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Escherichia coli verotoxigénico (VTEC) representa un grupo muy importante de patógenos emergentes, causante de diarrea y severas enfermedades en seres humanos, tales como colitis hemorrágica o síndrome urémico hemolítico (SUH). El SUH afecta mayormente a niños menores de 5 años, es la principal causa de insuficiencia renal aguda, una de las más importantes de insuficiencia renal crónica y puede causar la muerte. El bovino es el principal reservorio y los alimentos contaminados, la principal vía de contagio al hombre. Argentina posee la mayor incidencia a nivel mundial de SUH y una alta prevalencia de VTEC en bovinos y alimentos derivados. El serotipo O157:H7 es el mayormente involucrado en los casos de enfermedad en el mundo, y en Argentina, también el más frecuentemente asociado al SUH. Sin embargo, no todos los aislamientos de O157:H7 tienen la misma capacidad de infectar y de causar enfermedad en el hombre. Estudios filogenéticos determinaron que las cepas O157:H7 integran subpoblaciones de dispersión mundial, las cuales diferirían en relación a su asociación con enfermedad. A partir del análisis comparativo de genomas, se han descripto varios métodos de subtipificación molecular, los cuales analizan distintas regiones y tipos de variación en el genoma. La combinación de los datos obtenidos por esta variedad de metodologías puede ofrecer una visión más amplia y robusta sobre la estructura poblacional y la virulencia de este serotipo. En este contexto se plantearon como objetivos conocer la diversidad genética de VTEC O157:H7 de Argentina, en particular de aquellas cepas que están circulando en la región pampeana, e identificar subtipos asociados a patogenicidad y virulencia. Para ello, se usaron distintos métodos de subtipificación molecular, tales como polimorfismos específicos de linaje (LSPA6), polimorfismos de nucleótido simple (SNP) (rhsA 3468 C>G y tir 255 T>A), análisis de múltiples loci VNTR (MLVA), y determinación de filogrupos. Por otro lado se analizó la presencia de genes relacionados con virulencia, tales como genes que codifican factores putativos de virulencia (FPV), genes codificados en plásmidos, de genes que codifican efectores no codificados en LEE (nle), presentes en islas de patogenicidad y genes que codifican factores de adherencia. Como complemento, se evaluó también, la actividad citotóxica de los aislamientos. El 98 % de ellos pertenecieron al linaje I/II (2 % al linaje II). El 100 % presentó el alelo del SNP (8_rhsA) correspondiente al clado 8. Un alto porcentaje de aislamientos presentó en alelo tir 255 T>A T, asociado a hipervirulencia, y fue asignado al filogrupo E. Según el MLVA se encontró una amplia diversidad genética. Todos los aislamientos mostraron el perfil plasmídico ehxA-espP-katP-stcE y poseyeron los genes ehaA, elfA, iha y lpfA variantes lpfA1-3, lpfA2-2 y ECSP_0242. Las frecuencias de los genes ECSP fueron 95 % ECSP_2687, 88 % ECSP_3286, 86 % ECSP_3620, 53 % ECSP_2870/2872 y 44 % ECSP_1733. Los aislamientos se agruparon en once perfiles nle, el 46 % fueron positivos para todos los genes nle, mientras que los aislamientos restantes, excepto dos, carecieron de nleF mostrando la OI-71 incompleta. Todas las cepas O157:H7, excepto el aislamiento identificado como linaje II, fueron citotóxicas en células Vero. Los resultados indican que las cepas de la región pampeana de Argentina son un grupo filogenéticamente homogéneo que presenta diversidad genética en relación a sus perfiles MLVA y de genes nle. La pertenencia de los aislamientos al clado hipervirulento 8 y al linaje I/II, la alta prevalencia del alelo tir 255 T>A T y de genes de factores putativos de virulencia, permite asignar a la mayoría de las cepas O157:H7 de esta región un alto riesgo para la salud pública.

En Argentina, el desarrollo y adopción de nuevas tecnologías productivas agrícolas, como la incorporación masiva de sistemas de labranza conservacionista, son factores fundamentales en la aparición de nuevas enfermedades que afectan a los cultivos extensivos, entre ellos a maíz (Zea mays L.). Estos sistemas permiten la presencia de rastrojo en superficie y de plantas voluntarias, los que en general son sustratos de sobrevivencia de patógenos necrotróficos. Por otro lado, las siembras tardías de maíz estabilizan el rendimiento, reducen los costos de producción, sin embargo las condiciones climáticas favorecen la emergencia y re-emergencia de enfermedades, las cuales causan pérdidas relevantes que pueden afectar la economía y seguridad alimentaria de un país. El estudio de aspectos morfológicos, genéticos y epidemiológicos de Kabatiella zeae y Exserohilum turcicum, hongos causales de la mancha ocular (MO) y tizón foliar (TF) del maíz respectivamente, permitirán conocer aspectos poco estudiados de ambos ciclos biológicos como una condición básica para el manejo integrado de ambas enfermedades. Las giras de prospección de enfermedades por la región núcleo maicera (Córdoba, Buenos Aires y Santa Fe) y la provincia de Entre Ríos confirmaron la presencia de las dos enfermedades, con distinta prevalencia e intensidad. La MO (K. zeae) resultó una enfermedad de frecuencia relativa y severidad leve a moderada; en siembras de primera y tardías. Por el contrario, el TF (E. turcicum) se caracterizó por ser una enfermedad prevalente y de incidencia alta en lotes de producción e híbridos más sembrados; la severidad alcanzó valores altos en híbridos susceptibles. En la mayoría de los ciclos agrícolas, las siembras tardías de diciembre y enero fueron favorables para la ocurrencia de ambas enfermedades foliares, principalmente del TF. La descripción de los síntomas y signos de K. zeae en maíz y de E. turcicum en maíz, sorgo (Sorghum bicolor) y sorgo de Alepo (S. halepense) contribuyeron a un conocimiento detallado de la MO y TF en infecciones naturales de campo. Los ensayos comparativos de rendimientos (ECR) de maíz que determinan la estabilidad agronómica de los híbridos en diferentes ambientes de las regiones maiceras, permitieron diferenciar el comportamiento de los materiales frente a las dos enfermedades. Se registraron híbridos susceptibles a MO y resistentes a TF y viceversa, así como susceptibles o resistentes a ambas enfermedades. Además, la cuantificación de ambas enfermedades con escalas diagramáticas específicas bajo un protocolo de evaluación que consideró un número mínimo de surcos y de plantas, con evaluaciones en la hoja de la espiga (HE), hoja inmediata inferior (HE-1) y hoja inmediata superior (HE+1), fue una instancia superadora a la simple estimación visual. Por otro lado, la utilización de diversos métodos experimentales permitió aislar, multiplicar y conservar K. zeae y E. turcicum para su posterior utilización en los estudios de variabilidad morfológica y genética, pruebas de patogenicidad y mantenimiento de aislados de diversos orígenes geográficos por más de 600 días. El hongo K. zeae a diferencia de E. turcicum, mostró una marcada variabilidad cultural, y ambos, una gran diversidad genética. Estos patógenos no se observaron en semillas por lo cual es necesario continuar con otro tipo de estudios específicos y hasta el presente no constituyen una estrategia preferencial de sobrevivencia. Sin embargo, se comprobó y confirmó que el rastrojo, las plantas voluntarias de maíz y el sorgo de Alepo constituyen una fuente de inóculo primario. La contribución al conocimiento del ciclo biológico de ambos patógenos es de gran importancia epidemiológica y permitirá delinear técnicas de manejo con un abordaje integral a nivel de agroecosistema.

La proteina inducida (PrI) por estrógenos en útero de rata, descripta por Notides y Gorski en 1966, fue identificada por Reiss y Kaye en 1981 como una proteína con características similares a la Creatina Guinasa de cerebro de rata. Kumar y col. en 1983 purificaron por primera vez a la Creatina Quinasa inducida por estrágenos del utero de rata prepuber, organo blanco de la hormona. En esta Tesis Doctoral se presenta la purificación de la Creatina Quinasa de cerebro de rata prepuber y su comparación con la Creatina Quinasa inducida por estrógenos en útero de rata prepuber. Los estudios realizados de caracterización química e inmunológica revelan que estas proteínas no son idénticas. Estos resultados llevan implícito el interrogante de la probable existencia de un gen correspondiente a la Creatina Quinasa inducida por estrágenos diferente del gen de la Creatina Quinasa de cerebro de rata o de la presencia de una única unidad transcripcional de la que provengan ambas proteínas por diferente procesamiento. El haber logrado un enriquecimiento del Acido Ribonucleico mensajero de la Creatina Quinasa inducida por estrágenos en útero, como el disponer de anticuerpos específicos contra esta proteína, abre las puertas para la obtencion de una biblioteca de Acido Deoxiribonucleico copia y el rastreo inmunológico de su producto de expresión. Ubicar a nivel genómico el gen de la Creatina Quinasa inducida por estrogenos permitirá realizar estudios en la región 5'. El hecho de que la Creatina Quinasa sea una proteína inducida tempranamente por acción de los estrógenos hacen altamente probable que los estudios realizados en la zona 5’ del gen conduzcan a la obtención de la región de unión del complejo estrógeno-receptor al Acido Deoxiribonucleico. Por ello es importante considerar que la Creatina Quinasa inducida por estrágenos y la Creatina Guinasa de cerebro noo son la misma proteína y dilucidar cuál es él o los genes inducidos tempranamente por estrógenos en útero de rata.

En este trabajo de tesis presentamos una estrategia para identificar las características transversales utilizando el Léxico Extendido del Lenguaje (LEL). La estrategia identifica características transversales en una forma similar a la que son identificados en los requerimientos. Sin embargo, mientras las técnicas tradicionales se basan en las acciones, la estrategia propuesta se basa en estados (aunque también utiliza sustantivos y acciones). Debido a que la construcción del LEL se realiza tempranamente en el proceso de desarrollo del software, la estrategia propuesta detecta características transversales tan temprano como es posible y esto redunda en beneficios al evitar el retrabajo que pudiera ocasionar la detección a mitad del desarrollo. El lenguaje que utiliza para representar el conocimiento de la aplicación (LEL) posee buena expresividad, pero por sobre todo, utiliza el lenguaje conversacional sin utilizar ningún tipo de formalismo, lo cual redunda en beneficios para ser utilizado por todas las personas que participan del desarrollo de software. En esta tesis se muestra tanto la aplicabilidad como la efectividad de la estrategia propuesta. La aplicabilidad se ilustra a través de 3 ejemplos del mundo real. Se describe una pequeña aplicación bancaria que se utiliza para ejemplificar la estrategia y su aplicación. También se describen dos casos de estudios sobre aplicaciones de mediana magnitud. Ambos casos de estudios están basados en aplicaciones reales. Uno de ellos es una aplicación de control antievasión de impuestos y la otra es un portal web que publica noticias. Además, la presente tesis también describe un experimento que se llevó a cabo con el fin de mostrar la efectividad de la estrategia. El experimento fue planteado suficientemente realista y con una población de 20 sujetos como para obtener un muestreo de resultados suficiente. Por último, la tesis describe una herramienta que permite asistir en la aplicación de la estrategia propuesta.

La teoría del desarrollo rural, y su práctica, han evolucionado de manera significativa, durante las últimas décadas, al igual que el concepto de ruralidad. En este contexto, el enfoque territorial emerge como un esfuerzo por encontrar respuestas, no solo a la actual coyuntura en que se desenvuelven la agricultura y el medio rural, sino a problemas que han perdurado a lo largo del tiempo. El Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA), a partir del Plan Estratégico Institucional 2005-2015, planteó la necesidad de producir un cambio de paradigma que permita reorientar los enfoques y las metodologías de trabajo, reconociendo a los territorios como ámbito propicio para la generación de desarrollo.. El objetivo general del presente trabajo es analizar en un área de intervención (Departamento Graneros, Tucumán) las condiciones existentes que puedan favorecer u obstaculizar el desarrollo de acciones técnicas, productivas, sociales y organizacionales desde un enfoque territorial, mientras que los objetivos específicos plantean i) caracterizar los elementos que estructuran las dinámicas presentes en el territorio; ii) generar categorías que permitan realizar un análisis situacional desde el enfoque del desarrollo rural territorial; y iii) identificar las posibles limitantes para la realización de acciones de intervención desde el enfoque de referencia.. Metodológicamente, esta investigación se abordó desde lo cualitativo; y en particular, se elaboró desde el denominado estudio de caso.. Los resultados indican que el caso estudiado correspondería a un territorio que adolece tanto de organización como de fuerza innovadora; caracterizado por presentar bajas capacidades endógenas de desarrollo (trama institucional débil; fuerza innovadora de productores u organizaciones y la fuerza emprendedora de los actores locales apareciendo como datos ocasionales).. Los desafíos en los que desembocan las conclusiones, plantean la necesidad de impulsar, e incluso iniciar en muchos casos, procesos de desarrollo territorial, con organización del tejido productivo, difusión de las innovaciones, dotación de infraestructuras y servicios adecuados, creación de nueva institucionalidad, entre otros.

Los polihidroxialcanoatos (PHA) son polímeros de reserva bacterianos que poseen propiedades termoplásticas y son biodegradables. P. extremaustralis acumula polihidroxibutirato (PHB), formado por monómeros de longitud de cadena corta. Esta es una característica poco común en bacterias del género Pseudomonas, que normalmente acumulan PHA de longitud de cadena media (PHAmcl). Trabajos previos demostraron que los genes PHB se encuentran en una isla genómica. El objetivo de este trabajo consistió en la búsqueda y análisis de genes relacionados con la producción de distintos tipos de PHA en P. extremaustralis. También se realizaron análisis bioinformáticos del genoma de esta bacteria para identificar los genes involucrados en vías metabólicas centrales y los relacionados con la producción de alginato, de interés para comprender el metabolismo de compuestos carbonados que podrían estar relacionados con la producción de PHA. Se identificaron los genes de producción de PHAmcl, phaC1ZC2D y phaFI, además de los genes, phbFPX, asociados a la síntesis de PHB. Los análisis filogenéticos realizados permitieron inferir que estos genes poseen diverso origen. En base a estudios de complementación, de expresión génica y de proteómica de los gránulos del polímero se determinó la funcionalidad de las polimerasas de PHAmcl (PhaC1 y PhaC2) y se comprobó que la diferencia en la expresión de las 3 polimerasas, encontradas en el genoma de esta bacteria, podía explicar la alta producción de PHB en comparación con otros PHA. Los resultados en conjunto ponen de manifiesto la importante capacidad de adaptación al metabolismo de esta bacteria de genes probablemente adquiridos por transferencia horizontal, como los genes PHB. La capacidad de producción de PHA con distintas propiedades en P. extremaustralis resulta de interés biotecnológico dado que a través de manipulaciones genéticas sería posible lograr la producción de diferentes bioplásticos, utilizando la misma bacteria.

El presente trabajo de tesis esta centrado en el estudio de la region promotora del gen de la fibronectina humana (FN). En primer lugar se han definido los roles funcionales in vitro e in vivo de los elementos FN-CRE y FN-CCAAT. Ambos enfoques coincidieron en definir a los factores CRE y CCAAT como moduladores positivos de la actividad transcripcional del gen FN. Mediante experimentos de inmuno-precipitacion y retardo en gel se identificaron las proteinas NF-I y CPI como los factores hepaticos que se unen al elemento FN-CCAAT. Posteriormente a traves de la implementacion de una nueva metodología que combina la inmunoprecipitación con el entrecruzamiento covalente por luz U.V. se detectó la interacciín física entre la proteína de union a CRE, ATF-2 y los factores CCAAT, CPI y NF-I. Debido a la importancia fisiológica de los cambios cuali y cuantitativos en la expresion de la fibronectina vinculados a procesos de fibrosis hepática, se caracterizaron los factores que se unen al elemento FN-CRE en diferentes tipos celulares hepaticos. Los resultados mostraron que los factores ATF-2 y ATF-3 ocupan el elemento solo en hepatocitos, mientras que otros factores, como la proteina FRA-2 ocupan el elemento CRE tanto en hepatocitos como en celulas endoteliales sinusoidales (SEC). Experimentos de transfección transitoria de cultivos primarios de hepatocitos y SEC, permitieron definir elementos enhancer y silencer dentro del promotor asi como la region necesaria para conferir inducibilidad al factor de crecimiento TGF-β. Estos resultados proveen las primeras evidencias de una ocupacion y funcionamiento diferenciales del promotor FN específicos de tipo celular hepático.

Hasta el momento sólo una cepa de PVX capaz de replicar en genotipos portadores de algunos de los genes de resistencia extrema Rx ha sido descripta, esta el la cepa HB. En el presente trabajo describimos la identificación de una nueva cepa con características de hipervirulencia aislada en Argentina; esta cepa, PVX MS, es capaz de replicar en genotipos Rxacl. La detección inmunológica con anticuerpos monoclonales mostró que la cepa MS pertenece al serotipo PVX° (común o europeo) mientras que la cepa HB corresponde al serotipo PVXᴬ(andino). El análisis comparativo por western blotting de las proteínas de cápside (CP) de diferentes cepas mostró que PVX MS se distingue por su movilidad electroforética, lo cual fue confirmado por secuenciación nucleotídica. Debido a que la CP está involucrada en varios aspectos de la interacción virus-planta, incluída la virulencia, se estudió el gen de la CP de la cepa MS. Este gen no contiene los mismos determinantes de virulencia presentes en PVX HB. Estos resultados sugieren que otras regiones virales están también involucradas en la virulencia. El análisis del genoma completo de PVX MS, respecto de otras cepas, mostró que éste presenta tres regiones exclusivas localizadas en los ORFs 1, 2 y 3, candidatas a ser responsables de la hipervirulencia de PVX MS. Por otro lado, el estudio de la CP condujo a descubrir que esta proteína es una glicoproteína. El gen de la CP de todas las cepas de PVX codifica para una proteína de 25 kDa. El análisis de las CPs por SDS-PAGE muestra un peso molecular aparente de 27 a 30 kDa, dependiendo de la cepa, pero la identidad amino acídica entre algunas cepas es muy alta como para explicar las diferencias de movilidad entre ellas. La CP de seis cepas fueron analizadas mediante oxidación con periodato, tratamiento con ácido trifluometano-sulfónico, digestión con glicosidasas, reconocimiento por lectinas, tratamiento alcalino suave (β-eliminación) y por espetroscopía de masa de las regiones amíno y carboxi terminales, indicando la presencia de O-glicosilaciones en ambos extremos. Sin embargo, estas modificaciones post-traduccionales no parecen determinar diferencias de virulencia entre cepas de PVX.

Tesis de doctorado para obtener el grado de Doctor en Ciencia Animal presentada en la Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires, 2015

Se estima que Argentina posee 6.517 has bajo cubierta, de las cuales 1.700 has se concentran en la provincia de Corrientes. Las condiciones ambientales que se desarrollan bajo estos sistemas de producción, favorecen la incidencia de numerosas especies de Oomycetes ocasionando pérdidas importantes. El objetivo de esta Tesis de Maestría fue actualizar el estado de conocimiento de los géneros Pythium y Phytophthora como fitopatógenos de cultivos intensivos en Corrientes, a través de la caracterización morfológica y molecular de una colección de aislamientos y de la identificación de las relaciones patógeno-hospedantes mediante pruebas de patogenicidad. La caracterización morfológica se basó en: aspecto, color y velocidad de crecimiento de las colonias; forma y tamaño de las diferentes estructuras de reproducción sexual y asexual. La caracterización molecular se realizó a través de la amplificación de un segmento de la región ITS rDNA y del gen cox2. Fueron caracterizados 31 aislamientos, los cuales correspondieron a 4 especies de Pythium: P. aphanidermatum, P. myriotylum, P. irregulare y P. spinosum; 3 especies de Phytophthora: P. capsici, P. nicotianae y P. cactorum; 3 especies de Phytopythium: P. helicoides, P. vexans y P. mercuriale. Se identificaron 18 relaciones patógeno-hospedante diferentes, de las cuales 8 no habían sido citadas en el país hasta la fecha (P. irregulare-Gerbera jamesonii; P. irregulare-Citrullus lanatus; P. irrgulare-Fragaria x ananassa; P. irregulare-Eustoma sp.; P. myriotylum-Petroselinum crispum; Phytopythium helicoides-Chrysanthemum sp.; Phytopythium vexans-Fragaria x ananassa y Phytopythium mercuriale-Fragaria x ananassa). Es el primer registro de Phytopythium mercuriale en el país y en frutilla.