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El Potato virus X (PVX) es un virus de plantas perteneciente al género Potexvirus. Su genoma está compuesto por una única molécula de ARN que codifica una replicasa viral, tres proteínas de movimiento (MPs: TGBp1, TGBp2 y TGBp3) y la proteína de la cápside (CP). La proteína TGBp1 es una proteína multifuncional requerida para el movimiento viral célula a célula en la planta hospedera. Se ha demostrado que esta MP es fosforilada en los residuos T193 y T214 por una quinasa tipo CK2. Diferentes líneas de investigación sugieren que la fosforilación de las proteínas virales puede regular la replicación y el movimiento viral. El objetivo de este trabajo fue estudiar el rol de la fosforilación en la regulación funcional de la proteína de movimiento TGBp1 de PVX y en su interacción con la proteína de plantas remorina (REM). Para ello se construyeron por mutagénesis dirigida versiones de TGBp1 no fosforilables (T193A y T214A) y otras que simulan la fosforilación (T193D y T214D). En ensayos de transcomplementación de la movilización célula a célula de un virus defectivo para dicha función, se demostró que las modificaciones en ambas treoninas resultan perjudiciales en la complementación del movimiento viral. Se determinó que la fosforilación de TGBp1 en la T193 regula la estabilidad de esta proteína viral por medio de un mecanismo que involucra la presencia de una secuencia de degradación tipo PEST en el extremo C-terminal de dicha proteína. A través de la combinación de estudios que involucran el análisis comparativo in silico de varias TGBp1s de virus de los géneros Alpha y Betaflexiviridae y de estudios por mutagénesis dirigida, se determinó que la T193 y la secuencia PEST C-terminal se encuentran conservadas en todas las TGBp1s analizadas, sugiriendo que la fosforilación en la T193 de estas MPs sería un mecanismo regulatorio de la estabilidad de dichas proteínas. Por otra parte, el análisis funcional de las fosfomutantes T193 y T214 de TGBp1 determinó que la fosforilación en dichos residuos afecta negativamente la actividad supresora del PTGS de TGBp1. Los ensayos de interacción entre TGBp1 de PVX y la proteína REM determinaron que tanto el dominio N- como el C-terminal de TGBp1 son necesarios para la interacción y que la misma no es regulada por fosforilación en los residuos T193 y T214 de TGBp1. Por otro lado, este trabajo presenta las primeras evidencias que la interacción entre distintas proteínas TGBp1s y REM se encontraría conservada entre los virus que utilizan estrategias de movilización del tipo Triple Bloque de Genes (TGB). Los análisis realizados para determinar el efecto biológico de REM sobre la TGBp1 de PVX demostraron que la proteína REM no interfiere en la actividad del PTGS de esta proteína viral. Finalmente estudios de localización subcelular determinaron que la localización subcelular de TGBp1 es influenciada por la presencia de las otras proteínas virales y que a su vez varía según si la proteína se encuentra fusionada en su extremo N- o C- terminal a GFP.

Tesis (Doctor en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2020

Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2015

El presente trabajo de tesis tienen como objetivo estudiar el rol en la glándula tiroides de la enzima guanilato ciclasa (GC) y el producto de la reacción catalizada por esta: el GMPc. En la primera sección se detalla la caracterización parcial de la enzima en tiroides bovinas. Los resultados obtenidos, demuestran la presencia de dos tipos de GC: una soluble y una particulada, predominando la actividad soluble (79%) sobre la actividad asociada a membrana (8%). El tratamiento con Tritón X-100 incrementa la actividad de ambas enzimas (350% GC particulada, 70% GC soluble). Con el objeto de descartar cualquier posible contaminación de la fracción soluble con la fracción particulada y viceversa, se determinó las actividades de las enzimas en ambos preparados, previamente tratados con activadores específicos para cada una de ellas: Pépitido natriurético atrial (ANP) para la GC particulada y nitroprusiato de sodio (NP) para la GC soluble. El ANP incrementó la actividad en la fracción de membrana y el NP activó la GC de la fracción soluble, sin observarse ningún efecto del ANP y NP sobre la enzima soluble y particulada respectivamente, descartando una contaminación de las fracciones entre si. Para estudiar el grado de interacción entre la enzima particulada y la membrana, se sometió al precipitado de la centrifugación de 105.000 x g a tratamientos con NaCl 0.5 mM, deoxicolato 1%, o Lubrol PX 1%, obteniéndose mayor actividad en las muestras tratadas con Lubrol PX indicando que la proteína se encuentra fuertemente asociada a la membrana. Cuando se estudió el comportamiento cinético considerando el complejo MnGTP como sustrato, la cinética fue michaelina para la GC soluble con un Km de 0.036 mM, mientras que la enzima particulada mostró un comportamiento alostérico positivo con un S0.5 de 0.230 mM y un coeficiente de Hill de 1.9, indicando que existen en la enzima, por lo menos dos sitios de unión para el sustrato. Con el objeto de estudiar el efecto de diferentes concentraciones de manganeso, se determinó la actividad enzimática trabajando en condiciones de exceso de Mn2+ respecto de la concentración de GTP. Los resultados obtenidos en esta serie de experimentos, muestra un comportamiento alostérico positivo para la enzima soluble con un S0.5 de 1.2 mM y un coeficiente de Hill de 2.9. La cinética para la enzima particulada ensayada en las misma condiciones, resultó michaeliana con un Km de 0.280 mM. Si bien la actividad enzimática es altamente dependiente de manganeso, resultó de interés investigar el efecto sobre la enzima de otros cationes divalentes: Mg2+ y Ca2+. Reemplazando el Mn2+ por Mg2+ en el medio de reacción, no se observó actividad de la enzima asociada a la fracción particulada, obteniéndose con la enzima particulada, sólo un 15% de la actividad determinada en presencia de manganeso. El calcio en ausencia o presencia de concentraciones óptimas de manganeso, no tuvo efecto sobre la actividad de ninguno de los dos tipos de GC. Con concentraciones subóptimas de Mn2+, se observó un aumento de la actividad en la GC soluble a altas concentraciones de calcio. Este este estímulo sólo representa aproximadamente el 20% de los valores obtenidos con concentraciones de manganeso óptimas. Con la GC particulada en las mismas condiciones experimentales se observó una ligera pero significativa inhibición a concentraciones altas de Ca2+. La segunda parte de este trabajo está dedicada a determinar el posible rol biológico asociado a la GC soluble en la glándula tiroides. Para este fin se utilizó como modelo experimental cultivos primarios de tiroides bovinas. La primera serie de experimentos tuvo como objetivo verificar que en el modelo experimental utilizado, la GC soluble es activable por el nitroprusiato de sodio (NP). Los resultados obtenidos indican que el NP produce un incremento en la actividad enzimática que es dependiente de la y del tiempo de tratamiento, incrementando correlativamente los niveles de GMPc. Dado que el transporte de ioduro, constituye el paso inicial y limitante en la síntesis de las hormonas tiroideas, se estudió el efecto del NP sobre la incorporación del halógeno. Se observó una inhibición significativa de la capitación de yoduro a las 2 hs de tratamiento con 5 mM de NP en células previamente tratadas con TSH por 72 hs, sin variaciones sobre los basales (células sin TSH). Este efecto fue reproducido por un análogo del GMPc (8Br-GMPc), y bloqueado por hemoglobina reducida, sugiriendo que este se encuentre mediado por la vía GC-GMPc. La inhibición producida por el NP fue también observada cuando las células son tratadas con activadores del sistema adenilil ciclasa-AMPc tales como forskolina y análogos del AMPc, indicando que el compuesto nitrogenado podría estar inhibiendo un efecto de la TSH desencadenado a través de este sistema de transducción de señales. Sin embargo, el punto de acción sería distal a la formación de AMPc, dado que los niveles del nucleótido no se encuentra disminuidos. Dado que la incorporación de iodo a la célula tiroidea se encuentra determinada por un equilibrio entre la entrada y la salida o eflujo, se consideró de ínterés evaluar que mecanismo se encontraba afectado por el NP. En una primera instancia se estudió el efecto del compuesto nitrogenado sobre la salida o eflujo de iodo, no observándose diferencias significativas en las células tratadas con NP respecto al control. Teniendo en cuenta que la incorporación de yoduro en la célula tiroidea se encuentra inequivocamente ligada a la actividad de la ATPasa Na+/K+ estimulable, se investigó la acción del NP sobre esta enzima. Los resultados obtenidos indicaron una marcada inhibición en la actividad de la enzima en células previamente tratadas con TSH por 72 hs sin efectos significativos sobre los cultivos en condiciones basales. Este efecto es reproducido por 8Br-GMPc confirmando que la inhibición se encuentra mediada por el sistema GC-GMPc.

El Síndrome del Ovario Poliquístico (SOP) es la endocrinopatía más frecuente en las mujeres en edad reproductiva y constituye la causa más común de esterilidad femenina. Su característica principal es el hiperandrogenismo, una condición que ha sido asociada a la insuficiencia lútea y a un incrementado riesgo de pérdida de la preñez temprana. A pesar de la relevancia del cuerpo lúteo (CL) en la reproducción, prácticamente no existen investigaciones abocadas al estudio de esta glándula en SOP. Por ello, en este trabajo evaluamos los mecanismos por los cuales el exceso de andrógenos modula la funcionalidad e involución del CL, en un modelo murino de androgenización con dehidroepiandrosterona (DHEA). También determinamos la capacidad de metformina de revertir dichas alteraciones. Durante la etapa funcional del CL, el hiperandrogenismo indujo la disminución de la progesterona sérica mediante la modulación de las enzimas esteroidogénicas. Por el contrario, la administración de DHEA durante la regresión funcional provocó el “rescate” del CL, incrementando los niveles de progesterona mediante la regulación de su biosíntesis y degradación, su acción anti-oxidante y la modulación de las prostaglandinas. El hiperandrogenismo durante la regresión estructural incrementó la apoptosis y reguló la expresión de moléculas involucradas en la presentación antigénica en las células del CL. La metformina previno muchos de los efectos del hiperandrogenismo en la luteólisis, pero no evitó la disfuncionalidad lútea en su etapa funcional. Concluimos que el hiperandrogenismo posee un efecto dual sobre el CL, dependiendo del estado de desarrollo lúteo en el cuál actúe, generando estados patológicos y disfuncionales, la mayoría de los cuales pueden ser evitados por la metformina.

La asociación entre cáncer e inflamación en un órgano o tejido se encuentra sólidamente establecida. En efecto, se sabe que ciertos tumores, tienen una mayor probabilidad de originarse en sitios de inflamación crónica y que procesos inflamatorios locales pueden acelerar el crecimiento de tumores preexistentes en animales y seres humanos. Por otro lado, la relación entre cáncer e inflamación sistémica no ha sido particularmente estudiada. En esta tesis, demostramos que durante el crecimiento de 4 tumores murinos, de diferente origen, estirpe histológico e inmunogenicidad y de un tumor humano creciendo en ratones nude, se generaron 2 picos temporalmente separados de inflamación sistémica. El primer pico fue relativamente pequeño y transitorio ya que fue detectado durante la primera semana luego de la inoculación del tumor. Tal vez represente, en parte, una respuesta del organismo al trauma mecánico de la inoculación de elementos extraños, ya que la inoculación de fibroblastos murinos normales también produjo una manifestación de inflamación sistémica, aunque menor, que la observada después de la inoculación de células tumorales. Por otro lado, el inicio del segundo pico de inflamación sistémica fue observado cuando el volumen tumoral fue mayor que 500 mm3 y coincidente con el inicio del crecimiento exponencial de cada tumor. Este segundo pico de inflamación sistémica fue significativamente más prominente que el primero y su intensidad aumentó en relación directa con el incremento de la masa tumoral. Estos resultados sugieren que la inflamación sistémica podría ser un fenómeno general de la patología neoplásica y su importancia se puso de manifiesto en el hecho de que, en nuestra colección de tumores, se observó, sorpresivamente, una correlación directa entre la magnitud de la inflamación sistémica generada por cada tumor y su agresividad, correlación que no se observó con la capacidad de generar metástasis. Esto indica, al menos en los tumores analizados por nosotros, que la capacidad de generar una potente respuesta inflamatoria sistémica, produce más efectos deletéreos sobre el organismo que la propia capacidad metastásica, disminuyendo de este modo la sobrevida. En este sentido, se encontró gran infiltración de neutrófilos y alteraciones estructurales en diferentes órganos, que son compatibles con disminución y aún pérdida de función, independiente de la capacidad metastásica de cada tumor. La inflamación sistémica generada por el tumor exacerba el propio crecimiento tumoral estableciendo un circuito de retroalimentación positivo entre ambos, al menos en parte por la activación del receptor TLR-4. Además, la disminución de las manifestaciones de inflamación sistémica mejoró los efectos anti-tumorales obtenidos con quimioterapia y radioterapia, aunque estos resultados fueron relativamente modestos. Esto se debe a que el tumor cuando supera los 1500 mm3, comienza un crecimiento exponencial, generando un fenómeno de inflamación sistémica progresivo, a pesar de que se continúan administrando las drogas antiinflamatorias, que hasta ese momento habían sido bastante efectivas para limitar la naciente inflamación sistémica y para retardar el crecimiento tumoral. En cambio, un excelente resultado terapéutico fue alcanzado cuando se realizó el tratamiento antiinflamatorio junto con la escisión quirúrgica de tumores > 2000 mm3. En este caso, la eliminación quirúrgica de la fuente principal de inflamación sistémica y de posible refractariedad, permitió al tratamiento antiinflamatorio tener muchas más chances de actuar, contra la inflamación sistémica residual, pero aún deletérea, que perdura al menos 2 semanas después de la extirpación del tumor. Si esta condición inflamatoria sistémica fuera una característica distintiva de muchos canceres avanzados, un conocimiento más preciso de los mecanismos por los cuales esta inflamación sistémica promueve el crecimiento tumoral y produce múltiples daños en el organismo y la búsqueda de sustancias antiinflamatorias más efectivas y con menores efectos adversos, serían muy importantes para complementar y mejorar las terapias actuales contra el cáncer.

Los efectos de la insulina sobre el tono vascular han sido estudiados tanto in vivo como in vitro mediante variados enfoques experimentales y en diferentes especies. El uso de células disociadas de músculo liso vascular o de células en cultivo permitió obtener información sobre los efectos de la insulina en la modificación de la concentración de Ca2+ intracelular producida por agonistas (43-45), sobre la expresión de transportadores de Ca2+ que regulan su concentración citosólica (40-43), y sobre la expresión de receptores para endotelinas (28,29). El planteo de este trabajo fue el de investigar los efectos de la insulina en el tejido vascular intacto en el cual las células de músculo liso se hallan bajo la regulación paracrina de factores derivados del endotelio. Para ello se seleccionó como principal modelo experimental a la rata debido a que es una especie donde la insulina tiene efectos hipertensores (70) y cuyos vasos o células vasculares aisladas han sido utilizadas en relación a los efectos de insulina (28,30,39,45,81- 83). Como vasos se eligieron uno de conductancia (aorta) y uno de resistencia (arteria de la cola) en la rata; un agonista fue testeado en segmentos de venas safenas humanas por la importancia de su rol en la regulación del tono vascular y la posibilidad de que la insulina modificara sus efectos. Los agonistas utilizados fueron todos de importancia fisiológica: noradrenalina, angiotensina II, arginina- vasopresina y endotelina 1. Los protocolos experimentales se diseñaron teniendo en cuenta las concentraciones de hormona y los períodos de tiempo de incubación con los que en la bibliografía se demostraban modificaciones en la concentración de Ca2+ citosólico y en la expresión de transportadores de Ca2+ inducidas por la insulina en células de músculo liso vascular aisladas. Para profundizar en el estudio de los efectos de la insulina sobre el retículo sarcoplásmico y sobre los canales de Ca2+ de la membrana plasmática se utilizaron también preparaciones de vasos hiperpermeabilizados por tratamiento químico y de células en cultivo derivadas de músculo liso aórtico de rata. Los objetivos propuestos fueron establecer si la preincubación con insulina: • modifica las contracciones inducidas por agonistas fisiológicos. • media sus efectos a través de fosforilaciones en tirosina. • afecta a las contracciones inducidas por endotelina 1 a través de la modificación de: - la síntesis de óxido nítrico y de derivados de la ciclooxigenasa. - el influjo de Ca2+ desde el medio extracelular. - la liberación de Ca2+ desde depósitos intracelulares. - las fosforilaciones dependientes de proteína quinasa C. • regula la actividad del retículo sarcoplásmico. • regula la actividad de los canales de Ca2+ de la membrana plasmática

Cada uno de los pasos de la vía de síntesis de novo de glicerolípidos en mamíferos puede ser catalizado por numerosas isoformas enzimáticas. El primer paso de esta vía, catalizado por la enzima glicerol-3-fosfato aciltransferasa, involucra al menos cuatro isoformas productos de distintos genes. Los estudios realizados hasta el momento indican que cada una de ellas presenta un patrón de expresión específico de tejido, diferentes localizaciones subcelulares y distintos modos de regulación. Esto sugiere que cada una de estas isoformas cumpliría una función específica en el tejido en el cual se expresa. En este trabajo de tesis focalizamos nuestros estudios en la función de la isoforma 2 de GPAT (GPAT2), que es una proteína mitocondrial que se expresa principalmente en testículos. Como hipótesis planteamos que GPAT2 estaría involucrada en la síntesis de los triacilgliceroles con un alto contenido de PUFA característicos de este órgano, y necesarios para un normal desarrollo de la espermatogénesis. Objetivos Teniendo en cuenta la importancia del metabolismo de los TAG en testículo, y su particular composición en AG, nos planteamos los siguientes objetivos: 1. Estudiar la afinidad de la isoforma GPAT2 por diferentes sustratos in vitro y su función en la síntesis de TAG, para determinar si la misma podría estar involucrada en la síntesis de los TAG con alto contenido de PUFA presentes en este órgano. 2. Determinar si el producto del gen Gpat2 es activo en testículo de rata. 3. Determinar la localización celular de Gpat2 en el testículo. 4. Estudiar la expresión y actividad de Gpat2 durante el desarrollo postnatal.

Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2021

La NCAM pertenece a la familia de las inmunoglobulinas siendo su función más conocida la promoción de la adhesión homofílica entre células vecinas, como neuronas, astrocitos y células musculares, y de la adhesión heterofilicas entre estas células y proteínas de las matrices extracelulares. Tiene tres isoformas principales: 120, 140 y 180 kDa. Sólo la NCAM de 120 kDa carece de los dominios citoplasmático y transmembrana y se encuentra unida por anclaje fosfatidilinositol. Una caracteristica de Ia NCAM es presentar cadenas homo poliméricas de ácido siálico (PSA) unidas covalentemente. La expresión de PSA NCAM es muy abundante en el sistema nervioso central durante el desarrollo embrionario y las primeras etapas postnatales pero en el adulto su expresión disminuye. La presencia de PSA en la NCAM adulta impide la adhesión celular y estimula la remodelación y plasticidad tisular. Además la NCAM puede encontrarse en forma soluble, puesto que se ha descrito su presencia en diferentes fluidos biológicos, proponiéndola como marcador soluble para algunas patologías tumorales como el cáncer de pulmón a células pequeñas y en patologías neurodegenerativas como la esquizofrenia. Nuestro obietivo fue estudiar la relación de la molécula NCAM con procesos tumorales y neurodegenerativas humanos y experimentales. A) Para ello estudiamos la participación de NCAM en el comportamiento biológico de la línea celular LP07, derivada de un tumor de pulmón murino de origen epitelial glandular con componente neuroendocrino. La expresión se evaluó en homogenatos y cultivos primarios tumorales, detectándose distintas isoformas de NCAM,cuya expresión varia a lo largo del crecimiento tumoral. Por otro lado, la disminución de metástasis experimentales con anti NCAM sugiere que esta molécula favorecería la colonización del órgano blanco. El tratamiento de NCAM in vitro con anticuerpos específicos disminuyó la adhesividad, la migración y la proliferación celular al mismo tiempo que induce la reorganización del citoesqueleto de actina compatible con una reversión epitelio mesenquimática, característica de la célula tumoral. B) Hemos estudiado el rol de NCAM sérica como marcadora tumoral en pacientes con patología cerebral benigna y maligna. Para ello en un primera etapa estudiamos por western blot y densitometría los niveles de todas las isoformas de NCAM sérica en individuos sanos apareados por edad y sexo, observando que las isoformas de bajo PM difieren con la edad de los individuos. Determinamos los niveles de las distintas isoformas de NCAM presentes en el suero de pacientes con tumores primarios del SNC: gliomas (n=34), metástasis única (n=27), tumores benignos (n=22). Las muestras de suero de cada paciente se analizaron por western blot y densitometría. La concentración de NCAM se asoció a los parámetros clínico-patológicos indicadores de pronóstico, así como con la evolución clínica de cada paciente. Se detectaron bandas específicas de alto (≥130kDa) y bajo PM (<130kDa). Se encontró que el cociente ≥130kDa /<130kDa está aumentado en los pacientes con tumores cerebrales vs controles sanos (diferencias independientes de edad y sexo). No se encontró diferencia entre pacientes con tumores benignos o malignos NCAM sérico mostró una especificidad del 80% y una sensibilidad del 60%, con un VP+ del 60% y VP- del 80% para identificar pacientes con tumores cerebrales. En una segunda muestra post cirugía fue posible encontrar una disminución de los valores séricos de NCAM en 9 de 12 pacientes analizados. C) Hemos medido los niveles de NCAM sérico en pacientes con déficit cognitivo como la Demencia tipo Alzheimer (DTA). Las patologías neurodegenerativas presentan niveles séricos elevados de todas las isoformas de NCAM. Además se observó un aumento especifico de la NCAM <130kDa asociada al grado de deterioro cognitivo de los pacientes DTA por lo tanto podría ser útil como marcador de seguimiento del paciente, lo cual facilitaría el diagnostico y el tratamiento en etapas tempranas.