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Tesis (Doctor en Ciencia Químicas) – Universidad Nacional de Córdoba, 2014

Fil:Acevedo, Alberto. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Este trabajo se ha centrado en el estudio del péptido Vasoactivo de Contracción Intestinal (VIC/ET-2). Para dilucidar los roles del gen VIC/ET-2, se planteó y realizó un trabajo integral sobre la distribución celular del ARNm de VIC/ET-2 en varios tejidos de animales adultos y a través de los diferentes estadios del desarrollo embrionario del ratón constituyendo el primer trabajo que presenta un estudio cuantitativo y comparativo. Comparada con la expresión de la ET-1 y los receptores ETA y ETB, la expresión fue especialmente importante en intestino ovario, útero y piel. Durante el desarrollo, se demostró que la familia de las ETs alcanza altos niveles de expresión, hacia los últimos estadios del desarrollo embrionario y al momento del parto o inmediatamente después de la ocurrencia de dicho evento en intestino, pulmón y piel. Del análisis particular sobre modelos experimentales específicos para intestino y piel; se demostró que en el intestino, el VIC/ET-2 estaría implicado en la regulación de la función de tamiz / barrera, en los procesos de movilidad y en la mecanosensibilidad de las vellosidades intestinales. Regulación que se efectuaría teniendo como blanco de acción a los fibroblastos subepiteliales y de la lámina propia. Finalmente se confirmo que VIC/ET-2 y sus receptores son activados ante la exposición a la radiación ultravioleta de longitud de onda corta (UV-C); secretado desde la epidermis, actuaría como un factor paracrino para el crecimiento de los melanocitos y para la melanización y como un factor autocrino en el crecimiento de los queratinocitos.

La enfermedad quística ovárica (COD) es una importante causa de infertilidad en bovinos, y el estrés uno de los principales factores que influyen en su presentación. La hormona adrenocorticotrópica (ACTH), principal hormona relacionada al estrés, ha sido implicada en mecanismos relacionados con la ovulación, la esteroidogénesis y la función luteal. El presente estudio fue diseñado para determinar la acción del estrés en la COD mediante la evaluación de la influencia de la ACTH in vitro e in vivo sobre la esteroidogénesis, los patrones de expresión de los receptores de melanocortinas (MCRs), las isoformas de la 11beta-hidroxiesteroide deshidrogenasa (11bHSD) y los receptores de glucocorticoides (GR), comparándolo con lo que ocurre en animales que presentan la enfermedad de forma espontánea. Mediante RT-PCR pudo detectarse ARNm para los cinco tipos de MCRs en el ovario bovino. La estimulación in vitro con ACTH produjo un incremento en los niveles de cortisol y en la expresión de 11bHSD1 en folículos terciarios y quísticos, y una disminución en la expresión de 11bHSD2 en quistes. In vivo, los quistes espontáneos e inducidos mostraron un aumento en los niveles de expresión de 11bHSD1 en granulosa en relación a los folículos terciarios controles. Por otro lado, la expresión del GR en granulosa fue mayor en folículos terciarios y quísticos de animales con COD, en relación a los folículos terciarios de animales sanos. Estos resultados indican que la ACTH puede estar implicada en los mecanismos regulatorios relacionados a la función ovárica y la patogenia de la COD.

MKP-3 es una enzima inducible sólo por estímulos proliferativos que desfosforila específicamente a ERK1/2. En cambio MKP-1 desfosforila diferentes MAPKs y se induce por diversos tipos de estímulos. En este trabajo se analizaron aspectos regulatorios y funcionales de ambas enzimas en células de Leydig MA-10 bajo la estimulación del receptor de LH (RLH) con hCG o en presencia del derivado del segundo mensajero correspondiente, 8Br-AMPc. Este estudio pone en evidencia, por primera vez, que la activación del RLH regula la expresión de MKP-3. hCG y 8Br-AMPc aumentan los niveles de MKP-3 activando la expresión génica por eventos dependientes e independientes de ERK1/2 y promoviendo modificaciones post-traduccionales que estabilizan la proteína. Se demostró que la activación del RLH conduce a la inducción p21, un inhibidor de la proliferación, y que este efecto es dependiente de MKP-3. Respecto de la enzima nuclear MKP-1, se determinó que el AMPc regula su estabilidad por múltiples fosforilaciones, involucrando la fosforilación por ERK1/2 en sitios consenso relacionados con la estabilidad (S359 y S364) y con la inestabilidad (S296 y S323) de la proteína. Se demostró que la inducción del factor de transcripción NUR77 por 8Br-AMPc, factor que participa en expresión de genes cruciales para la esteroidogénesis, es dependiente de ERK1/2 y se determinó que MKP-1 y sus modificaciones post-traduccionales impactan en la inducción de NUR77 por 8Br-AMPc. Se concluye que la inducción de MKP-1 y MKP-3 por estimulación del RLH modula las acciones de LH sobre la esteroidogénesis y la proliferación de las células de Leydig.

El cáncer de mama es la segunda causa de muerte en las mujeres, luego del cáncer de pulmón. En el desarrollo de esta enfermedad se postulan distintas etapas biológicas que van progresando desde un crecimiento hormono-dependiente a uno hormono-independiente, lo que está asociado a un aumento de la agresividad. En la clínica, si el tumor expresa receptores de estrógenos (RE) y progesterona (RP), una parte importante de los enfoques terapéuticos de elección, es la hormonoterapia con el antiestrógeno tamoxifeno. Sin bien en un principio la gran mayoría de los pacientes responden, con frecuencia el tumor evoluciona hacia la resistencia al tratamiento hormonal, lo que se asocia a diseminación generalizada. Esta resistencia, cuyos mecanismos aun se desconocen, no implica en general una pérdida de expresión de receptores hormonales y todo parece indicar que, o bien existe un cambio intrínseco en éstos, o en los mecanismos que regulan su expresión y activación. En nuestro laboratorio desarrollamos un modelo de adenocarcinomas mamarios murinos por la administración prolongada de MPA en ratones hembras vírgenes de la cepa BALB/c. Estos tumores son en su mayoría de origen ductal con capacidad invasora. En un principio poseen un comportamiento progestágeno-dependiente (PD), requiriendo de la hormona trófica para su crecimiento y expresan RE y RP, pero con el tiempo pueden adquirir un fenotipo progestágeno-independiente, en el cual se conserva aún la expresión de receptores. Previamente hemos demostrado que el RP estaria involucrado en la adquisición de hormonodependencia. El objetivo de este trabajo fue estudiar el papel del RP en la transición de hormono-dependencia a independencia y en la adquisición de resistencia hormonal. Para este estudio utilizamos seis tumores PD y nueve progestágeno-independientes. Caracterizamos la respuesta in vivo de los tumores independientes al tratamiento con los antiprogestágenos onapristona y mifepristona y al 17-β-estradiol. Seis tumores respondieron regresionando, y los llamarnos progestágeno-independientes respondedores (PI-NR) y tres no respondieron; a éstos los denominamos progestágeno-independientes no respondedores (PI-NR). En nuestro laboratorio ya se había evaluado la respuesta in vivo de los tumores PD, y respondieron a estrógenos y antiprogestágenos con regresión. Cuando, en cultivos primarios de un tumor PD, estudiamos la respuesta proliferativa a MPA in vitro observamos que la misma fue bifásica, con dos pendientes estimulatorias, una a concentraciones muy bajas (EC50 = 1.5 ± 0.7 fM) y la otra a concentraciones más altas (EC50 = 0.33 ± 0.3 nM). Con estos resultados, evaluamos por unión del ligando la expresión de receptores en todos los tumores y en tejidos normales. En útero normal, y en tumores PD y PI-R, descubrimos dos sitios receptores de progesterona, uno de alta afinidad no descrito previamente en el RP (Kd = 43 ± 9 pM, Q = 9 ± 2 fmoles/mg de proteína) y el otro sitio clásico que habíamos hallado previamente (Kd= 9.2 ± 4 nM). En los tumores PI-NR no se pudieron determinar estos parámetros. El estudio de la distribución subcelular de RP mostró que en los tumores PD y PI-R se localizan principalmente en el citosol, y son regulados por MPA, mientras que en los tumores PI-NR están principalmente en el núcleo y no son regulados. Sin embargo, durante el ciclo estral, los sitios receptores son regulados en todos los tipos de tumor estudiados. Para caracterizar la expresión de las isoformas del RP utilizamos Western blot. En los tumores PD y PI-R se encontraron ambas isoformas, RPa y RPb, con patrón de expresión similar al de los controles normales, útero y mama de ratón. Encontramos además, una proteína de 78 kDa que se expresa exclusivamente en los tumores, pero no en los tejidos normales. Desconocemos su naturaleza, pero se ha descrito una proteína similar en un 25 % de tumores humanos. Su ausencia de tejidos normales sugiere una posible aplicación como marcador tumoral. Con MPA, ambas isoformas RPA y RPB se regulan negativamente en forma similar. En los tumores PI-R se regula preferencialmente RPb, esto sugeriría un papel del RP en este tipo de crecimiento en particular por RPb. En los tumores PI-NR se detectaron menores niveles de RP, principalmente de RPb. Por estudios de Western Blot se podría predecir la capacidad de los tumores de responder al tratamiento hormonal. Por inmunohistoquímica, no se observaron diferencias en el patrón de marcación entre los tres tipos de tumores. Todos fueron positivos, con un porcentaje de células marcadas del 50 % o más. Los resultados de SSCP indican que la reactividad diferencial de los anticuerpos con Western blot e inmunohistoquímica no se debe a mutaciones en el gen de RP. Hemos teorizado la posibilidad de cambios de expresión de epitopes secundarios al distinto procesado de los tejidos en las técnicas. La caracterización de ARN por protección a RNasa indica que los niveles de RP en tumores PI-R y PI-NR son similares. Es probable que, en los tumores PI-NR, las diferencias de expresión observadas con Western blot se deban a cambios post-traduccionales. Con oligonucleótídos antisentido del RP (asRP) en cultivos primarios de tumores PI-NR demostramos que los RP están involucrados en la proliferación celular aún cuando han perdido la capacidad de unir al antiprogestágeno. Estos resultados, de ser extrapolables al humano indicarían que, en el tratamiento del cáncer de mama resistente a la terapia hormonal aún se podrían utilizar estrategias diseñadas a bloquear la funcionalidad de los receptores hormonales.

Trabajo final de licenciatura