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Los protozoarios intraeritrocitarios Babesia bovis y Babesia bigemina son los agentes causales de la babesiosis bovina, una enfermedad transmitida por la garrapata Rhipicephalus microplus que provoca importantes pérdidas económicas a la ganadería en áreas enzoóticas. En tal sentido resulta de gran relevancia la identificación de genes y la caracterización de proteínas para el desarrollo de pruebas diagnósticas de elevada sensibilidad y especificidad y el diseño racional de vacunas. En este trabajo, hemos desarrollado un método de detección molecular de B. bigemina, basado en la amplificación del gen rap-1a, útil para el estudio epidemiológico de la babesiosis bovina en áreas enzoóticas. La PCR en un solo paso, resultó altamente específica detectando 0,00002% de parasitemia. Por otra parte, para la identificación de nuevos antígenos de B. bigemina, se aplicaron dos estrategias: proteómica y herramientas de genómica comparativa. A través de la aproximación proteómica logramos extraer y separar en geles de dos dimensiones las proteínas solubles del estadio de merozoíto de B. bigemina que fueron reconocidas por sueros de bovinos infectados. A partir de las secuencias disponibles del proyecto genoma de B. bigemina y en base a la información proveniente de los genomas anotados de otros apicomplejos, pudimos identificar, anotar y caracterizar una familia de ocho genes que codifican para proteínas del tipo perforina (PLP) con el dominio de ataque a membrana MACPF en B. bigemina. Además se demostró que si bien todos los genes plp se transcriben en el estadio intraeritrocitario, particularmente los genes plpb y plpe presentan una tasa transcripcional significativamente mas alta indicando su importancia en este estadio. Asimismo, el reconocimiento de la proteína PLPA por los sueros bovinos infectados puede ser considerado como un indicio de la participación de esta proteína en la salida del parásito del eritrocito. Este trabajo de tesis contribuye al estudio de la babesiosis bovina a través del desarrollo de herramientas de diagnóstico y de la identificación de genes implicados en los mecanismos moleculares que median la interacción parásito-hospedador.

Fil:Bigi, Fabiana. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

En este trabajo se caracterizó la adenilil ciclasa TczAC. Se determinó que el gen que codifica para esta enzima se encuentra altamente conservado con los genes de adenilil ciclasas identificados en otros tripanosomátidos, es parte de una familia multigénica y se expresa en todos los estadios del ciclo de vida de T. cruzi. Se determinó que el producto de este gen es una enzima funcional capaz de complementar una cepa de levaduras carente de actividad adenilil ciclasa. Esta enzima es específica para AMPc, presenta una mayor actividad en presencia de Mn+2 que de Mg+2 y es inhibida por Zn+2 y el inhibidor del sitio P, 2'-deoxy-3'AMP. Por otro lado, el Ca+2 estimula la actividad de la misma manera independiente de calmodulina. Utilizando la técnica de doble híbrido en levaduras se demostró que TczAC dimeriza a través de su dominio catalítico y se identificaron 13 clones capaces de interaccionar específicamente con la misma. En particular se analizó la interacción de TczAC con el clon correspondiente a la proteína de flagelo paraflagellar rod. Asimismo, TczAC fire expresada en una cepa mutante de levaduras S. pombe. Los resultados obtenidos con estos experimentos sugieren que este sistema de expresión podría ser de gran utilidad para la búsqueda de inhibidores específicos. Por otra parte, se identificó y caracterizó el gen TczPDE que codifica para la primer fosfodiesterasa de AMPc de T. cruzi. Se determinó que este gen es parte de una familia multigénica y codifica para una proteína que presenta un posible péptido señal, dos dominios GAF de unión a GMPc y un dominio catalítico altamente conservado. La funcionalidad de esta proteína se confirmó por ensayos de complementación en levaduras carentes de actividad fosfodiesterasa. En dichas levaduras TczPDE se encontró asociada a la fracción particulada, mostró una alta afinidad por el AMPc y no fue capaz de hidrolizar GMPc. Por ensayos de Western blot se confirmó la asociación de TczPDE a la membrana de las levaduras y se observó que esta se encuentra fuertemente asociada a la misma. La localización subcelular de TczPDE en T. cruzi se estudió por fraccionamiento subcelular e inmunolocalización. Estos experimentos demostraron que TczPDE se encuentra localizada en la membrana plasmática del parásito y concentrada en el flagelo.

El mecanismo de splicing alternativo es un mecanismo de regulación post-transcipcional presente en los organismos eucariotas que amplía las capacidades regulatorias y funcionales de los genes mediante la generación de múltiples isoformas. Las consecuencias de este proceso son proteínas funcional y estructuralmente diferentes como así también productos no traducibles con funciones regulatorias en sí mismos. El advenimiento de las nuevas tecnologías de secuenciación masiva, incluyendo las que se utilizan para ARN (RNA-Seq) permiten estudiar cambios transcripcionales incluyendo splicing alternativo de una manera inusitada. Sin embargo, la descripción de los cambios en los patrones de splicing bajo diferentes condiciones no es trivial y ha dado lugar durante los últimos años al desarrollo de múltiples herramientas bioinformáticas. En este trabajo de tesis, se describe ASpli, un paquete de R integrativo y fácil de usar que facilita el análisis de los cambios en el splicing alternativo tanto en eventos anotados como nuevos a partir de datos de RNA-Seq. Nuestra propuesta es combinar la información estadística del uso diferencial de exones, intrones y junturas junto con las métricas de inclusión (PSI) y retención de intrón (PIR) que se obtienen por el análisis de las junturas sobre cada región genómica en estudio. La utilización de este abordaje integral intenta cuantificar de manera más exacta la ocurrencia de eventos de splicing alternativo. El desarrollo del paquete fue fundamental para el análisis de la remodelación del transcriptoma ante numerosos tratamientos en la planta modelo Arabidopsis thaliana así como en otros organismos. Como parte de los resultados, se describen los análisis del efecto de un pulso de luz en plantas y sus consecuencias globales en la regulación del splicing alternativo.

Comprender la arquitectura genética de caracteres ecológicamente relevantes requiere la contribución tanto de la biología evolutiva como de la biología del desarrollo. El tiempo requerido para alcanzar la edad reproductiva es un carácter adaptativo conocido como tiempo de desarrollo. El impacto del tiempo de desarrollo sobre el fitness particularmente en los insectos holometábolos que explotan habitats efímeros, como las moscas de la fruta, es aún más drástico. El presente trabajo es uno de los primeros estudios sistemáticos sobre la arquitectura genética del tiempo de desarrollo, en el cual además evaluamos el impacto de la variación ambiental en la expresión de este carácter. Analizamos 179 líneas mutantes artificiales generados por inserciones de elementos móviles P[GT1] en Drosophila melanogaster, con el objetivo de identificar genes candidatos que afecten el tiempo de desarrollo en moscas criadas a 25ªC. El sesenta por ciento de las líneas mostró un fenotipo heterocrónico, lo que sugiere que una gran cantidad de genes afectan al carácter. Los mutantes Merlin y Karl mostraron los fenotipos más extremos del estudio, exhibiendo una reducción y un aumento de 2 y 4 días en relación al control, respectivamente. Además, a partir de una submuestra de 42 líneas seleccionadas al azar de las 179 iniciales, se cuantificó el tiempo de desarrollo a 17ºC. Interesantemente, la interacción gen-ambiente contribuyó con el 52% de la varianza fenotípica total. De esta manera, se encontraron un gran número de genes candidatos con normas de reacción plásticas. En la siguiente etapa del proyecto encontramos gran variación genética natural para el tiempo de desarrollo asociada al cromosoma II en respuesta a gradientes altitudinales. A partir de estos resultados realizamos ensayos de complementación genética para varios mutantes heterocrónicos plásticos para la temperatura, con el objetivo final de identificar genes con variación natural para el carácter. De esta manera, pudimos determinar que una importante fracción de la variación natural está asociada a la variación a nivel de las secuencias de invected, mastermind, criclket y CG14591. En conclusión, nuestros resultados enfatizan la necesidad de tomar en cuenta el efecto que las vías de señalización metabólicas ejercen sobre la arquitectura genética de este complejo carácter de historia de vida.

A pesar de los formidables avances logrados en el tratamiento, prevención y detección temprana de un gran número de cánceres, el desarrollo de procesos metastásicos en pacientes afectados con esta enfermedad continúa representando una reducción significativa en su supervivencia y calidad de vida restante. De hecho, la diseminación metastásica de un tumor primario a un segundo sitio es la causa principal de muertes por tumores sólidos. El desarrollo de metástasis requiere que las células tumorales completen una cascada de acontecimientos constituida por etapas bien definidas, que implican interacciones muy diversas entre las células tumorales y el organismo hospedador. El potencial invasivo de las células malignas depende de tres fenómenos: alteraciones en la adhesión celular, degradación proteolítica localizada de la matriz extracelular y movilidad de las células tumorales. Dicho potencial puede verse modificado por alteraciones genéticas en las células tumorales que podrían constituir posibles puntos de intervención terapéutica. La ubiquitinación representa una de las modificaciones post-traduccionales cuyo estudio ha despertado un creciente interés en el ámbito de la oncología molecular, debido a su gran potencial a nivel terapéutico en el tratamiento del cáncer. Prueba de esto último es el hecho que, en muchos casos, alteraciones en distintos componentes de la cascada de ubiquitinación están asociadas a la trasformación maligna de células tumorales y al desarrollo de procesos metastásicos. La cascada de ubiquitinación consiste en una red compleja de enzimas que median la unión covalente de múltiples unidades de ubiquitina a las proteínas, y representa una de las vías metabólicas más importantes que participa en el control de la proteostasis a nivel celular. Por lo tanto, el estudio de los mecanismos moleculares que rigen esta cascada enzimática, junto con el desarrollo de compuestos que inhiben o activen componentes específicos, posee un gran potencial a nivel terapéutico. En el contexto de lo señalado en los párrafos anteriores, el objetivo de esta tesis doctoral es identificar y caracterizar componentes de la cascada de ubiquitinación que representen potenciales nuevos blancos moleculares que puedan ser utilizados en futuros desarrollos y mejoras de las terapias antitumorales actuales. A tal fin se realizó un screen genético utilizando tecnología de ARN de interferencia (shARN) para encontrar nuevos genes relacionados con el proceso de ubiquitinación que regularan positivamente el potencial migratorio de células tumorales. En particular se focalizó la atención en células derivadas de Cáncer de Mama Triple Negativo (CMTN), una neoplasia maligna que posee un mal pronóstico, presenta alto riesgo de recurrencia metastásica y para la cual no se posee en la actualidad una terapia eficaz y específica. Mediante este procedimiento se identificó USP19, una enzima deubiquitinasa (DUB), como un nuevo regulador de los procesos de migración e invasión celular. Asimismo se validó, tanto in vitro, como así también en modelos animales in vivo, el rol que este gen cumple en el control de procesos de tumorigénesis resaltando su alto potencial como posible futuro punto de intervención terapéutico en el tratamiento del cáncer.

La especie Paspalum notatum Flüggé (P. notatum) es utilizada como modelo en genética reproductiva vegetal debido a que presenta citotipos diploides de reproducción sexual y citotipos poliploides apomícticos y pseudógamos. Esta característica permitió evaluar: 1- El efecto directo del genotipo del polen en el desarrollo y características de la semilla y fruto (efecto xenia) y 2- Las diferencias durante la formación de semillas entre citotipos apomícticos y sexuales. En el capítulo I, se exploró el efecto xenia, el cual se define como el efecto directo del genotipo del polen en el desarrollo de la semilla o fruto. Tiene gran importancia agronómica, utilizándose en el mejoramiento genético vegetal, por ejemplo, en la búsqueda del incremento del rendimiento de granos. Aunque se reportan numerosos estudios sobre xenia, su efecto a nivel molecular ha sido poco estudiado. Por ello, se realizó un estudio molecular utilizando la especie P. notatum. Los objetivos del presente trabajo fueron: 1- Analizar el efecto de xenia en el desarrollo del endospermo a nivel molecular. 2- Evaluar si los genes expresados diferencialmente ejercen funciones durante el desarrollo de la semilla. 3- Explorar los procesos metabólicos y la(s) molécula(s) señal(es) que median el efecto xenia en el endospermo. Para ello, luego de tres horas de ocurrida la polinización, momento en el que ya ha ocurrido la fecundación de los núcleos polares, se realizó la comparación mediante cDNA-AFLP de una planta madre testigo sin polinizar, de genotipo Q4117 (4x apomíctico pseudógamo), con respecto a dos cruzamientos de esta madre con distintos dadores de polen: Q4117xH398 (2x sexual) y Q4117xQ3775 (4x apomíctico pseudógamo). Del análisis de la expresión génica diferencial se obtuvieron bandas únicas, tanto para el cruzamiento Q4117xH398 como para el cruzamiento Q4117xQ3775. A partir del análisis del patrón de bandas obtenidas, se encontraron 33 bandas de expresión diferencial únicas para los cruzamientos analizados, de las cuales 24 fueron secuenciadas, y se les asignó una posible función biológica mediante búsquedas blastn, blastx y blastp. Del análisis funcional de secuencias se obtuvo que siete de ellas (CG5, GA4, GA6, GG5, CG3, TG2 y CC1) presentaron homología con loci de Arabidopsis thaliana (A. thaliana) con funciones asociadas al desarrollo del saco embrionario, desarrollo del tubo polínico, doble fertilización, formación del cigoto y el endospermo. En artículos previos se puso en evidencia que al generarse fenotipos mutantes de A. thaliana para estos loci el tamaño de la silicua, el número, tamaño y el set de semillas (porcentaje de semillas llenas con respecto al número total de semillas).disminuye. Estos resultados mostraron evidencias del efecto xenia en las funciones asociadas a la reproducción y de que el genotipo del polen es uno de los factores que determinan la expresión de diferentes transcriptos que podrían estar asociados con el rendimiento de granos. Además, las secuencias CC3, GA4, GA6 y GA2 estuvieron asociadas a loci de A. thaliana que codifican para ARNm móviles, lo cual sería evidencia de que el mecanismo para xenia estaría relacionado con ARNm móviles que difundirían desde el tubo polínico por la micrópila del óvulo. En el capítulo II se trabajó en base a la teoría del número de balance endospérmico (NBE), la cual establece que la relación de las contribuciones genómicas debe ser 2materna:1paterna para el normal desarrollo del endospermo. Sin embargo, las plantas apomícticas de P. notatum son NBE insensibles. Los objetivos del presente trabajo fueron: 1) Realizar cruzamientos entre diferentes genotipos, a fin de generar semillas con distintos niveles de ploidía por las vías sexual y apomíctica. 2) Realizar un análisis de la expresión génica diferencial 48h luego de ocurrida la polinización (LOP). Para ello, a partir del ARNm de 20 ovarios de cada cruzamiento 48h LOP, se llevó a cabo el análisis de la expresión génica diferencial mediante la técnica cDNA-AFLP. Se obtuvieron numerosas secuencias candidatas: AC1, AC2, AC3, AC4, AC5, GG1 y GG3 para ser utilizadas en futuros análisis funcionales en A. thaliana, las cuales se expresarían en distintos estadíos de desarrollo de la semilla y estarían relacionadas con el desarrollo del endospermo y con la viabilidad o no de la semilla en P. notatum. En el capítulo III se trabajó sobre el silenciamiento génico post-transcripcional en A. thaliana a patir de secuencias candidatas de P. notatum. Para ello, se evaluó en primer lugar la eficiencia del método de transformación por Floral dip mediante la expresión transitoria del gen gus. Posteriormente, se seleccionó la secuencia candidata GG13 (gen GG13) de P. notatum con el objetivo de ser silenciada en A. thaliana y se generó un hpRNA, el cual contenía las secuencias del gen GG13 en sentido y anti-sentido separadas por un intrón. Se validó el silenciamiento mediante una RT-qPCR y el subsiguiente cálculo de expresiones relativas. Además, se evaluaron caracteres fenotípicos en silicuas de plantas silenciadas y control. Los resultados obtenidos a partir del análisis fenotípico permitieron concluir que el gen GG13 afecta tempranamente el número y la forma de las semillas y el largo de silicua. Por lo tanto, se evidenció la correspondencia entre los resultados obtenidos por el análisis funcional con lo predicho por el análisis bioinformático.

El género Alternaria incluye especies fitopatógenas y con potencial para la producción de micotoxinas con implicancias en la agricultura y en la industria alimenticia. Se analizaron 60 muestras de semillas de trigo de 12 localidades trigueras de Argentina y de cinco cultivares de trigo con el objetivo de identificar morfoculturalmente los grupos de especies de Alternaria presentes. Luego se seleccionaron 10 aislamientos de cada uno de los grupos de especies presentes: A. arborescens, A. tenuissima, A. infectoria y A. alternata para realizar pruebas de patogenicidad en hojas y en semillas de trigo. Un representante de cada grupo de especies fue caracterizado molecular y bioquímicamente. Dos aislamientos de Pithomyces chartarum, especie relacionada con Alternaria, aisladas a partir de semillas de trigo fueron caracterizadas morfológicamente, y una molecular y bioquímicamente. La caracterización molecular de los aislamientos de los grupos de especies de Alternaria y la de Pithomyces chartarum confirmaron la identificación morfocultural. La presencia de los grupos de especies de Alternaria arborescens, A. tenuissima, A. infectoria y A. alternata se corroboró en todas las zonas trigueras del país. Los ensayos de patogenicidad demostraron la existencia de aislamientos pertenecientes a todos los grupos de especies de Alternaria patógenas en hojas (medido a través de la incidencia e índice de daño). Se comprobó el comportamiento patógeno de Pithomyces chartarum en semillas de trigo de los cultivares estudiados. Pithomyces chartarum y los grupos de especies de Alternaria produjeron en semillas de trigo disminución de la germinación, plántulas debilitadas y necrosis en el coleoptile. En relación a las micotoxinas, los grupos de especies A. arborescens, A. tenuissima y A. alternata produjeron alternariol, alternariol monometil éter, altenueno, altertoxina I y II, tentoxina y ácido tenuazónico. El grupo especie A. infectoria produjo altertoxina I y II y tentoxina y Pithomyces chartarum produjo alternariol y alternariol monometil éter, no citados previamente.

La resistencia de las plantas a insectos ha sido caracterizada de acuerdo al tipo de mecanismo en que se basa en antixenosis, tolerancia y antibiosis. La antixenosis, expresa la capacidad de la planta de no compatibilizar con el parásito, evitando que actúe como hospedera, no dejando que el insecto la utilice para oviposición, alimento o refugio. La tolerancia representa la capacidad de la planta de superar el ataque de una plaga, de manera que no haya disminución significativa de la calidad y cantidad de su producción. La antibiosis, está determinada por aquellos efectos preventivos de daño o destructivos que el hospedero ejerce principalmente sobre el crecimiento, desarrollo o sobrevivencia del insecto. Estos mecanismos de resistencia pueden estar presentes en forma simultánea en una misma planta, dificultando la identificación de cada uno de ellos y la magnitud de su efecto. Los áfidos pertenecen a un grupo de insectos suctores que se alimentan mediante la utilización de los estiletes, principalmente en el floema. Los daños que los áfidos provocan a sus huéspedes pueden ser de tipo directo, debido a su alimentación que producen pérdida de nutrientes y fotosintatos. Además, los daños indirectos que ocasionan, están relacionados a su capacidad de ser vectores de virus, o al desarrollo de ciertas micosis asociadas a los azúcares que excretan, junto con las deyecciones, reduciendo la biomasa fotosintetizante. Los áfidos se encuentran distribuidos en todo el mundo con una mayor concentración de su diversidad específica en regiones templadas, debido a la abundancia de plantas hospederas. Además, son polimórficos, es decir, tienen más de una forma en su ciclo de vida con funciones específicas. Esta diversidad de formas, la habilidad de reproducirse partenogenéticamente o sexualmente y la alternancia entre hospederos, les permite desarrollar poblaciones numerosas en tiempos cortos y aprovechar las condiciones favorables para su desarrollo. Por todas estas características son considerados plagas de complejo control y por ello es de gran importancia la necesidad de identificar formas de resistencia que otorguen una mayor durabilidad y sustentabilidad a su control. El pulgón verde de los cereales, Schizaphis graminum (Rondani) y el pulgón ruso del trigo, Diuraphis noxia (Kurdjumov), son dos plagas muy importantes que afectan los cultivos de cereales, entre ellos la cebada cervecera (Hordeum vulgare L.), en nuestro país.

Tesis (Doctor en Ciencias Agropecuarias) -- UNC- Facultad de Ciencias Agropecuarias, 2019