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Aunque el uso de plaguicidas es necesario, resulta fundamental evaluar los riesgos para la salud en los seres humanos que están profesional y/o ambientalmente expuestos a estos agroquímicos. Esta exposición puede ocurrir durante la preparación de la mezcla, en el procesamiento de carga y/o lavado de los equipos de fumigación y en el momento de su aplicación. El objetivo de este trabajo de Tesis fue utilizar un conjunto de biomarcadores para evaluar el daño inducido por la exposición de humanos a mezclas simultáneas de plaguicidas empleados en los cultivos de la región Centro-Norte de la provincia de Santa Fe, con el fin de estudiar los posibles mecanismos involucrados en su toxicidad y su relación con aspectos laborales de la población en estudio. Se evaluaron dos poblaciones de trabajadores expuestos a mezclas de plaguicidas: a) 105 trabajadores rurales y aplicadores del cordón hortícola del departamento La Capital (Santa Fe, Argentina) y 112 donantes como grupo control; b) 48 aplicadores de plaguicidas en cultivos extensivos que trabajan en los departamentos San Cristóbal, Las Colonias, San Javier, Garay (Santa Fe, Argentina) y 50 sujetos que conformaron el grupo control. La valoración del daño generado por exposición directa a mezclas de pesticidas se realizó mediante el empleo de biomarcadores enzimáticos, de estrés oxidativo y de daño al ADN en sangre periférica. Los resultados mostraron alteraciones en el estado oxidativo en los trabajadores expuestos respecto a los controles, que se correlacionó con el daño al ADN. La antigüedad laboral y el uso de equipo de protección fueron factores que demostraron estar relacionados con el daño observado. En conclusión: a) se debe recomendar a los agricultores el uso de medidas de protección durante todo tipo de manipulación de plaguicidas; b) se propone que los individuos expuestos sean monitoreados de manera frecuente para minimizar o reducir potenciales efectos dañinos de los pesticidas en el ADN; c) se debe continuar con la evaluación de los riesgos asociados con la exposición a pesticidas en la población expuesta de nuestro país.

En el humano, la rata, la oveja, y otras especies animales, el desarrollo y la diferenciación del útero se completan posnatalmente. Este proceso es coordinado por diferentes moléculas y, durante este periodo crítico del desarrollo, la exposición a compuestos denominados perturbadores endócrinos (PE) puede alterar el desarrollo e inducir cambios en la funcionalidad uterina. Actualmente, muchos de los PE son agroquímicos, como el endosulfán o los herbicidas a base de glifosato (HBG), entre otros. Considerando lo antes expuesto, evaluamos los efectos de la exposición neonatal a endosulfan o a un HBG en dos modelos animales diferentes. Ratas hembra de la cepa Wistar fueron expuestas por vía subcutánea desde el día posnatal 1 (DPN1) al DPN7, cada 48hs, a una baja dosis de endosulfán (600 ug/kg/día). En el DPN90, se pusieron a preñar para evaluar: i) la diferenciación miometrial uterina en el periodo pre-implantatorio (día gestacional 5); ii) la activación miometrial durante el parto. Por otro lado, corderas de raza frisona fueron expuestas desde el DPN1 al DPN14, cada 24hs, a un HBG por vía oral o subcutánea (Roundup Full II; dosis: 2 mg/kg/día). En el DPN45 (periodo prepuberal), evaluamos los efectos sobre el desarrollo uterino. Los resultados de la presente tesis sugieren que la exposición a PE durante periodos críticos puede producir alteraciones en el desarrollo y la diferenciación uterina, con consecuencias adversas para la salud reproductiva. Asimismo, nuestros resultados contribuyen a comprender el potencial impacto de la exposición a PE sobre la cadena productiva de la industria pecuaria.

Siendo la enfermedad de Chagas es uno de los problemas endemicos mas importantes en Latinoamerica, el clonado de antígenos del agente causal, Trypanasoma cruzi, ya sea para el diagnostico o el desarrollo de una vacuna, fue uno de los objetivos mas importantes. Uno de los problemas que a menudo se presentan es la forma de obtener proteínas por tecnicas de ADN recombinante, en niveles que puedan ser llevados a escala industrial. En este caso particular, se ha estudiado la forma de expresar eficientemente y purificar cuatro antígenos clonados los que poseen un alto indice de reacción frente a sueros de pacientes con enfermedad de Chagas (Ibañez y col 1987). La expresión y purificación de estas proteinas estuvo basada en un sistema de fusión con la Proteina A de Staphylococcus aureus. Los vectores de expresion usados en este trabajo de tesis fueron los de la serie pRIT. (Nilsson y col, 1990) y sus hospedadores fueron Escherichia coli (E.coli) y Staphylococcus aureus (S.aureus) (Löwenadler y col 1986), siendo este último muy poco estudiado en la expresión de proteinas recombinantes (Nilsson y col, 1990). Una vez que las fusiones fueron expresadas, estas pudieron ser recuperadas y purificadas por cromatografía de afinidad IgG-Sepharosa en un solo paso. El esquema basico de expresión y purificación consistió en lo siguiente: 1) Expresión de la proteina fusión por la bacteria hospedadora ya sea S.aureus como E.coli. 2) Recuperación de la fusión en extractos celulares o en el medio de cultivo libre de celulas por cromatografía de afinidad IgG-Sepharosa. 3) Proteólisis enzimática especifica en el sitio de unión de la proteina A con el antigeno. 4) Eliminación de la proteina A liberada y de la fusión remanente por un segundo pasaje por la columna de cromatografia de afinidad, recuperandose el antigeno auténtico en el efluente. Los resultados en esta primera etapa permitieron extraer las siguientes conclusiones: 1) Las fusiones son principalmente encontradas dentro de la celula en E.coli, mientras que en S.aureus son excretadas al medio de cultivo. 2) Las proteinas de fusión son facilmente rescatadas y purificadas por cromatografía de afinidad. 3) Los niveles de expresión fueron de una magnitud tal que pueden ser llevados a escala industrial tanto en E.coli como en S.aureus. 4) S.aureus probó ser el hospedador de elección porque la degradación proteica fue menor y se evitó el proceso de ruptura celular. Esta ultima ventaja hace que sean procesables grandes volúmenes de cultivo en forma mucho mas rápida y menos costosa. 5) Salvo en un solo caso, la proteólisis especifica separo en forma eficiente, ambas mitades de las fusiones. 6) La ulterior purificación del antígeno auténtico postclivado por un segundo pasaje por la columna de cromatografía de afinidad, mostro una recuperacion de aproximadamente el 80%. En un primer paso, la producción de estos antígenos, por este sistema, para ser usados como reactivo de diagnostico, mostró que puede llevárselo a escala industrial, por los niveles de expresión la facilidad de su manejo y su rapidez. Las hidrofobicidad pareció influir en la degradación de algunas fusiones durante la expresión en este sistema, cuya forma de actuar fue discutida. La metodología empleada para cada antígeno en particular los que en principio serian cuatro, podria ser simplificada aún mas. Esto fue logrado a través de construcciones en la que dos o mas genes fueron fusionados para producir una única proteína que conservaría la misma capacidad de reaccionar con antisueros de pacientes como lo hacen cada uno de ellos por separado. La idea fue aproximarse a la obtención de una poliproteína única que represente a todos los antígenos a disposición de forma tal de expresar, recuperar y purificar todo el "repertorio" en un solo procedimiento. Los resultados obtenidos hasta aqui mostraron que además de ser posible la fusión de tres antíqenos distintos, la inmunoreactividad mostraron que cada antígeno en la molécula única, reaccionó con sus correspondientes antisueros especificos sin interferencia por los demas, demostrando, en primera instancia, que este tipo de quimera puede ser llevada a una prueba de campo. Además queda abierta la posibilidad de que quimeras como las que se construyeron en este trabajo, puedan contribuir a experimentos de protección.

El uso de plantas transgénicas como sistema de expresión de antígenos relevantes ha sido ampliamente evaluado dada la posibilidad de utilizar plantas modificadas genéticamente para la producción de vacunas. Las vacunas a base de plantas serían más baratas y más fáciles de elaborar en grandes cantidades. Estas vacunas se podrían producir en países en desarrollo sin necesidad de instalaciones sofisticadas y costosas como las que se necesitan en la actualidad. Por otra parte, estas vacunas eliminarlanel riesgo de virus contaminantes que existe en las vacunas producidas en líneas celulares de mamíferos ya que los posibles vian de plantas contaminantes no constituyen un peligro potencial ni para el hombre ni para los animales. Adicionalmente, las plantas transgénicas que expresen antígenos en sus tejidos comestibles podrían ser usadas como sistemas de producciónde vacunas de administración oral. Hasta el momento, la mayoría de los antígenos expresados consisten en péptidos, proteínas únicas ó estructuras muy simples. Sin embargo, la producción de antígenos vacunales en sistemas heterólogos requiere, en muchos casos. ía expresión de estructuras antigénicas complejas. EIVirus de la Fiebre Aftosa (VFA)produce una de las enfermedades más temidas del ganado debido a su amplia distribucióngeográfica y por ser altamente contagiosa. La vacuna utilizada actualmente es polivalente y a virus inactivado. El progreso en la producción de vacunas antiaftosas está dirigido hacia el logro de vacunas de elaboración más fácily económica y que eviten la manipulación de grandes cantidades de virus. Una alternativa a las vacunas convencionales es la preparación de cápsides vacías expresando y procesando la poliproteína precursora en un sistema de expresión heterólogo. Se han obtenido cápsides vacías confonnacionalmente correctas de los serotipos A, 0 y C del VFA utilizando sistemas de expresion en E. CoIi, baculovirus o virus vaccinia. Los resultados obtenidos hasta ahora al expresar cápsides vacías del VFA en sistemas heterólogos, con relación a Ia conservación de epitopes protectivos, las convierten en antígenos candidatos para la formulaciónde vacunas. Sin embargo, aún no se ha logrado un método de expresión masiva de un inmunógeno eficaz como para ser utilizado a campo, ya que los sistemas desarrollados hasta ahora resultan costosos y poco aplicables a nivel industrial. Como primer objetivo de este trabajo de tesis se propuso producir plantas de alfalfa transgénicas conteniendo el gen que codifica para la poliproteína P1 precursora de las proteínas estructurales del VFA. Las construcciones utilizadas involucran únicamente a P1 ó a P1 junto con la proteasa SC. La presencia del gen foráneo se detectó, en las plantas transgénicas, por PCR y su actividad transcripcional específica por RT-PCR y Northern blot. Fue posible visualizar por microscopía electrónica estructuras que por su tamaño y morfología podrían corresponder a cápsides vacías del VFA. La inmunogenicidad de los productos expresados fue evaluada en el modelo murino. Ratones adultos inmunizados intraperitonealmente desarrollaron una respuesta de anticuerpos detectada por su reactividad. en ELISA, frente a un péptido sintetico que representa la zona más inmunogénica de VP1 y partículas virales completas; y, en Western blot, frente a las proteínas estructurales del virus nativo. Además, estos animales desarrollaron anticuerpos neutralizantes y resultaron completamente protegidos frente al desafío con virus infeccioso. Estos resultados demuestran la factibilidad de expresar antígenos altamente complejos en plantas transgénicas y su utilizacióncomo efectivos inmunógenos experimentales. Los resultados obtenidos por nuestro y otros grupos de investigación demuestran la factibilidad de la utilización de plantas transgénicas como fuente de producción de antígenos vacunales. Sin embargo, uno de los principales problemas que posee este sistema de expresión es que los niveles de proteína expresada en las plantas transgénicas son relativamente escasos como para extrapolar su uso a una vacuna de aplicabilidad real. De modo que, el desarrollo de estrategias que generen una mayor concentración de la proteína recombinante es sumamente importante, especialmente cuando se desea utilizar los extractos de planta sin ningún proceso de enriquecimiento y/o purificación posterior. Dado que la inserción del transgen en el genoma vegetal es al azar, es altamente probable que los niveles de su expresión varíen entre los individuos producidos. Una alternativa posible, entonces, consiste en poder identificar aquellos individuos que presentan niveles excepcionalmente altos de la proteina foránea. Sin embargo, la identificación de aquellas plantas que expresen cantidades significativas de antígeno por métodos inmunológicos es un proceso lento y labioroso. Teniendo en cuenta lo mencionado anteriormente, y como segunda parte de este trabajo de tesis, hemos desarrollado una metodologia que nos permite evaluar un gran número de individuos y seleccionar de un modo fácil y rápido aquéllos que presentan mayores niveles de expresión de la proteina recombinante. Esta metodologia se basa en la expresión de un gen de interés fusionado a un gen reportero, codificante para la enzima B-Glucuronidasa (B-GUS), cuya presencia puede ser detectada cuantitativamente por colorimetrla. A fin de evaluar el sistema de selección propuesto, utilizamos como antígeno un péptido que comprende los residuos 135 a 160 de la proteina VP1 del VFA para generar la proteina de fusión con la enzima B-GUS.Las plantas transgénicas obtenidas fueron primeramente evaluadas por su actividad enzimática de B-GUS. Fue posible detectar por Western blot la proteina de fusión en aquellas plantas que presentaron mayores niveles de B-GUS. Las plantas seleccionadas expresaron 0.5-1 pglmg de proteina soluble total. El péptido p135-160 expresado como proteina de fusión conservó sus caracteristicas inmunogénicas ya que ratones inmunizados parenteralmente con una vacuna elaborada con extracto foliar desarrollaron una respuesta de anticuerpos especificos detectada por su reactividad en ELISAfrente a p135-160, particulas virales completas y en Western blot frente a VP1. Además, se detectaron anticuerpos neutralizantes que resultaron protectores frente al desafio con virus infeccioso. Estos resultados demuestran la posibilidad de utilizaruna metodologia simple para detectar las plantas que expresan altos niveles del péptido recombinante, el cual conserva sus propiedades antigénicas e inmunogénicas al ser expresado como proteina de fusión.

La fiebre aftosa es una enfermedad de gran importancia económica que afecta principalmente al ganado bovino. Esta enfermedad está causada por un picornavirus, el virus de la fiebre aftosa (VFA). El control de la enfermedad se lleva a cabo mediante eliminación de los animales infectados y vacunación con vacunas basadas en virus inactivado. Existen varias desventajas relacionadas con la producción y el uso de tales vacunas, entre las que están la reintroducción de la enfermedad debida a la manipulación de grandes masas virales o a la incorrecta inactivación del virus, por lo que el desarrollo de vacunas recombinantes más seguras aparece como una alternativa de gran interés. En el presente trabajo se estudió la posibilidad de expresar sitios antigénicos simples y complejos derivados del VFA en diferentes sistemas de expresión. La poliproteína P1, precursora de las proteínas estructurales del virus, pudo expresarse con éxito en un sistema bacteriano y en el sistema “baculovirus-células de insecto”. Sin embargo, las diferentes versiones de esta proteína no fueron capaces de montar una respuesta efectiva contra el VFA,probablemente debido a un incorrecto plegamiento espacial. Por otro lado, el sitio antigénico inmunodominante (sitio A) presente en el loop V-H de la proteína VP1 se expresó con éxito como fusión a la proteína transportadora core del virus de la hepatitis B (VHB) en células de insecto infectadas con baculovirus recombinantes. Esta proteína quimérica no adoptó Ia estructura multimérica esperada, la que se consiguió mediante coinfecciones con un baculovirus que expresaba la proteína core. De todos modos, las partículas obtenidas resultaron pobres inmunógenos cuando se inyectaron en animales experimentales, hecho debido probablemente a la baja densidad de epitopes derivados del VFA en las preparaciones vacunales. Finalmente, tanto el sitio A como la poliproteína P1 pudieron expresarse como fusión a la glicoproteína gp64 del baculovirus AcNPV. Estas proteínas quiméricas se localizaron tanto en la membrana de células infectadas como en la superficie de los baculovirus recombinantes. Esta localización asegura una conformación particulada sobre un soporte fosfolipídico (características relacionadas con el aumento de inmunogenicidad de sitios antigénicos) y facilita la purificación de los inmunógenos. Cuando se vacunaron ratones con estas construcciones, los baculovirus llevando el sitio A y las células infectadas con éstos despertaron una respuesta inmune humoral neutralizante contra el VFA, aún en ausencia de adyuvantes. De nuevo, las construcciones llevando P1 fallaron para montar una respuesta inmune humoral neutralizante, probablemente debido a un incorrecto plegamiento espacial. La posibilidad de producir baculovirus recombinantes y células infectadas que lleven en sus superficies sitios antigénicos derivados de patógenos de interés veterinario mediante infección de larvas puede convertirse en una manera sencilla y económica de producción de vacunas de nueva generación.