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Phaseolus vulgaris es una leguminosa de grano de amplio interés económico y social, la cual establece una interacción simbiótica con la bacteria Rhizobium etli que resulta en la formación de nódulos fijadores de nitrógeno. En esta interacción, las plantas de origen mesoamericano son noduladas preferencial y más eficientemente por cepas de rizobios que son predominantes en la misma región geográfica. Nuestro grupo de investigación ha identificado y caracterizado varios genes involucrados en esta asociación preferencial. En la presente Tesis doctoral nos planteamos como objetivo general identificar y caracterizar a nivel funcional aquellos pequeños ARNs (sARNs) que desempeñan una función en el establecimiento de esta simbiosis eficiente. Se construyeron y secuenciaron bibliotecas de sARNs de raíces inoculadas con cepas de rizobio de alta y baja eficiencia en la nodulación o con el medio de cultivo control utilizando la tecnología Illumina. Se obtuvieron en promedio 28 millones de lecturas por biblioteca, de las cuales aproximadamente el 90 % mapearon al genoma de P. vulgaris. A partir del análisis in silico, se identificaron microARNs (miARNs) conservados y nuevos que muestran cambios en su perfiles de acumulación en respuesta al rizobio. Se seleccionó un miARN conservado, el miR390b, el cual se acumula a mayores niveles en respuesta a la cepa más eficiente. En paralelo, se seleccionó y caracterizó funcionalmente un nuevo miARN diferencial, denominado miR5924, el cual es procesado a partir de la región no traducida del transcripto que codifica para Dicer-like 1 (DCL1). Los resultados obtenidos sugieren que este nuevo miARN cumple una función clave en el establecimiento de la simbiosis. Los resultados obtenidos han permitido avanzar y profundizar el conocimiento acerca de las bases moleculares de la nodulación eficiente. A su vez, los miARNs caracterizados proveen nuevos candidatos a ser utilizados en futuros programas de mejoramiento genético que contribuyan a mejorar la fijación biológica de nitrógeno y la productividad del cultivo de P. vulgaris.

Las bacteria del genero Streptomyces presentan un complejo mecanismo de diferenciación morfológica: el mismo se inicia cuando el micelio sustrato comienza a autolisarse y de el emergen hifas aéreas multinucleadas, que darán lugar al micelio aéreo. Estas hifas aéreas continuaran con la diferenciación morfológica (enrollamiento, tabicacion, etc.) para dar finalmente numerosas esporas uninucleadas. En medio líquido muchas especies de Streptomyces no esporulan, sin embargo aun mantienen la capacidad de diferenciarse fisiológicamente, dando lugar a la producción de una gama muy amplia de metabolitos secundarios (antibióticos, antihelmínticos, antifúngicos, etc.) En medios de cultivos líquidos, ya sean mínimos o ricos, S coelicolor muestra una curva de crecimiento de tipo bifásica con cuatro fases claramente diferenciables; una primera fase de crecimiento logarítmico (CR1), luego una fase de transición (T) que antecede a una segunda fase de crecimiento logarítmico (CR2)….

Escherichia coli O157:H7 es un patógeno zoonótico de importancia mundial, capaz de causar diarrea severa y síndrome urémico hemolítico (SUH) en humanos. El SUH es una enfermedad epidémica de baja tasa de incidencia en países industrializados. Sin embargo, Argentina es el país de mayor incidencia mundial, con 12-14 casos cada 100.000 en menores de 5 años y con 400 nuevos casos por año en la última década. El ganado bovino es su principal reservorio y fuente de infección. E. coli O157:H7 se caracteriza por poseer varios factores de virulencia, entre ellos, el más importante es la toxina Shiga (Stx), necesaria para el desarrollo del SUH, que puede ser de tipo 1 y/o de tipo 2, y esta última a su vez de varios subtipos. Otro de sus factores de virulencia, es el Sistema de Secreción de Tipo Tres (SSTT), codificado en la isla de patogenicidad LEE. El SSTT trasloca factores de virulencia en las células epiteliales; llamados efectores, produciendo una lesión histopatológica conocida como attaching and effacing, caracterizada por la íntima adherencia al enterocito y la eliminación de las microvellosidades intestinales. Otros factores de virulencia se encuentran en el plásmido pO157; pero de sus 100 genes putativos, solo 19 han sido caracterizados. Diversos estudios epidemiológicos sugieren una correlación entre el pO157 y la progresión de la diarrea al SUH. Por SNPs typing se han definido nueve clados de E. coli O157:H7, siendo las cepas de clados 6 y 8 las más frecuentemente asociadas a diarrea severa y SUH. La mayoría de las cepas de clado 8 poseen dos subtipos de Stx2; Stx2a y Stx2c, con una mayor expresión de Stx2 que otros clados, lo que contribuye a la hipervirulencia del clado 8. Se ha observado que las cepas de clado 8 son altamente predominantes, en el ganado y en los casos de SUH en Argentina. En este trabajo, se estudiaron ocho aislamientos seleccionados al azar de E. coli O157:H7 procedentes del ganado de Argentina, así como dos cepas de casos clínicos humanos. Fue posible demostrar, por el análisis de 23 de SNPs que 4 cepas aisladas de bovinos fueron clasificadas como clado 8 así como también 2 cepas aisladas de humanos, mientras que otras dos cepas bovinas fueron clasificadas como clado 6, también descripto como hipervirulento. Luego de clasificarlas se procedió a evaluar la patogenicidad en relación a la producción de toxina Shiga, lisis de glóbulos rojos in vitro dependiente del SSTT, ensayos de adherencia en cultivos celulares, inhibición de la absorción normal de agua en explantos de colon humano y análisis de morbilidad y letalidad en ratones BALB/c. Cuatro de las cepas bovinas mostraron una alta producción de Stx y una de ellas, la cepa 7.1 Anguil, mostro alta actividad Verocitotóxica en cultivos celulares y una fuerte inhibición de la normal absorción de agua en explantos de colon humano, en relación a la cepa E. coli O157:H7 EDL933. Dos cepas, Rafaela II y 7.1 Anguil, presentaron altos niveles de lisis en eritrocitos, altos niveles de producción de Stx2 y fueron asociadas con una alta letalidad y morbilidad en el modelo murino ensayado. Por los resultados obtenidos en los ensayos de virulencia realizados tanto in vitro, ex vivo como in vivo, fueron seleccionadas la cepa Rafaela II (clado 8, bovina) y la cepa 7.1 Anguil (clado 6, bovina), como candidatas para el posterior análisis genómico y proteómico comparativo, con la cepa EDL933 (cepa de referencia, clado 3). Fue realizada la secuenciación de los genomas de estas cepas. En ambas se detectó el plásmido pO157, y en la cepa 7.1 Anguil se detectó un plásmido adicional con alta homología con el plásmido pChi7122-3 de la cepa aviar APEC E. coli 7122 (O78:K80:H9). Fueron predichos los genes de cada cepa, obteniéndose 5,643 para 7.1 Anguil y 5,439 para la cepa Rafaela II, respectivamente. Esta información fue utilizada para comparar los contenidos de los genes, y para la obtención de genes compartidos y únicos, utilizando las cepas TW14359 y EDL933 como referencias. La comparación de los genes compartidos mostró una relación filogenética de la cepa Rafaela II, estrechamente relacionada a la cepa de referencia TW14359, ambas clado 8. Estos resultados son consistentes con el análisis de SNPs previamente realizado. El análisis proteómico cuantitativo, fue centrado en las proteínas sobreexpresadas que podrían estar relacionadas con la virulencia. Las proteínas que se sobreexpresaron en E. coli O157:H7 Rafaela II fueron, la proteína del curli CsgC, un activador transcripcional (PchE), las proteínas de fagos, Stx2, FlgM y FlgD, CheY, CheW, una dienelactona hidrolasa y la proteasa EspP, estas últimas dos codificadas en el plásmido pO157, entre otras. Para la cepa 7.1 Anguil, se detectó una alta sobreexpresión de las proteínas de fagos, sobre todo las codificadas en el fago Stx2a, incluyendo Stx2; también una flagelina y la proteasa TagA, EDL933_p0016, dienelactona hidrolasa, y hemolisina HlyA, cuyas últimas cuatro están codificadas en el pO157. Estas proteínas fueron detectadas como sobreexpresadas entre 4 y 16 veces más en las cepas Rafaela II y 7.1 Anguil comparadas con EDL933. Luego se seleccionaron 12 proteínas, por los mismos criterios de búsqueda y selección, para su validación por RTq-PCR. Se demostró un aumento en la transcripción en 10 de los 12 genes analizados. De este modo, la concordancia entre los resultados de la proteómica y los resultados de RTq-PCR fue aceptable. De esas 10 proteínas, se eligieron seis como candidatas a la obtención de mutantes, poniendo especial énfasis en aquellas proteínas poco estudiadas, posibles factores de virulencia y sobreexpresadas en ambas cepas y/o ambas fracciones. Así fueron seleccionados el activador transcripcional PchE presente en clado 8; la hemolisina HlyA; la proteasa TagA, la proteína de fago EDL1403, con el mayor fold change (16,45) detectado en este trabajo y con un dominio de adaptación de respuesta sensorial quinasa; la proteasa EspP, sobreexpresada en ambas cepas; y Stx2a, uno de los principales factores de virulencia de E. coli O157:H7, sobreexpresada en ambas cepas. Se incluyó a la cepa 125/99 para la mutación de Stx2, por ser clado 8, por poseer una sola copia del gen stx2, no poseer stx1 y por estar incluida entre las cepas más virulentas en los ensayos realizados. Se obtuvieron mutantes para el gen stx2 en la cepa 125/99 y se analizó su rol tanto en el ensayo de citotoxicidad como en el de patogenicidad en el modelo murino. Los resultados obtenidos demuestran que la mutación de stx2 elimina la expresión de Stx2, provocando la anulación del fenotipo asociado, la muerte celular por apoptosis observada en células Vero. En ratones BALB/c se observó que la mutación de stx2 elimina la expresión de Stx2, provocando la disminución de la patogenicidad observada en ratones, sin registrarse letalidad en los animales inoculados con la cepa 125/99Δstx2, Debido a la dificultad en la obtención de mutantes en los otros genes para las cepas bovinas, se implementó la eliminación del plásmido pO157, ya que codifica para tres de los genes candidatos, hlyA, espP y tagA. Se obtuvieron mutantes para las cepas Rafaela II y 7.1 Anguil, para la eliminación del pO157 y se analizó su rol en la virulencia en el modelo murino de infección. Los resultados obtenidos muestran que la eliminación del plásmido pO157 disminuye la virulencia en la cepa 7.1 Anguil provocando la anulación del fenotipo observado de morbilidad y letalidad en BALB/c, ya que no se registró letalidad en el modelo murino con la cepa 7.1 Anguil ΔpO157. Sin embargo, en la cepa Rafaela II, la eliminación de pO157 no disminuyó su virulencia, ya que los valores de patogenicidad y letalidad observados en BALB/c fueron los mismos tanto para la cepa Rafaela II como para la cepa Rafaela IIΔpO157. Estos resultados nos permitieron demostrar una alta virulencia en las cepas de clado 8 y clado 6 aisladas de bovinos argentinos y concluir en consecuencia que la circulación de tales cepas en el ganado puede contribuir en parte a la alta incidencia de SUH en Argentina. Este trabajo nos permite asociar los resultados de la proteómica cuantitativa con los hallazgos previos de virulencia y patogenicidad en modelos in vitro, ex vivo y en el modelo in vivo, en el ratón. Comprender y analizar la medida en que estos y otros factores contribuyen a la virulencia completa de E. coli O157:H7 clado 8 y clado 6 requerirá de mayores y futuras investigaciones. Estos avances, apoyados en estudios bioinfomáticos, nos han permitido identificar nuevos y potenciales factores de virulencia que permitirán comprender características de la virulencia de E. coli O157:H7 en general y de los clados hipervirulentos 6 y 8 en particular. Estos resultados pueden proporcionar nuevas perspectivas en los mecanismos de patogénesis de E. coli O157:H7.

Las drogas utilizadas para el tratamiento de la infección por T. cruzi, agente etiológico de la enfermedad de Chagas, presentan múltiples efectos colaterales y una eficacia variable en las etapas indeterminada y crónica de la infección. Por otro lado, no existe una vacuna para esta parasitosis que impida la transmisión y/o la enfermedad. Teniendo en cuenta la necesidad de la obtención de buenos inmunógenos y nuevas drogas tripanocidas más efectivas y seguras, el objetivo del Trabajo de Tesis fue definir nuevos posibles blancos para el control de la transmisión de la infección por T. cruzi a partir de la identificación de proteínas en este parásito relacionadas con glutatión-S-transferasas (GSTs)de otros organismos. la selección de las GSTs para dirigir esta búsqueda se basó en la participación de esta enzima, cuyos genes aun no fueron identificados en T. cruzi, en un metabolismo divergente entre el parásito y su hospedero mamífero y en una respuesta inmune protectiva contra la infección experimental por este parásito. En la primera parte del trabajo, que se denominó Parte A, se planteó la identificación de secuencias de genes funcionales resultantes del Proyecto Genoma de T. cruzi con homología con GSTs y su posterior caracterización a fin de determinar si su producto puede postularse como posible blanco de quimioterapia. Como resultado de esta búsqueda se identificó un nuevo gen de copia única, denominado TCGRX,cuyo producto presentó el patrón aminoacídico completo de glutarredoxinas (ers) y similitud con ers y GSl‘sde diversos organismos pero no con enzimas de mamíferos. El modelado molecular de una porción de la TCGRX sobre la Grx 3 de Escherichia coli sugiere que esta proteína tendría la estructura típica de ambas familias. En la segunda parte del trabajo, (Parte B),teniendo en cuenta la existencia en T. cruzi de antígenos de reactividad cruzada con la GST de 26 kDa de Schistosoma japonicum (GSTsj) y que las GSTs son enzimas muy conservadas en su estructura tridimensional se planteó la identificación de estos antígenos utilizando como herramienta un suero anti-GSTsj y su posterior caracterización y evaluación en protocolos de inmunoprotección. Por cromatografía de inmunoafinidad con el suero anti-GSTsj se purificó una fracción a partir de epimatlgotes de T. cruzi, denominada PHGST, que presentó actividad de GST.Por otro lado, el rastreo de una biblioteca genómica de T. cruzi con este antisuero dio como resultado la selección de 38 clones que codificaron para antígenos de la familia Tc13 de la superfamilia de antígenos de superficie de tripomastigotes. la identificación de un miembro de esta familia en la cepa Tulahuén del parásito, denominado PHGST#5, permitió su comparación con los ya conocidos en cuanto a su estructura aminoacídica. Mediante la hibridación de cromosomas separados y transferidos a membranas, se determinó que los genes Tc13 se localizan principalmente en el cromosoma III y su homólogo. Las funciones inmunomoduladoras descriptas para ciertas proteínas de la superfamilia de antígenos de superficie y su participación en el desarrollo de una respuesta inmune protectiva, sustentó la evaluación del antígeno PHGST#5 en experimentos de inmunoprotección en ratones de la cepa BALB/c. La inmunización plasmídica con PHGSTT#5 no indujo una respuesta humoral específica y la respuesta celular, evaluada por efecto de hipersensibilidad retardada (DTH) frente a la inoculación con el antígeno recombinante, fue muy leve; mientras que, la inmunización con la proteína recombinante MBP-PHGST#5 indujo tanto una respuesta humoral como celular, evaluada por DTH. La inmunización plasmídica de PHGST#5, así como la inmunización con MPB-PHGST#5 produjeron una disminución significativa de la parasitemia luego del desafío con formas infectantes del parásito. La inmunización plasmídica con PHGST#5,además disminuyó el daño y el parasitismo tisular luego del desafío. Por lo tanto, la selección de las GSTs para dirigir la definición de nuevos posibles blancos para el control de la transmisión de la infección por T. cruzi permitió identificar el gen TCGRX,cuyo producto por no poseer contraparte en el mamífero, luego de la caracterización bioquímica podría postularse como posible blanco para el diseño de drogas tripanocidas e identificar el antígeno PHGST#5, un nuevo miembro de la familia Tc13 con posibles epitopes compartidos con la GSTsj, y definir su efecto inmunoprotector tanto de la infección y como de la patología chagásica.

En este trabajo se estudiaron genes posiblemente involucrados en los procesos de señalización relacionados con la tuberización. Se identificaron los genes StCDPK1, StCDPK2 y StCDPK3, que son los primeros miembros de la familia CDPK de Solanum tuberosum. En particular se caracterizó el gen StCDPK1 que codifica para una quinasa activa con todas las propiedades de las CDPKs. Se demostró que StCDPK1 se miristoíla in vitro y que su localización subcelular depende de miristoilación y palmitoilación. Por otra parte se determinó que existe una fuerte correlación entre la expresión de StCDPK1 y el engrosamiento del estolón. Mediante ensayos de hibridación in situ se observó que StCDPK1 se expresa en el ápice de estolones inducidos a tuberizar. También se determinó que StCDPK3 se expresa diferencialmente en estolones tempranos. En ensayos de Western blot se identificaron dos CDPKs, de 55 y 60 kDa, cuya expresión correlaciona con la expresión de los genes StCDPK3 y StCDPK1 respectivamente. Se determinó que la actividad CDPK asociada a estolones tempranos y la actividad CDPK asociada a estolones inducidos poseen diferente especificidad de sustrato y distinta localización subcelular. Por otra parte se estudió el efecto de la sacarosa sobre la tuberización y sobre la expresión de StCDPK1. Se determinó la importancia de las actividades quinasa durante la inducción de la tuberización inducida por sacarosa y se demostró que este azúcar induce la expresión de StCDPK1 mediante un mecanismo que involucra la actividad de fosfatasas de la familia PP1/PP2A. Además, se identificó el gen StPP2A1c que codifica para la primer fosfatasa de la familia PP2A de Solanum tuberosum. Se determinó que el gen StPP2A1c se expresa diferencialmente durante la tuberización y, mediante ensayos de complementación en levaduras, se demostró que este gen codifica para una fosfatasa funcional.

Los virus en frutilla son responsables de importantes pérdidas del rendimiento y calidad de los frutos. En Argentina se ha detectado la presencia de Strawberry mild yellow edge virus (SMYEV), Strawberry mottle virus (SMoV) y Strawberry crinkle virus (SCV). Entre 2015 y 2016 en los laboratorios del IPAVE-INTA se obtuvieron fragmentos genómicos correspondientes a un polerovirus infectando frutilla. Simultáneamente se reportó en Canadá a Strawberry polerovirus 1 (SPV1). El objetivo de esta tesis fue identificar y caracterizar específica e intraespecíficamente el nuevo virus detectado en el país, y evaluar aspectos epidemiológicos que permitan dilucidar la importancia del patógeno. Los objetivos específicos fueron: 1) Identificar y caracterizar el posible polerovirus detectado en frutilla de Argentina. 2) Implementar un sistema de diagnóstico capaz de detectar el virus en cultivo. 3) Obtener la secuencia genómica completa de virus. 4) Detectar y analizar la variabilidad específica e intraespecífica del polerovirus y su filogenia. 5) Implementar un sistema de diagnóstico sensible que permita el análisis simultáneo de los virus. 6) Evaluar aspectos epidemiológicos que contribuyan a determinar la importancia y distribución del SPV1 en zonas productoras de frutilla en relación a otros virus presentes. Los resultados confirmaron la presencia de SPV1 en Argentina, se implementó un sistema para su detección y se transmitió a plantas de Fragaria vesca var. Semperflorens ?Alpina?. Se obtuvo el 99,5% de la secuencia genómica del virus y su análisis filogenético permitió detectar que SPV1 forma un cluster diferente en el género Polerovirus. Se obtuvieron 8 secuencias del gen de la cubierta proteica del virus y se detectaron diferencias genómicas entre los aislamientos reportados, relacionadas con el origen de plantas madres. Se determinó la incidencia y prevalencia del SPV1 en las principales regiones productoras del país y su relación con los parámetros climáticos, regiones, cultivares, síntomas y su relación con SMYEV, SMoV y SCV, para los cuales se implementó un RT-PCR Multiplex para su detección. El SPV1 fue el tercer virus más frecuente de frutilla en Argentina y se relacionó de manera positiva con la región de Coronda y las precipitaciones

Los Sistemas de Secreción de Proteínas tipo I (T1SS) permiten a una amplia variedad de bacterias Gram-negativas secretar proteínas al medio extracelular; estos sistemas participan en varias respuestas fisiológicas como la adaptación al medio ambiente y contribuyen a la virulencia en diversos patógenos. Los T1SS están formados por un componente de membrana interna (ABC) un componente de fusión de membrana (MFP) y un componente de membrana externa (OMF). Los genes de los dos primeros (e inclusive el OMP) suelen estar formando un operón y pueden estar adyacentes a los genes que codifican sus proteínas sustrato. En la bacteria simbionte Rhizobium leguminosarum, el T1SS, PrsDE, es responsable de la secreción de diversas proteínas que participan en la supervivencia del rizobio en el suelo, favoreciendo la formación de estructuras comunitarias denominadas biofilms. A. tumefaciens es un fitopatógeno de alto interés agronómico y biotecnológico. A pesar de la relevancia que los TISS muestran tener en diversas bacterias Gram negativas, hasta la fecha no se ha avanzado en el estudio y la relevancia fisiológica de estos sistemas de secreción en este fitopatógeno. En este trabajo, se aisló a partir de una biblioteca genómica proveniente de A. tumefaciens el cósmido pIJ7760 que fue capaz complementar el fenotipo de secreción de cepas mutantes en el sistema PrsDE de R. leguminosarum. Se determinó que dicho cósmido alberga los genes de un sistema homólogo al que se denominó AspD-AspE, Agrobacterium secretion protein D and E) formado por un componente ABC (dominio de unión a ATP) y otro MFP (proteína de fusión de membranas), respectivamente. Este sistema fue responsable de la secreción de una proteína, a la que se denominó Hla, de función desconocida codificada rio arriba de aspDE. El análisis de las secuencias del cósmido permitió identificar, río arriba de hla, genes cuyo productos presentan alta similitud de secuencia aminoacídica con receptores de hemo (denominado hlaR) y a factores sigma y anti sigma (denominados hlaS y hlaI). Las zonas promotoras de ambos loci presentaron secuencias consenso de reconocimiento del regulador RirA que responde a la concentración de hierro extracelular. Rio arriba de estos genes se identificó un probable sistema ABC de captación de hemo (denominado ahuUVTB) que presenta en su región promotora secuencias de reconocimiento de RirA y del regulador del metabolismo del hemo IrrA. El análisis de las proteínas presentes en el medio extracelular en diversas condiciones de cultivo y nutricionales permitió reflejar un complejo control y una regulación diferencial de la secreción de la proteína Hla en el hospedador sustituto R. leguminosarum A34 y A. tumefaciens C58. Se observó una muy elevada secreción de Hla en el hospedador sustituto R. leguminosarum A34 en medios ricos de cultivo. Se determinó que esta desregulación se debe a que la cepa de A34 contiene una mutación ancestral en algún regulador desconocido hasta la fecha que provoca un fenotipo pleiotrópico. Este regulador es codificado en el plásmido simbiótico pRL1JI y regula, la secreción de Hla. El estudio de la regulación en el pariente heterólogo R. leguminosarum mostró que la secreción de Hla también se ve reprimida por los reguladores globales de respuesta a hierro descriptos en Rhizobiaceae, RirA e IrrA. Por otro lado, el agregado de hemoglobina como fuente de hemo extracelular, indujo la secreción de Hla como proteína mayoritaria en el contexto heterólogo de Rhizobium. El análisis del contexto genético de hla mostró que este gen está incluido en un locus sinténico a otros clusters de genes involucrados en la captación de hemo a través de hemóforos, aunque Hla no presenta similitud de secuencia aminoacídica con hemóforos caracterizados. Sin embargo, la purificación por columna de afinidad de hemina mostró que Hla presenta capacidad de unir hemina y sería el primer hemóforo descripto en la familia Rhizobiaceae. Mediante mutagénesis dirigida se generó una mutante de secreción en aspD de A. tumefaciens C58. Los fenotipos asociados a esta mutante mostraron un carácter pleiotrópico, tanto la autoagregación bacteriana, la adhesión a soporte abiótico y la motilidad en agar se vieron afectadas. En A. tumefaciens la secreción de Hla respondió principalmente a condiciones microóxicas/anóxicas, además de a la ausencia de hierro y presencia de hemo. Interesantemente, la mutante deficiente en la secreción de Hla fue incapaz de inducir la formación de tumores en Kalanchoe sp. En conjunto, los resultados presentados en este trabajo sugieren que el T1SS AspDE, participaría en la captación de hemo extracelular a través de la secreción de un nuevo hemóforo (Hla) probablemente en condiciones microaerófilas y de bajo hierro presentes en el contexto del tumor.

El proceso de senescencia en plantas es un mecanismo complejo controlado por múltiples variables genéticas y ambientales que condicionan el rendimiento de los cultivos. En el caso del girasol, el segundo cultivo oleaginoso en importancia económica para nuestro país, se trata de un proceso con impacto económico que interviene en la brecha existente entre el rendimiento potencial y el rendimiento real observado, por la mayor o menor oportunidad de las plantas para mantener el sistema fotosintético activo durante periodos prolongados. Los parámetros visuales resultan tardíos para evaluar el desencadenamiento y posterior tasa de evolución de la senescencia foliar. La clorosis, la variación en el contenido de clorofila así como también la necrosis de las hojas, son detectables mucho tiempo después que la señal iniciadora de la senescencia ha sido activada. Este trabajo tuvo como objetivo general el estudio del proceso de senescencia en girasol a través de distintos niveles de organización: ecofisiológico, metabolómico, transcriptómico, culminando con la integración de los diversos enfoques ómicos mediante una aproximación de biología de sistemas, con el objetivo final de identificar potenciales biomarcadores asociados al proceso de senescencia en girasol. Se condujeron distintos ensayos que fueron realizados tanto a campo, en la Estación Experimental INTA-Balcarce como en invernáculo, en el Instituto de Biotecnología INTA Castelar, para evaluar el progreso del proceso de senescencia tanto en condiciones naturales como controladas. Asimismo se evaluó la respuesta frente a condiciones de restricción hídrica impuesta en distintas etapas del desarrollo de las plantas. Se realizaron evaluaciones ecofisiológicas relacionadas con el avance de la senescencia, a través de la medición de variables como contenido de clorofila, azúcares solubles y nitrógeno total de hojas, mediciones a campo de área foliar verde, SPAD, intercepción de la radiación y materia seca por órganos, mediante las cuales fue posible evaluar la evolución del proceso en las diferentes hojas, en condiciones naturales de cultivo. Adicionalmente, se llevó adelante un análisis de los perfiles metabólicos utilizando técnicas de cromatografía gaseosa acoplada a espectrometría de masa (GC-MS) que permitió la optimización del protocolo de la extracción de metabolitos de hojas de girasol, y la detección de aproximadamente 60 metabolitos primarios incluyendo distintos aminoácidos, ácidos orgánicos, azúcares y azucares alcohol. Asimismo se optimizó la tecnología de cromatografía iónica, mediante la cual se cuantificaron diferentes nutrientes iónicos relevantes durante el proceso de senescencia tales como nitratos, sulfatos, fosfatos entre otros. En forma paralela se llevó a cabo un estudio a nivel transcriptómico considerando tanto estrategias de genes candidato, mediante la búsqueda de secuencias putativamente ortólogas a girasol asociadas a senescencia en especies modelo, como el análisis concertado de expresión génica utilizando una micromatriz de oligonucleótidos desarrollada para esta especie. A partir del análisis estadístico de los datos obtenidos con la micromatriz, se realizó un análisis de enriquecimiento funcional sobre el total de los unigenes que mostraron un comportamiento diferencial y significativo para las distintas condiciones evaluadas, utilizando la metodología de Gene Set Analysis basado en modelos de regresión logística. De este modo se identificaron las diferentes categorías funcionales asociadas a bloques de genes con un patrón de expresión similar. La búsqueda de genes candidato se profundizó con la consulta de bases de datos de genes asociados a senescencia (SAGs del inglés: Senescence Associated Genes), así como también sobre aquellos genes con dominios de factores de transcripción como posibles desencadenantes de las cascadas de señalización de este proceso. Por último, se realizó la integración de los datos obtenidos a partir de distintas estrategias (fisiológicas, metabolómicas y transcriptómicas) utilizando una aproximación basada en biología de sistemas con el objetivo de identificar biomarcadores asociados a la senescencia en girasol. Para este fin se usaron los programas Paintomics 2.0 (http://www.paintomics.org) (García-Alcalde y col 2011) y Mapman (http://mapman.gabipd.org/) (Thimm y col 2004) que fueron adaptados para su uso con datos provenientes de esta especie. Los resultados obtenidos a partir de la integración de datos mostraron una correspondencia entre los cambios detectados a través de los diferentes niveles analizados. A partir de una visión general del metabolismo celular se pudo observar una disminución de la actividad fotosintética y el crecimiento celular, y un incremento en el metabolismo de sacarosa, ácidos grasos, nucleótidos y aminoácidos así como también en aquellos procesos relacionados al reciclado de nutrientes. En particular, los factores de transcripción con dominios NAC, AP2- EREBP y MYB mostraron altos niveles de expresión y mayores niveles de correlación y co-expresión, puntualizándolos como importantes biomarcadores candidatos para la ejecución del programa de senescencia en girasol. Los resultados de este trabajo permitieron contribuir al conocimiento de los mecanismos moleculares involucrados en el desencadenamiento y evolución del proceso de senescencia en girasol, así como a la selección robusta de genes involucrados en las distintas etapas del desarrollo del proceso, especialmente factores de transcripción. Estos últimos fundamentalmente, podrán ser validados a futuro sobre materiales de mejora para ser incorporados a los programas de mejoramiento asistido de este cultivo de gran importancia agronómica para nuestro país. Finalmente, las estrategias, metodologías, herramientas y conocimientos desarrollados en esta tesis contribuyen al desarrollo del cultivo y promueven la adopción de la genómica y la post-genómica en las distintas etapas del mejoramiento de girasol.

Los papilomavirus (PV) son virus epiteliotrópicos con genoma de ADN doble hebra circular, sin envoltura y muy heterogéneos. Al momento se han descripto más de 200 tipos en humanos (HPV): 25% asociados a infecciones de mucosas y 75% a infecciones de piel. Los HPV se distribuyen en 5 géneros en base a la identidad nucleotídica del gen L1. Los HPV mucosotrópicos se agrupan principalmente en el género Alfa PV y son causantes de patologías benignas y malignas de la mucosa anogenital y orofaríngea. En contraste, los HPV cutaneotrópicos se distribuyen en los géneros Alfa, Beta, Gama, Mu y Nu PV y la evidencia científica es inconcluyente sobre su rol en la carcinogénesis cutánea. Dada la gran diversidad genética de estos virus y las distintas interacciones que establecen con el hospedero, es necesario caracterizar la complejidad de la infección por HPV en distintos epitelios para adoptar las medidas de prevención y tratamiento de las enfermedades producidas por estos virus. El objetivo general de este trabajo de tesis incluyó avanzar en el conocimiento de la familia Papillomaviridae mediante la identificación y caracterización de la infección por HPV en epitelios cutáneos y mucosos en nuestra región para contribuir a la taxonomía y a la vigilancia epidemiológica a nivel molecular. Para ello se abordaron los siguientes objetivos específicos: 1) Se realizó un estudio longitudinal y descriptivo para identificar los tipos de HPV mucososotrópicos que circulan en cérvix en una población de mujeres no vacunadas con diagnóstico de patología cervical que concurrieron al Hospital Escuela “Eva Perón” de la ciudad de Baigorria, provincia de Santa Fe (n=115). Las muestras se analizaron utilizando dos sistemas de amplificación de HPV en forma conjunta, ambos desarrollados en el laboratorio: el L1HPVPCR 16.4.1, que utiliza los cebadores de referencia MY09/11 y ha sido definido competente para la identificación de 15 tipos mucosos según los criterios de la WHO HPV LabNet, y el sistema de cebadores CUT, con probada capacidad para amplificar tipos de HPV que infectan epitelios mucosos y cutáneos. La prevalencia de infección en esta población fue del 85% y los tipos más frecuentes fueron HPV16 (25%) y HPV31 (13%). Sucesivamente realizó un estudio de persistencia de la infección por HPV en 68 mujeres de esta población durante un periodo promedio de 24 meses. De las 45 mujeres que recibieron tratamiento expectante (observación de la evolución de la lesión semestralmente), 29% erradicó la infección, 29% se infectó con tipos diferentes al de la muestra de ingreso, 38% tuvo infección viral persistente y 4% fue HPV-negativa durante el estudio. Entre las 23 que recibieron tratamiento quirúrgico, el 48% erradicó la infección, 35% se infectó con tipos diferentes y 17% tuvo infección viral persistente. Los tipos persistentes más frecuentes en ambos grupos fueron HPV16 y HPV31. En cuanto a la evolución clínica, la mayoría de las mujeres evolucionaron favorablemente al final de estudio (100% contratamiento quirúrgico, 62% con tratamiento expectante). Estos resultados aportan nueva información sobre la prevalencia y persistencia de HPV en mujeres no vacunadas con diagnóstico de patología cervical del sur de la provincia de Santa Fe y sienta las bases para evaluar a futuro el impacto de la vacunación masiva contra HPV. 2) Teniendo en cuenta que la radiación solar se ha relacionado con la infección por HPV y que Argentina se encuentra en una región de alto riesgo de exposición a UV por el paso del agujero de ozono entre Septiembre y Noviembre, se realizó un estudio longitudinal y descriptivo para analizar la epidemiología de la infección por HPV en piel sana expuesta a radiación solar de 78 individuos inmunocompetentes en 3 estaciones climáticas durante 1 año. Las muestras se analizaron con dos sistemas de amplificación de HPV en forma conjunta: el sistema CUT y el ensayo FAP considerado de referencia para el análisis de HPV en piel. La prevalencia de infección en primavera fue mayor que en verano e invierno (53.9% vs 44.9% y 47.4% respectivamente), coincidiendo con el paso del agujero de ozono. El 29% de los voluntarios tuvieron infecciones persistentes con al menos un tipo de HPV, siendo los miembros del género Beta PV los tipos más persistentes, específicamente el HPV5 (Beta 1). La mayor edad de los voluntarios se asoció significativamente con mayor persistencia de la infección por HPV (p=0,019). Estos resultados sugieren que la radiación solar influye en la adquisición de la infección por HPV en piel y que estos virus persisten en los individuos por un periodo de al menos 1 año sin inducir daños en el tejido. 3) A fin de proveer nuevos virus desde la región, se caracterizaron los genomas completos de 3 tipos nuevos identificados en piel sana expuesta a radiación solar utilizando una estrategia altamente sensible para la amplificación de genomas circulares desarrollada en el laboratorio. Los nuevos tipos caracterizados son HPV 205 (Gama 1), HPV210 (Gama 12) HPV209 (Beta 2). Sucesivamente exploramos la recombinación como posible fuerza evolutiva en el género Gama PV utilizando una base de datos actualizada y el programa RDP4.1. Se identificaron 2 eventos putativos de recombinación, ambos ubicados en el ORF E1, que cumplieron con el criterio de inclusión: un evento intra-especie entre miembros de la especie Gama 7 (recombinante: HPV170, parental mayor: HPV109, parental menor: HPV149) y un evento inter-especie que se detectó en todos los tipos agrupados en la especie Gama 8 (parental mayor: Gama 24, parental menor: especie Gama 11). Estos hallazgos se confirmaron por análisis de incongruencia filogenética. Estos aportes contribuyen a completar la taxonomía y proveen nuevas evidencias para comprender mejor la historia evolutiva del género Gama PV. En conclusión, los resultados obtenidos en conjunto contribuyen a expandir el conocimiento sobre la familia Papillomaviridae, información esencial para dilucidar el rol que cumplen las infecciones por estos virus en distintos epitelios.

El uso de cepas inoculantes -tanto salvajes como recombinantes- requiere controlar la capacidad simbiótica de los rizobios así como los riesgos derivados de su liberación en suelos de cultivo (estudios de la evaluación de riesgos, risk assesment). Dicho control resulta más importante si se considera el creciente desarrollo y la aparición en el mercado de nuevas cepas recombinantes. En particular, prevenir la diseminación de información genética desde rizobios introducidos al suelo en forma masiva es importante para preservar la estructura genética de las poblaciones salvajes. Eventos de transferencia génica de alta frecuencia desde las cepas introducidas puede conducir a la aparición de nuevos genotipos bacterianos cuya dinámica poblacional y propiedades simbióticas a mediano y largo plazo son difíciles de predecir. En general, es deseable que las cepas utilizadas como inoculantes por sus propiedades simbióticas, se autolimiten a corto y mediano plazo para ayudar a la conservación de la biodiversidad natural. Sobre la misma base de conservación de genotipos naturales es que deben tratar de minimizarse los eventos de transfereneia génica desde las bacterias que, útiles desde el punto de vista agropecuario, sean introducidas a campos de cultivo en forma masiva. Será por tanto importante el desarrollo de estudios de base que permitan a mediano plazo el desarrollo de herramientas genético-moleculares que permitan a mediano plazo mejorar el control de riesgo asociado a la transferencia de germoplasma desde rizobios inoculados. Objetivo General. - Caracterización funcional y molecular de sistemas genéticos involucrados en la transfereneia de plásmidos por conjugación en la bacteria fijadora de nitrógeno y simbionte de alfalfa, Sinorhizobium meliloti. Objetivos específicos, - Búsqueda y aislamiento de plásmidos crípticos movilizables en cepas locales de S. meliloti. - Evaluación de la proporción de cepas de S. meliloti que son portadoras de plásmidos movilizables y/o autotransmisibles. - Estudios de complementación funcional cruzada de funciones helper entre diferentes plásmidos crípticos (Fenómenos de re-movilización y retrotransferencia). - Identificación y caracterización molecular de genes de movilización en plásmidos indígenas