Las talasemias son un grupo heterogéneo de anemias hereditarias, tanto desde el punto de vista molecular como clínico y hematológico, caracterizadas por la disminución o total ausencia de síntesis de una o varias cadenas de globina. La cadena sintetizada en menor cuantía es, por lo demás rigurosamente normal en su composición y estructura. Se trata, por tanto, de desórdenes cuantitativos, en oposición a las alteraciones cualitativas denominadas hemoglobinopatías. La mayoría de los defectos génicos responsables de las -talasemias son la mutación de un único nucleótido que afecta a uno de los diferentes procesos moleculares involucrados en la expresión del gen globina: transcripción, procesamiento del pre-ácido ribonucleico mensajero (pre-RNAm) y traducción. La intensa actividad desarrollada en la década de los 80 y el gran avance de las técnicas de Biología Molecular para establecer las bases moleculares de las talasemias, han demostrado que las lesiones genéticas no pueden ser detectadas con los métodos analíticos convencionales. Las -talasemias son una de las alteraciones hereditarias más frecuentes y se encuentran distribuidas por todo el mundo. La alta frecuencia de los genes talasémicos se debe probablemente a la protección frente a la malaria que proporciona el estado heterocigota. En Argentina los estudios epidemiológicos, aunque escasos y fragmentarios, han evidenciado la presencia de las -talasemias con cierta heterogeneidad fenotípica. Debido a todo esto, se diseñó el presente estudio para optar al grado de Doctora en Bioquímica, y se marcaron los siguientes objetivos: 1- Determinar la heterogeneidad molecular de la -talasemia que nos permita dar el adecuado asesoramiento genético y establecer el consiguiente diagnóstico prenatal. 2- Interrelacionar el fenotipo de la mutación responsable de la -talasemia (+ ó 0) con parámetros hematológicos. 3- Tratar de establecer la causa de las diferencias fenotípicas observadas en portadores talasémicos que presentan la misma mutación. Con el objetivo de obtener nuestros valores normales se realizó el estudio de un grupo control constituido por 150 individuos normales (59 varones, 70 mujeres y 21 niños), considerados normales al tener los valores hematimétricos dentro de los rangos normales, morfología de serie roja normal y no presentar ninguna alteración en el estudio de hemoglobinas por electroforesis. Desde 1996 hasta fines de 2000, se han estudiado 124 individuos talasémicos mayores de un año, no relacionadas entre sí, originarios de Rosario y su zona de influencia. En unos casos se trató de sujetos asintomáticos o con leves manifestaciones clínicas que acudieron a nuestro Servicio (Servicio de Hematología- Sala 9- Hospital Provincial del Centenario) por haber presentado microcitosis en un análisis de sangre rutinario coincidiendo con un ingreso quirúrgico, proceso infeccioso banal o chequeo de salud, y otros eran pacientes diagnosticados como portadores de talasemia con anterioridad. Durante la realización de este trabajo de tesis fue derivado a nuestro Servicio un paciente de 15 meses (hijo de un matrimonio de portadores incluidos en este estudio) por presentar un cuadro de anemia severa con requerimiento transfusional. A las muestras mencionadas anteriormente se les practicaron las siguientes determinaciones: 1. Estudio hematimétrico: Cuantificación de hematíes, hemoglobina y hematocrito. Determinación de los parámetros VCM, HCM, CHCM Observación de la morfología eritrocitaria Recuento de reticulocitos 2. Metabolismo férrico: Dosaje de hierro y capacidad de saturación de la siderofilina Determinación de ferritina sérica 3. Estudio de hemoglobinas Electroforesis de hemoglobinas en acetato de celulosa a pH 9,0 Electroforesis de hemoglobinas en Agar-citrato a pH 6,1 Cuantificación de hemoglobina Fetal Test de cuerpos de inclusión Test de inestabilidad térmica Test de anaerobiosis 4. Estudios moleculares Identificación de la mutación responsable de -talasemia Presencia de la deleción -3,7 Presencia de la triplicación de genes alfa (anti 3,7) en aquellos individuos en los que el dosaje de Hb estuvo por debajo de 11 g/dl (varones y mujeres 50 años) y por debajo de 10,5 g/dl (mujeres 50 años y niños), estudiándose entonces 48 individuos (7 varones, 2 mujeres 50 años, 30 mujeres 50 años y 9 niños). Para la identificación molecular de la mutación responsable de -talasemia se empleó la técnica de PCR-ARMS y para detectar la presencia de la alfa deleción y de la alfa triplicación se empleó PCR- alelo específica. Un individuo presentó la deleción -3,7, dos presentaron triplicación de genes alfa ( anti3,7), dos fueron portadores de una talasemia y uno mostró una doble heterocigosis tal/HbS. Estos seis individuos fueron por lo tanto excluidos del grupo en el que se estudió la interrrelación de los parámetros hematológicos con el genotipo -talasémico y en ellos se analizaron las diferencias fenotípicas al compararlos con portadores -talasémicos que presentaron la misma mutación. Se identificaron entonces, 118 sujetos no emparentados, portadores de talasemia heterocigota, con metabolismo de hierro normal y sin asociación a ninguna otra de las patologías de la hemoglobina estudiadas. Los dos individuos portadores de talasemia fueron excluidos del grupo en el que se analizó la heterogeneidad molecular de la talasemia ya que estas talasemias presentan, en su gran mayoría, deleciones y no mutaciones puntuales que fue lo investigado en este trabajo, quedando por lo tanto constituido este grupo por 122 individuos. La experiencia en el Mediterráneo ha mostrado que los programas preventivos de talasemia basados en la detección de portadores heterocigotas y el consejo genético no son efectivos para reducir la incidencia de nacimientos de niños con -talasemia mayor. El diagnóstico prenatal de la -talasemia ha dado una nueva dimensión a la prevención de la misma, pero para poder llevarlo a cabo, lo más importante es tener conocimiento de las mutaciones y su incidencia. Este estudio intenta ofrecer un cuadro general de la genética molecular de la talasemia en nuestra área. El 92,6 % de los alelos se identificaron con las 6 mutaciones diferentes estudiadas, superponible a los datos encontrados en otros países de la cuenca Mediterránea como Italia, donde el 88% se distribuye entre CD39 (40,1%), IVS-I-ntl10 (23,0%), IVS-I nt l (10,2%), IVS-I-nt 6 (9,9%) y IVS-II-nt 745 (5,0%), superponible también a lo publicado por Brasil en el estado de San Pablo donde la mayoría de los portadores de -talasemia son descendientes de italianos y con cuatro mutaciones, CD39 (45 %), IVS-I-ntl10 (14 %), IVS-I-nt6 (5 %) y IVS-I-nt 1 (4 %) identificaron el 97,1 % de los cromosomas talasémicos. En España, Villegas y col, lograron identificar el 86,6 % de los alelos investigando cinco mutaciones IVS I-1, IVS I-6, IVS I-110, CD39 y CD8/9 (+G). En nuestro estudio, la mutación más frecuente se correspondió con el CD39, la cual fue identificada en el 57,4 % de los alelos. Esta también resultó ser la mutación más frecuente en Italia, España, Francia y Portugal. La segunda mutación en importancia correspondió a la IVS I-110 que representó el 22,1 % del total identificado siendo ésta la segunda en importancia también en Italia y Francia (23,2 y 25,7 % respectivamente), no así en España y Portugal donde la IVS I-6 (15,5 %) y la IVS I-1 (32,9 %) ocuparon el segundo lugar respectivamente. Cabe destacar que la frecuencia de la mutación IVS I-6 que representa el 10,3 % en Italia y el 15,5 % en España, en este estudio fue hallada sólo en el 2,5 % de los casos. El resto de mutaciones encontradas, IVS I-1 (4,9 %), IVS II-1 (1,6%) e IVS II-745 (4,1 %), representó el 10,6 %. Este estudio viene a confirmar que a pesar de la elevada heterogeneidad molecular de la -talasemia, un grupo de mutaciones, relativamente pequeño, es el responsable de la mayoría de los casos de -talasemia en nuestra área, y su incidencia, en general, superponible con las descritas en otros países de la cuenca Mediterránea, teniendo fundamentalmente en cuenta los datos publicados por Italia ya que el origen de nuestros pacientes fue 89,3% italianos, 9,8 % españoles y 0.9 % griego. Si comparamos nuestros datos con los publicados por nuestro país, vemos que Varela y col logró identificar en una población de Bs. As. de origen Mediterráneo, el 90 % (similar a nuestro porcentaje) de los alelos talasémicos estudiando cuatro mutaciones (CD39, IVS-I-nt l10, IVS-I-nt 6 y IVS-I-nt 1). Estos mismos autores cuando posteriormente estudiaron las mismas seis mutaciones que buscamos en nuestro trabajo lograron también identificar el 90 % de sus 109 portadores beta talasémicos. Si bien las mutaciones más frecuentes resultaron ser CD39 (39,45 %) e IVS-I-nt-l10 (23,85 %), el porcentaje de la primera fue distinto del nuestro probablemente debido a una mayor proporción de descendientes del norte de Italia presentes en nuestra población. La misma consideración puede hacerse con respecto a los valores de las mutaciones más predominantes publicados por Soria y col en una población de Córdoba. Nuestra mayor concordancia es con el trabajo publicado por Roldán y col. que en una población de Bs. As, encontraron que los cuatro defectos más comunes (CD 39, 47%; IVS-I nt 110, 22,4%; IVS-I nt 1, 9,4% y IVS-I nt 6, 5,9%) se detectaron en el 84,7% de los alelos talasémicos. Debido a que no fue posible poner de manifiesto la mutación en el 7,4 % de los casos y a la gran variedad de asociaciones -talasemia y hemoglobinopatías concluimos de la complejidad del estudio molecular en nuestros pacientes con -talasemia. Por ello los estudios de Biología Molecular son trascendentales para dar el adecuado consejo genético y establecer el diagnóstico prenatal. Entre los pacientes en los que no se pudo detectar la mutación responsable del fenotipo talasémico se hallaron cuatro hombres, cuatro mujeres y un niño. Todos eran de origen italiano, excepto uno, griego. Todos presentaron fenotipo hematológico dentro de lo esperado para pacientes portadores de talasemia. Los niveles de Hb A2 estuvieron por encima del 4% y los de Hb F por debajo del 5%. Los valores del metabolismo férrico y de ferritina sérica fueron normales. Cuando se estudiaron por PCR-ARMS las seis mutaciones anteriormente mencionadas, todos presentaron banda de amplificación con el oligonucleótido normal, no así con el mutado. Ningún paciente presentó asociación con alfa talasemia (deleción 3,7 kb) ni con triplicación de genes alfa (alfa alfa alfa anti 3,7 kb). En estos casos sería necesario investigar la presencia de mutaciones muy poco frecuentes en nuestro medio (menos del 2 %) o proceder a la secuenciación del gen beta. También tener en cuenta que hay estudios poblacionales que han mostrado que aproximadamente el 1% de los genes beta talasémicos en el mundo permanecen sin caracterizar a pesar de un exhaustivo análisis de los genes globina incluyendo las regiones flanqueantes. Se ha postulado que en estos casos la mutación puede ser hallada en el upstream LCR o en la región enhancer 700-1000 pb 3´del gen globina. Sin embargo, en varias familias, análisis de ligamiento, demostraron que el fenotipo -talasémico se segrega independientemente del cluster globina, implicando que la determinante genética puede actuar en trans. Para el estudio comparativo de los genotipos talasémicos 0 y + en hombres, mujeres 50 años y de 50 años y niños, se aplicó la técnica de Análisis de la Variancia a dos criterios de clasificación (Talasemia y grupo) para seis variables de interés, correspondiente a un diseño no balanceado dado que los tamaños de las muestras eran diferentes para las combinaciones de Talasemia y Grupo, mientras que para el estudio comparativo de las mutaciones de los genotipos talasémicos estudiados se utilizó la técnica Análisis de la Variancia a un criterio de clasificación para cinco variables de interés correspondiente a un diseño balanceado. De la aplicación de las comparaciones múltiples se concluye que los promedios de GR Hb, y Hto para hombres y mujeres mayores de 50 años son iguales y significativamente mayores que los promedios de los GR de las mujeres menores de 50 años y niños, los cuales no difieren, el promedio de VCM y HCM para niños es significativamente menor que para las mujeres menores de 50 años, siendo estos dos grupos los únicos que difieren entre sí. También se concluye que el promedio de Hb A2 para los niños es significativamente mayor que para las mujeres mayores de 50 años, siendo estos dos grupos los únicos que difieren entre sí. En lo que respecta a la Hb F no se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre genotipos de talasemia ni entre grupos en estudio. No se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre los promedios de cada una de las variables estudiadas para las seis mutaciones consideradas. Existen diferencias levemente significativas (p0,10) entre los valores promedios de HCM para las distintas mutaciones consideradas. Al aplicar comparaciones múltiples de Newman-Keuls para el 10% se concluye que el promedio de HCM para el genotipo + I-6 es marginalmente superior que para el genotipo + II-745, no existiendo diferencias significativas entre los restantes cuatro genotipos estudiados. Las diferencias fenotípicas en portadores talasémicos que presentan la misma mutación se observaron en: 1. Asociación con talasemia (deleción -3,7): el fenotipo hematimétrico en los pacientes que presentan rasgo beta talasémico asociado con alfa deleción heterocigota tiende a normalizarse. 2. Asociación con triplicación de genes alfa ( anti 3,7): el fenotipo hematimétrico de los pacientes que presentan rasgo beta talasémico asociado con alfa triplicación se desvía por debajo de los valores esperados para un portador de talasemia. 3. talasemia: en el caso del portador de talasemia en que se encontró la mutación 0 39 el fenotipo hematológico fue similar a los portadores talasémicos. El estudio convencional de hemoglobinas fue distinto al característico del portador talasémico. 4. Doble heterocigosis 0 39 / Hb S: en este caso se observaron diferencias tanto en el fenotipo hematológico cuanto en el estudio convencional de hemoglobinas. 5. Asociación con otra mutación para talasemia: en nuestro único caso, la doble heterocigosis para talasemia dio lugar a un paciente con anemia de Cooley.