: estadio vegetativo (I); botón floral cerrado (II) y botón floral abierto (IV). El estudio se llevó a cabo a través del desarrollo de dos líneas principales de trabajo: un estudio del estado nutricional del hospedante previo a su inoculación, el análisis de mecanismos de defensa bioquímicos y mecánicos pre y postinfeccionales. La primera incluyó un análisis global de ciertos factores nutricionales que podían gravitar tanto como factores predisponentes o de resistencia: contenido de azúcares totales, de aminoácidos libres y de calcio en las zonas basales de tallos sanos de diversas edades. La segunda se inició con estudios preliminares acerca del efecto de diversos extractos de tallos sanos e inoculados de girasol sobre el crecimiento micelial (CM) y la formación de esclerocios in vitro. Ciertas evidencias sugirieron la relación de los compuestos fenólicos con los efectos inhibidores detectados. Esto llevó a la decisión de profundizar en el papel de estos compuestos en la defensa. Para ello se realizaron estudios cuali y cuantitativos de los fenoles en tallos sanos e inoculados de las diversas edades. Se aisló, identificó y cuantificó el compuesto de mayor actividad antifúngica. Se determinó la concentración necesaria para producir una inhibícíón del 50% in vitro (Cl 50). Como complemento se estudió la localización anatómica por medio de métodos histoquímicos y de autoflorescencia, de los fenoles en cortes transversales de tallos, a fin de conocer si esta coincidía con las zonas de infección. El análisis de los mecanismos mecánicos consistió en un estudio de la anatomía del tallo sano según la edad del hospedante al inocular. Esto permitió conocer el estado de diferenciación del sistema vascular en cada estadío. Mediante reactivos histoquímicos se tuvo una idea de la proporción de los elementos lignificados e intensidad de la lignificación. El cálculo de los volúmenes de los distintos tejidos según la edad permitió elaborar una hipótesis acerca de la presencia y cantidad relativa de los mismos como factor de tolerancia o susceptibilidad. Los resultados obtenidos permitieron concluir que existen diferencias genotípicas para la susceptibilidad las que exhiben su máxima expresión en el estadio de botón floral cerrado (II). Se corroboró que dicha expresión a su vez aumenta al disminuir la cantidad de horas de luz bajo la que crecen las plantas. Por ello, las diferencias en susceptibilidad se deberían al menos a los dos tipos de mecanismos: bioquímico y mecánico. Dentro del primero se destacó la acumulación del ác. isoclorogénico por encima de umbrales inhibitorios en los estadios tolerantes o individuos tolerantes dentro del estadio de máxima susceptibilidad. Asimismo se acumularon en los tolerantes ésteres fenólicos no inhibidores per se, pero cuyas agliconas provocaron efectos tóxicos sobre el CM. La localización periférica de los fenoles coincidente, con las zonas de infección constituye una evidencia más a favor de la relación de estos compuestos con la tolerancia. Con respecto a los factores mecánicos, la presencia de un anillo contínuo de elementos lignificados así como un mayor volúmen de los misnos, se considera un elemento complementario para retardar el avance fúngico en los estadios más adultos. Sumado a este mecanismo de naturaleza preinfeccional, la impregnación de ciertas paredes celulares con ésteres de ácidos fenólicos como consecuencia de la infección constituiría un factor de tolerancia adicional al dificultar la degradación de las paredes del hospedante. Los mecanismos bioquímicos incluirían compuestos de otras naturalezas que no han sido estudiados (efecto inhibidor de extractos clorofórmicos en tallos inoculados de edad IV). El ácido isoclorogénico resultó el compuesto fenólico más abundante en girasoles tolerantes cultivados a campo y en tallos inoculados de H. tuberosus (especie tolerante a S. sclerotiorum). Ninguno de los componentes de defensa sería por sí solo responsable de la tolerancia, sino que esta surgiría de un adecuado balance de los mismos no solo en magnitud sino también en tiempo de aparición y velocidad de desarrollo.

Tesis (Dra. en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2019

Los artrópodos, en especial los insectos y crustáceos, son animales muy activos que poseen repertorios comportamentales altamente complejos, la mayoría de los cuales se encuentran guiados por la información visual. Así, la interacción entre el sistema visual y motor es fundamental en una variedad de funciones como por ejemplo: tener buenos sistemas de navegación, escape, detección e identificación de predadores, presas y coespecíficos, etc. Dentro de esta gama de comportamientos, esta tesis estudia el funcionamiento del sistema de escape del cangrejo Chasmagnathus granulatus frente a los estímulos de colisión. Para esto, desarrollamos un dispositivo que mide la respuesta locomotora del animal cuando se aplican estímulos visuales generados por computadora. Con este dispositivo caracterizamos la respuesta de escape de Chasmagnathus a estímulos que simulan colisiones de objetos que se acercan al cangrejo a velocidad constante. Medimos la respuesta motora del animal variando distintos parámetros del estímulo como ser: la velocidad de aproximación, el tamaño del objeto, la dirección de acercamiento y el contraste respecto al fondo. Encontramos que la respuesta de escape es compleja y está compuesta por una secuencia de fases encadenadas, es altamente direccional y la velocidad del animal es controlada instantáneamente por la entrada visual. Analizamos el comienzo del escape y encontramos una variable que lo predice. Luego de la caracterización comportamental, pasamos a describir la respuesta de las Neuronas Gigantes de la Lóbula (neuronas LG). Mostramos que las neuronas MLG1 y MLG2 (Monostratified Lóbula Giant Neuron 1 y 2) y BLG1 (Biestratified Lóbula Giant Neuron 1) responden preferencialmente a estímulos que representan colisiones de objetos y codifican la dinámica de expansión temporal de los estímulos. Mostramos que la tasa de disparo de las neuronas MLG1 y BLG1 codifican la velocidad angular del estímulo y que las neuronas MLG2 codifican la aceleración angular. Por otro lado, las neuronas BLG2 (Biestratified Lóbula Giant Neuron 2), codifican una información cualitativamente distinta a las tres neuronas anteriores respondiendo principalmente el comienzo y la finalización de la expansión. Una vez medidas las respuestas comportamentales y neuronales, analizamos la posibilidad de predecir el comienzo del escape en función de la actividad de las neuronas LG y encontramos un criterio que usa información de dos neuronas que correlaciona con el mismo. Finalmente, desarrollamos un modelo simple que usando la tasa de disparo de las neuronas LG, predice la velocidad de los animales durante el escape.

El objetivo del trabajo fue estudiar los mecanismos de excitación del plasma de xenón y de las características de la emisión producida en la región UV-visible, tanto espontánea como láser. Para ello se hizo uso de la espectroscopia resuelta en tiempo, espectroscospía atómica convencional y de modelos teóricos para analizar su funcionamiento.

Se evaluó la reactividad de compuestos modelo representativos de alimentaciones tradicionales y residuales utilizadas en el proceso de FCC (Fluid Catalytic Cracking) sobre catalizadores sintetizados en planta piloto, comercial de maximización de LCO (Light Cycle Oil) fresco y equilibrado, y modificados en laboratorio por steaming (tratamiento hidrotérmico con vapor, 788 ºC, distintos tiempos de contacto). La evaluación catalítica se realizó en un reactor Simulador de Riser CREC a distintas temperaturas, relaciones Cat/Oil y tiempos de reacción. La identificación de los productos de reacción fue por cromatografía gaseosa. La conversión de compuestos presentes en los cortes gasolina y LCO, como decalina (nafténico), tetralina (nafténico-aromático) y naftaleno (aromático), permitió identificar los aromáticos formados y proponer mecanismos de formación de tales compuestos. La reactividad de poliaromáticos presentes en el LCO y HCO (Heavy Cycle Oil), como el 1-feniloctano y bifenil (aromáticos alquilados), el fluoreno y 9, 10 dihidrofenantreno (nafténico-aromáticos) y el fenantreno, pireno y benzo(a)antraceno (aromáticos policíclicos) permitió reconocer que estos compuestos pueden fraccionarse y condensarse, favoreciendo la formación de benceno y coque respectivamente. La conversión de quinolina-65, considerado como reactivo representativo de residuos mostró alta sensibilidad a la producción de coque, lo que permitiría su empleo como compuesto modelo para determinar selectividades a coque. La reactividad de las fracciones constituyentes de un residuo de torre atmosférica (saturados, aromáticos, resinas y asfaltenos), sugiere que cada fracción tiene un comportamiento individual diferente, existiendo interacciones entre las mismas cuando integran un residuo, por lo que su comportamiento global no puede predecirse de manera aditiva.

La escisión precisa del transposón Tn10 se tomó como sistema modelo para el estudio de la generación de deleciones que ocurren entre secuencias cortas de ADN duplicadas que limitan a secuencias palindrómicas. Este tipo de estructura genera frecuentemente deleciones en bacterias y en organismos superiores. El transposón Tn 10 es un elemento genético de 9,3-Kb con extremos repetidos invertidos de 1,5-Kb que duplica secuencias de 9-pb de la molécula aceptora durante su inserción en el genoma. La escisión precisa de Tn10 es un evento independiente de la transposición, que se produce por la eliminación de todas las secuencias del transposón junto con una copia de la secuencia repetida de 9-pb. La frecuencia de escisión precisa de Tn10 varía drásticamente con el sitio de inserción entre 10-6 a 10-8 por elemento por generación. En este trabajo se observó que la frecuencia de escisión precisa de Tn10, desde distintos sitios del genoma de Salmonella typhimurium y de Escherichia coli incrementa hasta 50 veces por la acción de la mitomicina C y Ia irradiación ultravioleta. Con el objeto de dilucidar los mecanismos involucrados en la inducción de este fenómeno, se analizó la frecuencia de escisión precisa de Tn 10, luego de irradiación ultravioleta o tratamiento con mitomicina C, en bacterias con mutaciones en genes de reparación del ADN. Los experimentos realizados con Salmonella typhimurium indicaron que el incremento en Ia frecuencia de escisión precisa de Tn10 luego de la irradiación ultravioleta es independiente de la reparación por escisión de dímeros (sistema UvrABC) y dependiente de alguna función de la proteína RecA, ya que no se evidencia en mutantes recA. Los experimentos realizados con la mutante topA y con el plásmido pKM101 sugirieron que la inducción de la escisión precisa de Tn10 ocurre por mecanismos distintos a los involucrados en la inducción de mutaciones puntuales. Se continuaron los estudios en cepas de Escherichia coli con mutaciones en genes del sistema SOS. Los resultados obtenidos con la mutante lexA3 (ind-), que es defectiva en la inducción del sistema SOS, demostraron que es necesaria la expresión de algún gen de este sistema para que se incremente la frecuencia de escisión luego de irradiación ultravioleta. Experimentos realizados en mutantes laxA3 (ind-) portadoras de un plásmido ptac-recA (gen recA regulable por IPTG) indicaron que cantidades aumentadas de proteina RecA no son suficientes para que se produzca la inducción en condiciones de represión de los demás genes SOS. Con el fin de identificar el o los genes SOS responsables del aumento en la frecuencia de escisión luego de irradiación ultravioleta, se analizó la inducción en cepas defectivas en el procesamiento mutagénico SOS y en cepas defectivas en la reparación recombinacional. Los experimentos realizados con mutantes umuC nulas, recA727 y el plásmido pKMlOl demostraron que los mecanismos involucrados en la inducción de la escisión precisa de Tn10 son distintos a los involucrados en la inducción de la mutación puntual. Los experimentos realizados con las mutantes recN, ruvA y ruvB indicaron que estos genes, que participan en la reparación recombinacional o postreplicativa del ADN, intervienen en el proceso en estudio. Los experimentos realizados con las mutantes recBC sbcB y recF, indicaron que los genes recBC o sbcB y recF también podrían estar involucrados en forma directa o indirecta en el proceso de inducción de la escisión precisa de Tn10. Con el fin de comparar los resultados obtenidos sobre el comportamiento de la escisión precisa de Tn10 con los de un elemento genético similar pero de menor tamaño se utilizó un minitransposón de 1,8 Kb (mini-Tn10 Km). Se observó que la frecuencia de escisión de mini-Tn10 km incrementa hasta 10 veces por Ia acción de la mitomicina C y Ia irradiación ultravioleta. Experimentos realizados con mutantes lexA3 (ind-), defectivas en la inducción del sistema SOS, indicaron que la inducción de la escisión de mini-Tn10 Km depende de la expresión de este sistema. Experimentos realizados con mutantes recN y ruvB indicaron que en el incremento de la escisión de mini-Tn10 Km están involucrados genes de reparación recombinacional o postreplicativa. En conclusión, los resultados presentados en este trabajo demuestran que el incremento en la frecuencia de escisión de Tn10 y de mini-Tn10 luego de irradiacrón ultravioleta depende de la expresión del sistema SOS y en particular de genes involucrados en la recombinación y reparación postreplicativa, tales como recN, ruvA y ruvB. Las mutaciones recN262, ruvA60 y ruvB52 no anularon completamente la inducción de la escisión, lo cual sugiere que varios mecanismos diferentes intervendrían en el proceso en estudio y/o que existe un cierto grado de redundancia en las actividades de los genes involucrados.

En este trabajo se estudiaron las anomalías inducidas por la diabetes materna en el embrión y en la decidua de rata en el período de organogénesis temprana, así como también el efecto de la administración de agonistas de receptores activados por proliferadores peroxisomales (PPARs) administrados en la dieta y/o de ácido fólico sobre dichas anomalías. Se encontró una disminución en el crecimiento embrionario y un incremento en las tasas de reabsorción y malformación embrionaria en las ratas diabéticas y se observaron disminuciones en los niveles de PPARδ tanto en los embriones como en las deciduas provenientes de ratas diabéticas. Además, se observaron en estos tejidos alteraciones en el metabolismo del ácido araquidónico, en la producción de especies reactivas del oxígeno y del nitrógeno y en la actividad y expresión de enzimas responsables de la remodelación tisular inducidas por la diabetes. Las dietas suplementadas con aceites ricos en agonistas de PPARs administradas a las ratas diabéticas gestantes revierten parcialmente las anomalías en el crecimiento embrionario y la tasa de malformación embrionaria. El mecanismo de acción involucra la regulación de la producción de prostaglandinas, la reducción del estrés oxidativo y nitrativo y la regulación de la actividad de las MMPs y TIMPs en el embrión y en la decidua diabética. El tratamiento consistente en la administración de ácido fólico junto a la dieta enriquecida en aceite de cártamo administrado a las ratas diabéticas logra una reversión total de las malformaciones embrionarias regulando el entorno pro-inflamatorio inducido por la diabetes y previniendo anomalías de enzimas involucradas en la remodelación de la matriz extracelular tanto en el embrión como en la decidua de rata diabética. Estos hallazgos nos permiten destacar a los tratamientos enriquecidos en aceites de oliva y cártamo (capaces de activar PPARs) y con folatos como eficaces reguladores del daño inducido por la diabetes materna, resultados de interés en la búsqueda de tratamientos plausibles de ser aplicados a la gestación humana.

En esta Tesis Doctoral se abordó el estudio de la regulación funcional del citocromo c (Cyt); una hemoproteína multifuncional que se comporta como transportador electrónico mitocondrial y como enzima lipoperoxidasa en la activación de la muerte celular. Considerando sus funciones tan disímiles es de esperar que esta proteína esté fuertemente regulada, sin embargo el Cyt no forma parte de ninguna cadena de señalización. Para estudiar los factores que determinan su función se emplearon métodos espectroscópicos, electroquímicos y computacionales. Se investigaron los cambios de la estructura y función del Cyt debidos a la presencia de concentraciones fisiológicamente relevantes de especies reactivas de nitrógeno y oxígeno (NOS y ROS) y a la formación complejos con sistemas miméticos de sus receptores naturales. En primer lugar, se investigó el efecto de la adsorción sobre superficies de distinta naturaleza química; concluyendo que el Cyt se adsorbe sobre lípidos zwiteriónicos y aumenta su reactividad frente a ROS, en particular peróxido de hidrógeno. Esta especie oxida específicamente al ligando axial del hemo del Cyt cuando se encuentra unido a estos lípidos, dando como producto una peroxidasa estable. Por otro lado, se caracterizó el cambio estructural promovido por el tratamiento del Cyt con peroxinitrito. Se observó que la nitración de una de las tirosinas desencadena su deprotonación que está acoplada a un cambio de ligando Met/Lys, resultando en un aumento de actividad peroxidasa. Finalmente, se estudió como ambas modificaciones postraduccionales afectan la interacción con la cardiolipina y determinan la actividad del Cyt como enzima lipoperoxidasa. El conjunto de los resultados obtenidos sugieren que la regulación de la función alternativa del Cyt tiene un mecanismo cuyos actores principales son las interacciones con los lípidos de la membrana y las modificaciones postraduccionales debidas al estrés nitrooxidativo.

La esquistosomiasis continúa siendo una de las enfermedades parasitarias con mayor prevalencia en el mundo. En la esquistosomiasis causada por S. mansoni, los huevos de los gusanos helmintos desencadenan un proceso de inflamación ganulomatosa hepática con desarrollo de fibrosis que esta mediado por linfocitos T CD4+ específicos para los antígenos del huevo (SEA). En el modelo murino de la enfermedad, los ratones de la cepa CBA desarrollan alta patología caracterizada por granulomas grandes y una pronunciada respuesta de linfocitos T hacia el SEA, mientras que los ratones de la cepa BL/6 desarrollan baja patología con granulomas de tamaño significativamente menor y una respuesta más atenuada de linfocitos T. En la fase aguda de la enfermedad en ambas cepas se desarrolla una respuesta de citoquinas del tipo Thl. Sin embargo, en el transcurso de la fase crónica se observa una respuesta combinada de citoquinas Thl/Th2 en los ratones de la cepa CBA, mientras que en los ratones de la cepa BL/6 la respuesta de citoquinas se polariza hacia una del tipo Th2. Los experimentos que se describen a continuación se realizaron con el fin de investigar cómo el ambiente de citoquinas, la apoptosis de los linfocitos T CD4+ y los mecanismos de coestimulación influyen el desarrollo de la inmunopatologia inducida por los huevos en el modelo murino de la infección con esquistosoma y sus consecuencias en la enfermedad. l. Se usó un modelo artificial de alta patología producido por la inmunización de ratones BL/6 con SEA en adyuvante completo de Freund (CFA) para estudiar el papel de las respuestas de citoquinas del tipo Thl vs. Th2 en el desarrollo de la inmunopatologia. Los resultados mostraron que la inmunización con SEA/CFA indujo un cambio en la producción de citoquinas hacia un perfil Thl por una población numéricamente estable de linfocitos T CD4+ específicos para el SEA que se correlacionó con una cxacerbación grave de la inmunopatologia y con la muerte prematura de los ratones. 2. Se estudiaron el papel de la apoptosis de linfocitos T CD4+ en el desarrollo de la inmunopatologia y el posible mecanismo inductor de este tipo de muerte celular comparando varios parámetros inmunológicos relacionados con los linfocitos T CD4+ entre las dos cepas de ratones polares, CBA y BL/6. Los resultados demostraron que la apoptosis de linfocitos T CD4+ de los granulomas y de los ganglios linfáticos mesentéricos (GLM) fue más elevada en la cepa de baja patología BL/6 que en la cepa de alta patología CBA como consecuencia de la falta de producción de la IL-2. El tratamiento in vivo de los ratones BL/6 con lL-2 recombinante resultó en un aumento de la patología hepática y una disminución de la apoptosis de linfocitos T CD4+. 3. Finalmente, se examinó el papel del mecanismo ICOS-B7RP-l (coestimulador inducibleproteína-l relacionada a B7) en el desarrollo de la inmunopatologia por medio del tratamiento de ratones BL/6 infectados con un anticuerpo monoclonal (AcMo) que bloquea a ICOS. Los resultados mostraron que el sistema de coestimulación ICOS-B7RP-l ayuda principalmente a controlar la producción de IFN-γ por linfocitos T específicos para el SEA y así promover un ambiente de citoquinas Th2 que lleva a limitar el daño hepático en la cepa de baja patología BL/6. Estos hallazgos contribuyen a nuestro conocimiento de los mecanismos que regulan la respuesta inmune en la esquistosomiasis murina. Ellos proveen nuevas evidencias de cómo los linfocitos T CD4+ regulan la inmunopatologia, confirmando que el establecimiento de un ambiente de citoquinas del tipo Th2 se correlaciona con la protección hacia esta infección por helmintos y que la apoptosis es un mecanismo para controlar los linfocitos T CD4+ que median la inmunopatologia. Los resultados presentados en esta tesis podrían ser utilizados para diseñar e implementar estrategias que resulten en un mejoramiento general de la inmunopatologia asociada con la enfermedad.

Mecanismos de Interacción en Proteínas Intrínsicamente Desordenadas Las Proteínas Intrínsecamente Desordenadas (IDPs, del inglés Intrinsically Disordered Pro- teins) desafían el dogma de la Biología Molecular en cuanto no poseen una estructura tridimensional definida en solución y entonces se desdibuja la relación estructura-función, al menos como ha sido definida hasta el momento. Estas proteínas no se comportan como estructuras tipo random coil, sino que uctúan entre variedad de conformaciones que dependen de cada sistema. Se ha predicho que al menos el 30% de las proteínas eucariotas son IDPs o tienen al menos un dominio que es intrínsecamente desordenado. Esto ha aumentado el interés por estas proteínas y su estudio se ha incrementado en las últimas dos décadas, mostrando que cumplen procesos celulares clave, como ser en el ciclo celular. En esta tesis se estudiaron diversos sistemas que involucran a Proteínas Intrínsecamente Desordenadas. En el sistema p53TAD/CBP estudiamos los cambios producidos en el estado unido del complejo ante modificaciones post-traduccionales y las posibles implicancias en los mecanismos de unión/plegado. En el sistema c-myb/KIX estudiamos el mecanismo de unión/plegado, y logramos caracterizar con detalle atómico al estado de transición. Finalmente, se desarrolla un potencial de interacción electrostática para un campo de fuerzas de grano grueso tipo Go, que se prueba en dos sistemas modelo de proteínas ordenadas y se analiza en los sistemas c-myb/KIX y pKID/KIX los efectos de carga sobre la reacción de unión/plegado. Para realizar el trabajo planteado se recurrió a diversas herramientas computacionales. Se utilizaron los programas GROMACS y AMBER para realizar dinámicas moleculares con campos de fuerza atomísticos y de grano grueso. Se realizaron modificaciones en el programa AMBER para utilizar campos de fuerza de grano grueso. Se utilizaron además paquetes académicos de análisis computacional y de cálculo de ΔΔG de binding para experimentos mutacionales de unión entre proteínas.