Catálogo de publicaciones

La principal causa de muerte entre los pacientes con cáncer es la aparición de metástasis. Es corriente observar recaídas luego de largos periodos libres de enfermedad, aún luego de la cirugía, quimioterapia y radioterapia. La fuente de estos nuevos focos de crecimiento son células que se mantuvieron “dormidas” o quiescentes, y que por razones que aún se encuentran en estudio, reanudan su crecimiento. La enfermedad diseminada que persiste luego del tratamiento y es indetectable clínicamente es lo que se conoce como enfermedad mínima residual. Actualmente poco se sabe sobre los procesos puestos en juego durante el pasaje de estas células diseminadas desde un estado quiescente a un estado proliferativo. Una de las problemáticas más relevantes es la falta de tratamientos que resulten efectivos a la hora de atacar la enfermedad mínima. Teniendo en cuenta las características biológicas de estas células resulta lógico que no respondan de la misma manera que el tumor primario o las metástasis ya establecidas a drogas adyuvantes y tratamientos que consisten en atacar la capacidad proliferativa tumoral. Comprender este fenómeno permitiría conocer las señales claves en la transición, información que resultaría extremadamente útil a la hora del diseño de nuevas drogas, o el análisis de los efectos de las drogas ya existentes sobre las células dormant o quiescentes. Para este fin, es necesario contar con modelos de estudio in vitro e in vivo propicios. Una de las principales barreras a la hora de estudiar nuevos fármacos es la poca disponibilidad de modelos de estudio que reflejen de manera fiel la situación clínica de un paciente que ha sido tratado por la aparición de una neoplasia primaria y (a pesar de no ser detectadas) presenta células diseminadas con el potencial de formar un foco secundario de crecimiento. A partir de las problemáticas planteadas, esta tesis doctoral se desarrolla a lo largo de tres capítulos, con el objetivo de estudiar el rol de proteínas con funciones aún no determinadas en aspectos claves de la biología tumoral, en particular en el proceso de latencia, diseminación y desarrollo de recidivas. De forma paralela, se diseñaron modelos de estudio in vivo para su aplicación en el estudio del efecto de nuevas drogas en los procesos nombrados. Particularmente, dentro de las quinasas propuestas como determinantes del fenotipo quiescente se encuentra p38. Se ha reportado que esta quinasa se encuentra activa en células solitarias diseminadas quiescentes y en micrometástasis. Sin embargo, el rol de p38 en la biología tumoral resulta un tema controversial. En varias publicaciones se reportan resultados que posicionan a p38 como una proteína que favorece el crecimiento tumoral, y es por esto frecuentemente propuesta como un blanco interesante para el desarrollo de drogas antitumorales. En este trabajo, se muestra que la inhibición química de p38 en células F3II (carcinoma de mama murino) favorece la proliferación en cultivo 3D, la activación de la quinasa mitogénica ERK1/2, la expresión de integrinas ɑ5 en la membrana citoplasmática, con el consecuente aumento en la adhesión celular. Adicionalmente, se desarrollaron modelos de estudio in vivo que mimetizan el proceso de diseminación de células tumorales luego de una intervención quirúrgica, así como también un modelo para el estudio de la latencia tumoral. En todos los casos, se estudió el efecto de la modulación negativa de p38 en estos modelos, observando que su inhibición le otorga a las células F3II ventajas adaptativas, lo cual se tradujo en un aumento en el desarrollo de recidivas, una marcada tendencia al aumento en el número de metástasis pulmonares, y una disminución en los tiempos de latencia tumoral. Por último, se aplicaron los modelos desarrollados para estudiar el efecto de un novedoso péptido anti-CK2 denominado CIGB-300. Este péptido mostró una marcada tendencia a reducir la aparición de focos secundarios en pulmón luego de la remoción quirúrgica del tumor primario. En síntesis, en este trabajo se recalca la importancia de la quinasa p38 en el control del crecimiento y la agresividad de la línea F3II, demostrado tanto in vitro como in vivo. A su vez, se proponen novedosos modelos in vivo basados en la modulación de dicha quinasa, como herramienta para el estudio del efecto de nuevos compuestos con potencial antitumoral.

Tesis (Doctor en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2017

Las señales de calcio son utilizadas por una enorme variedad de células para regular procesos tan distintos como la fertilización o la muerte celular, entre muchos otros. La versatilidad del ión calcio como agente señalizador se basa en la gran diversidad de comportamientos que su concentración puede desplegar dentro de las células. Desentrañar la compleja trama de mecanismos que determinan dichos comportamientos es un enorme desafío que requiere la combinación de estrategias múltiples tanto experimentales como de modelado. En particular, el amplio rango de escalas espaciales y temporales involucradas no puede ser abarcado con un unico tipo de experimentos y es entonces que la elaboración de modelos que permitan conectar observaciones dispares se vuelve indispensable. Por otro lado, para que los modelos puedan cumplir este rol es necesario contar con estimaciones confiables, idealmente obtenidas in situ, de algunas de las cantidades que caracterizan a los fenómenos físicos y químicos involucrados en las señales. El objetivo de esta Tesis ha sido avanzar en la obtención de estas estimaciones realistas realizando experimentos opticos y desarrollando el marco teórico necesario para extraer información cuantitativa de los mismos. Una de las propiedades pobremente caracterizadas es la tasa a la que el calcio se transporta dentro de las células. Existen distintas técnicas opticas para estimar coeficientes de difusión, entre las que se encuentran la espectroscopía de correlación de fluorescencia (FCS) o la recuperación de fluorescencia tras fotoblanqueo (FRAP). La aplicación de las mismas al caso del calcio no es totalmente directa, ya que este ión no sólo difunde al entrar al citosol a través de canales específicos, sino que también reacciona con distintas sustancias (“buffers”) que poseen las células. Para describir este tipo de transporte es posible definir coeficientes efectivos, que contienen información sobre la difusión y las reacciones. Estudios preliminares habrán mostrado la existencia de más de un coeficiente de este tipo. Una de las contribuciones de esta Tesis ha sido estudiar de forma detallada la información que es posible extraer a partir de experimentos de FCS en donde la sustancia observada difunde y reacciona. En particular, se demostró que las técnicas de FCS y FRAP brindan información sobre coeficientes distintos, que puede ser combinada para inferir tasas de reacción yo de difusión libre. Se realizó este estudio teórico para el caso en que la sustancia de interés está marcada fluorescentemente y cuando existen moléculas marcadas y no marcadas en el mismo sistema. Parte de los resultados fueron aplicados para explicar las diferencias observadas en experimentos de FCS y FRAP, realizados para deter minar el coeficiente de difusión del producto del gen bicoid en embriones de moscas Drosophila melanogaster, una sustancia fundamental para el establecimiento del eje dorsoventral en este organismo. La aplicación de técnicas opticas para estudiar el transporte de calcio en células presenta dificultades adicionales. En primer lugar, la observación de la distribución del calcio se hace de modo indirecto, mediante fluoróforos que reaccionan con este ión y cambian sus propiedades espectrales como por ejemplo, aumentar notablemen te la fluorescencia al ligar calcio. Es decir, la sustancia observable (indicador ligado a calcio) está permanentemente transformándose en otra. Por otro lado, para poder inferir a partir de ella la distribución de calcio libre es necesario conocer propiedades del indicador que típicamente no son provistas por quienes lo comercializan, como por ejemplo, los coeficientes de difusión. Otra de las contribuciones de esta Tesis ha sido establecer las bases para la determinación de los coeficientes de difusión y tasas de reacción del calcio y sus fluoróforos, en células. Para tal fin se hicieron, en primer lugar, experimentos de FCS en distintos tipos de soluciones conteniendo calcio e indicador. Se trabajó simultáneamente en los desarrollos teóricos necesarios para el análisis de los mismos. De su aplicación se pudieron determinar coeficientes de difusión y parámetros de reacción en solución. Entre los experimentos se realizó un subconjunto conteniendo calcio, indicador y un “buffer” adicional. A partir del estudio detallado de estos ultimos se elaboró una propuesta de cómo obtener estos coeficientes en células intactas donde las propiedades de los “buffers” presentes son desconocidas. La versatilidad de las señales intracelulares de calcio depende, entre otras cosas, de la distribución espacial y de la cinética de los canales a través de los cuales los iones ingresan al citosol. Entre estos, los receptores de inositol (1,4,5)-trifosfato (IP3 R) constituyen una de las vías más importantes para este ingreso. Estos canales se encuentran en la membrana del retículo endoplasmático organizados en cúmulos que se supone son de unos 100 nm de lado y que están, a su vez, separados por algunos milímetros entre sí. Los canales se abren cuando ligan calcio e IP3 R el que, en condiciones fisiológicas, es sintetizado a partir de elementos presentes en la membrana plasmática cuando la célula recibe una señal. La distribución inhomogénea de los canales junto con el efecto del calcio liberado sobre la probabilidad de aper- tura se combinan para dar lugar a una jerarquía de señales que van desde las muy localizadas hasta las ondas que viajan por toda la célula. Contar con información cuantitativa sobre la geometría de los cúmulos y sobre la cinética de los canales in situ es fundamental para entender la variedad de señales que pueden evocarse. Experimentalmente es posible observar las señales usando los fluoróforos antes mencionados e induciendo la apertura de los canales con IP3 , que es introducido en la célula en forma enjaulada y posteriormente fotoliberado con luz ultravioleta. Otra de las contribuciones del presente trabajo de Tesis ha sido el diseño e implementación de una adaptación relativamente barata de un microscopio confocal Olympus FV1000 para realizar este tipo de experimentos. La habilidad del sistema para fotolizar compuestos enjaulados fue comprobada en distintas situaciones experimentales. Por otro lado, la potencia que llega a la muestra y el tamaño de la zona iluminada fueron cuantificados. Finalmente, en el trabajo se ha mostrado también que con esta adaptación es posible generar un est ́mulo preciso y controlado de IP3 simultáneamente a la obtención de imágenes confocales de señales de calcio, registrando y caracterizando a las mismas en ovocitos de Xenopus Laevis.

El trigo es considerado actualmente el principal cultivo a escala mundial. Es una de las especies vegetales más consumidas del mundo junto con el arroz, el maíz y la papa. Una de las enfermedades que afecta a este cultivo es producida por Pyrenophora tritici-repentis (Died.) Drechs. se la conoce como “mancha amarilla” considerada internacionalmente como la enfermedad del trigo que más se relaciona con las prácticas de laboreo que dejan los restos culturales en la superficie del suelo.El objetivo de este trabajo fue aportar información acerca del patosistema Triticum aestivum - P. tritici-repentis, en cuanto a conocer la composición de aislamientos del patógeno asociados a cultivos de trigo locales, su caracterización morfobiométrica y bioquímica, su variabilidad patogénica y la respuesta de cultivares frente a la infección del hongo. En este estudio se generó una colección de 155 aislamientos nativos de Pyrenophora triticirepentis, los cuales fueron caracterizados morfoculturalmente en 44 morfotipos los que se agruparon en ocho grupos a una distancia de similitud del 50%. Para evaluar el espectro de virulencia del total de los aislamientos se realizaron dos pruebas de patogenicidad una en el año 2003 y una en el 2004 sobre cultivares nacionales y extranjeros, determinándose especialización fisiológica para 19 y 33 aislamientos respectivamente. Por otra parte se llevaron a cabo estudios con marcadores de tipo isoenzimáticos, se revelaron el total de los aislamientos bajo el sistema de estearasas, fosfatasas y peroxidasas. Para el primero de ellos se observaron dos alelos con cinco variantes cada uno y para los otros dos un alelo con cinco y cuatro variantes respectivamente. Del análisis de los genotipos se obtuvieron 12 grupos para una distancia genética del 50%. En ninguno de los estudios se observó correlación entre el comportamiento propio de cada aislamiento y el origen geográfico o de cultivar. Tampoco se observó asociación entre los diferentes caracteres evaluados. Si se observó que 31 grupos de aislamientos a pesar de ser de origen diferente se comportaron de manera similar independientemente del estudio realizado.

Tesis de doctorado para obtener el grado de Doctora en Ciencias Biológicas, presentada en la Universidad Nacional de Tucumán, Facultad de Agronomía y Zootecnia en diciembre de 2018

Tomato spotted wilt virus (TSWV) (Tospovirus, Bunyaviridae), agente etiológico de la enfermedad ‘peste negra’, se encuentra entre los diez virus más devastadores, ocasionando considerables pérdidas económicas en cultivos hortícolas del mundo. Su genoma está compuesto por tres segmentos de RNA de cadena simple: ¨Small¨ (S), ¨Medium¨ (M) y ¨Large¨ (L). El RNA S es ambisense y codifica dos proteínas: la NSs, proteína no estructural y supresora del silenciamiento génico, y la nucleocápside (N). El RNA M también es ambisense y codifica las proteínas NSm, proteína de movimiento célula a célula del virus y el precursor de las glicoproteínas Gn y Gc de la envoltura. El RNA L es de polaridad negativa y contiene un único ORF que codifica la polimerasa (RdRp). El control de la ‘peste negra’ es muy complejo principalmente debido al amplio rango de hospedantes tanto del TSWV como del vector, diferentes especies de trips (Thysanoptera, Thripidae), y a la inefectividad de los insecticidas para el control del mismo. La utilización de cultivos resistentes, es la estrategia de manejo más adecuada y más sustentable, la cual se ha aplicado tanto para pimiento como para tomate. En pimiento la resistencia a TSWV ha sido adquirida mediante el gen Tsw de Capsicum chinensis, el cual se introgresó a pimientos comerciales (pimientos Tsw+). En tomate, la fuente de resistencia está dada por el gen Sw-5b, proveniente de la especie silvestre Solanum peruvianum L. Este gen también ha sido incorporado por mejoramiento clásico, obteniéndose los cultivares de tomate Sw-5b+. En el Cinturón hortícola platense (CHP) se incorporaron variedades de pimiento Tsw+ y de tomate Sw-5b+, controlando la enfermedad durante varios años, pero en 2008 comenzaron a observarse plantas de pimiento Tsw+ con sintomatología de ‘peste negra’. Esto sugería la emergencia de una nueva población viral, capaz de quebrar la resistencia. En este trabajo de tesis, se realizó una caracterización genotípica y biológica de 6 aislamientos provenientes de pimientos Tsw+, y 5 aislamientos de tomates Sw-5b-. Así, se determinó que la única especie de tospovirus presente en el CHP es TSWV, se estudió el rango de hospedantes de los aislamientos y su comportamiento en distintos cultivares de pimientos Tsw+ y Tsw-, y de tomate Sw-5b+ y Sw-5b-. Estos estudios confirmaron la capacidad de los aislamientos de quebrar la resistencia conferida por el gen Tsw en pimiento, caracterizándose como aislamientos RB (resistance-breaking). Estos aislamientos RB, además, tienen la capacidad de infectar pimientos Tsw- y tomates Sw-5b-, no infectando tomates Sw-5b+. Esto indica que no se observa un quiebre de resistencia en tomate, en ensayos de invernáculo. Con los aislamientos encontrados tanto en pimiento como en tomate, se realizaron análisis filogenéticos en base a la secuencia del gen N, encontrándose que los mismos provienen de una misma población ancestral y se hallan filogenéticamente relacionados a aislamientos del clado asiático (China y Corea del Sur). Mediante el análisis de mutaciones en la secuencia de la proteína NSs de los RB de pimiento, asociadas al quiebre de la resistencia, de nuestros aislamientos y otros aislamientos RB, no se observó un patrón de sustituciones aminoacídicas que se conserve entre todos los RB anotados en el GenBank. Por tanto, no se puede inferir el tipo de aislamiento de TSWV mediante la secuencia del gen NSs. La adaptación de los aislamientos RB a pimientos Tsw+ podría significar un costo en el fitness en hospedantes Tsw-. Por lo tanto, se realizaron ensayos que permitieron determinar el fitness de un aislamiento representativo, en pimientos Tsw+ y Tsw-, donde se cuantificó el título viral (mediante la optimización de un protocolo de RT-qPCR específico). Los resultados mostraron que existe una mayor diferencia en el fitness entre los cultivares Tsw+ que la observada con el cultivar Tsw-. Esto sugiere que la presencia del gen Tsw no sería el único factor que interviene en el fitness de los aislamientos y que la adaptación de los RB a pimientos Tsw+, no significó un costo en el fitness en cultivares Tsw-. En cuanto a los 5 aislamientos de tomate, se determinó la secuencia del gen NSm, con el fin de conocer la presencia de sustituciones aminoacídicas características de aislamientos RB de tomate. Los análisis mostraron que estos aislamientos son WT (wild-type) para tomate, lo cual concuerda con los resultados de los ensayos biológicos, que muestran que estos 5 aislamientos no son capaces de infectar tomates portadores del gen Sw-5b.

La Fusariosis de la espiga de trigo o Fusarium Head Blight en trigo es una enfermedad severa a nivel mundial, en Argentina al menos 20 epidemias de variable intensidad se han registrado en los últimos 50 años. Fusarium graminearum sensu stricto es el principal agente etiológico de la enfermedad para esta región. Como resultado de la infección, los granos de trigo ven modificada tanto su composición química como sus propiedades físicas con la consiguiente alteración de características de calidad en los productos de panificación. Los daños ocasionados por la infección se agravan por la presencia de micotoxinas, las cuales son perjudiciales tanto para la salud humana como animal. La constitución física de los granos se relaciona con su textura y dureza, y su composición química, define el valor nutricional y las propiedades tecnológicas de las harinas. Los mercados son cada vez más exigentes y se interesan por el contenido de proteínas, aminoácidos, almidón, aceites, lípidos y demás componentes, y paulatinamente se reduce la tolerancia a sustancias contaminantes y/o micotoxinas. Dentro de los principales criterios para la determinación de la calidad de los granos se encuentran: el contenido y constitución de las proteínas, variables de rendimiento como ser la pérdida de peso en los granos por espiga y el peso de mil granos, y presencia de micotoxinas. La calidad el gluten de las harinas de trigo depende de la constitución genética de la planta así como de diversos factores ambientales e interacciones con microorganismos. La variación alélica en las fracciones de gluteninas de alto peso molecular (HMW-GS) está directamente relacionada con las propiedades físicas de la masa elaborada a partir de estas harinas. La micotoxina deoxinivalenol (DON) es la que se relaciona en primer término con la enfermedad, por lo cual se la considera una toxina indicadora de infección. Esta Tesis Doctoral aporta conocimientos relacionados con la diversidad genética de la especie Fusarium graminearum y el daño producido en granos de trigo, en cuanto a cambios composicionales y presencia de toxinas, en relación a cambios de calidad.

El Virus de la Diarrea Viral Bovina (BVDV) pertenece al género Pestivirus de la familia Flaviviridae y es causante de importantes pérdidas económicas en la industria ganadera regional y mundial. Las manifestaciones clinicas de la infección son variadas y las pérdidas en la producción ganadera se deben principalmente a la disminución en la producción de leche, retraso en el crecimiento, aumento de infecciones secundarias y aumento de la mortalidad en animales jóvenes. El control epidemiológico de BVDV se realiza a través de programas de vacunación masiva y eliminación de animales persistentemente infectados, principales diseminadores del virus en los rebaños. Los bajos títulos virales obtenidos en cultivo de tejidos constituyen una dificultad importante en la elaboración industrial de vacunas inactivadas. La utilización de cepas atenuadas como vacunas anti BVDV es, por otra parte, un riesgo mayor ya que la aparición de revertantes en un animal pre-infectado con BVDV podría desencadenar la “enfermedad de las mucosas”, que es fatal y en vacas preñadas podría dar origen a una camada de terneros persistentemente infectados. El diagnóstico de las infecciones con BVDV, realizada a través de la detección de anticuerpos en suero bovino por seroneutralización y/o inmunoensayo enzimática (ELISA) también presenta dificultades debidas, entre otras, a la necesidad de contar con infraestructuras adecuadas para el cultivo de células y a los desafios técnicos que presenta la obtención de antígeno purificado. En este trabajo se expresó en sistemas recombinantes y se caracterizó bioquímica e inmunológicamente al principal inmunógeno de BVDV, la glicoproteína E2. La proteína fue expresada en células de mamífero y de insecto, en su forma entera (rE2) y delecionada en su extremo carboxilo terminal de anclaje a membrana (ΔrE2) y se ensayó su desempeño como vacuna y como antígeno para diagnóstico. La proteína recombinante E2 (rE2) presento características electroforéticas e inmunoquímicas idénticas a la E2 viral y resultó ser un potente inmunógeno en bovinos. La incorporación del gen de rE2 en el genoma de un Virus de la estomatitis vesicular (VSV) recombinante permitió, también , la creación de un virus atenuado de VSV (VSV-E2) capaz de inducir una excelente respuesta humoral anti BVDV en ratones y óptima producción de E2 recombinante en células de BHK en cultivo. En este trabajo también se demostró que la proteína ΔrE2 es expresada y liberada al sobrenadante del cultivo de células de Drosophila melanogaster lo que permitió contar con una preparación rápida y relativamente pura de antígeno. Este fue utilizado en un test de ELISA de captura (a través de un anticuerpo monoclonal anti rE2, también desarrollado en el curso de este trabajo de Tesis) que presenta alta sensibilidad y especificidad para la detección de anticuerpos anti BVDV en sueros bovinos.

La mayor parte de la literatura sobre análisis de rendimiento de programas paralelos está orientada a la optimización a cargo del programador. Por lo tanto, supone conocimiento de los algoritmos empleados, su orden de complejidad, su forma de implementación, y en definitiva, asume acceso a los fuentes de esos programas. El instrumental disponible de análisis de rendimiento se basa mayormente, entonces, en propiedades estructurales de los programas, que sólo se hacen evidentes a partir del código fuente. Sin embargo, en ocasiones el analista de rendimiento en Cómputo de Altas Prestaciones se enfrenta al problema de optimizar la ejecución de aplicaciones en cuyo desarrollo no ha intervenido, y de las cuales sólo se tiene la versión final ejecutable. Otras veces se dispone de los fuentes, pero su interpretación es de todos modos costosa, debido a la complejidad de estudiar código escrito por terceros, o debido a la dificultad de comprender el dominio del problema. Si se dispone únicamente de los programas en su versión binaria, las técnicas de predicción de prestaciones que se apoyan en el conocimiento de los fuentes no pueden ser aplicadas, y el analista debe normalmente proceder por ensayo y error. El trabajo que se propone intenta identificar una metodología conveniente para obtener conocimiento acerca de las aplicaciones, en ausencia del código fuente, que permita hacer inferencias sobre su rendimiento en diferentes plataformas, existentes o hipotéticas, con el fin de seleccionar las mejores plataformas para cada aplicación.