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La miel es un alimento natural elaborado por las abejas melíferas y como tal, presenta una microbiota propia al igual que el resto de los alimentos. Las especies bacterianas formadoras de esporas de los géneros Bacillus y Paenibacillus aparecen en forma frecuente, y, dentro de ellas, se cita Bacillus cereus sensu stricto que está asociada a procesos infecciosos humanos como productora de enterotoxinas. En la miel también pueden encontrarse bacterias causantes de enfermedades de las abejas como la loque americana, ocasionada por Paenibacillus larvae, y la loque europea, producida por Melissococcus plutonius. Durante muchos años, estas enfermedades se trataron con el antibiótico oxitetraciclina, generando la aparición de resistencia de los agentes microbianos que se querían controlar con la consiguiente aplicación de dosis cada vez mayores, y la contaminación de la miel con residuos de estas sustancias. El aumento de la prevalencia de la resistencia antimicrobiana en bacterias patógenas, es el resultado de la evolución y la presión selectiva debido a la amplia implementación del uso de antibióticos en medicina humana, medicina veterinaria, alimentación animal y agricultura. Esta adaptación ocurre, no por la mutación de las poblaciones amenazadas, sino mayormente por la adquisición y diseminación de genes simples de resistencia a antibióticos mediante elementos genéticos móviles, tales como plásmidos y transposones. Estos elementos móviles distribuyen eficientemente los determinantes de resistencia a antibióticos, individualmente o en grupos, entre muchos géneros y especies bacterianas. En el caso de las tetraciclinas, la resistencia se debe a la adquisión de genes tet (tetraciclina) y otr (oxitetraciclina); frecuentemente estos genes están asociados con plásmidos y/o transposones conjugativos. Con el objetivo de investigar la presencia de determinantes de resistencia a tetraciclina, oxitetraciclina y minociclina en cepas de B. cereus y P. larvae aisladas de miel y materiales del apiario y su correlación con la presencia de plásmidos salvajes se aplicaron procedimientos de microbiología y biología molecular. Se analizó la presencia de los determinantes de resistencia a tetraciclina: Tet K, Tet L, Tet M, Tet O, Tet Q, Tet S, Tet A (P) y Otr A y se observó una alta correlación entre la presencia de plásmidos y fenotipos resistentes a tetraciclina. Mediante PCR, se detectó la presencia del determinante Tet L empleando como molde ADN plasmídico en un 76% de las cepas de B. cereus estudiadas y del determinante Tet M en la cepa B. cereus m383 con fenotipo resistente a tetraciclina, oxitetraciclina y minociclina cuando se utilizó como molde ADN genómico total, pero no así cuando se utilizó ADN plasmídico. Con respecto al resto de los determinantes de resistencia analizados (Tet K, Tet O, Tet Q, Tet S, Tet A (P) y Otr A), no se observó producto de amplificación alguno en las cepas estudiadas, ni en ADN genómico total ni en ADN plasmídico. Se realizaron ensayos de conjugación entre cepas resistentes y sensibles, y de transformación por electroporación con ADN plasmídico obtenido de cepas resistentes, demostrando una transferencia horizontal de genes de resistencia a tetraciclina entre la cepa de B. cereus m401, resistente a tetraciclina, y las cepas de B. cereus ATCC 11778 NALR y B. pumilus m350 NALR, sensibles a tetraciclina. Se obtuvieron transconjugantes con fenotipo resistentes a tetraciclina para ambas cepas aceptoras, pero no se obtuvieron transformantes en los ensayos de electroporación. Mediante el análisis de los resultados de la secuenciación del genoma completo de la cepa de B. cereus m401 se confirmó la presencia de 3 plásmidos, a los cuales denominamos pBCm401a, pBCm401b y pBCm401, de 8.307 pb, 9.934 pb y 69.591 pb, respectivamente. Luego del análisis de las anotaciones funcionales de los genes codificantes de proteínas obtenidos en estos 3 plásmidos no se encontraron genes que codifiquen funciones relacionadas con resistencia a tetraciclina. Al no encontrar en ninguno de los tres plásmidos genes que codifiquen resistencia a tetraciclina, se efectuó la búsqueda de dichos genes en el resto de los contigs obtenidos del genoma (n=46). Luego del análisis de las anotaciones funcionales se detectó un contig (contig09) de 243.988 pb conteniendo un gen de resistencia a tetraciclina de 1.377 pb (contig09_orf00135) con alta homología a los genes tetK, tetL y tet45, que codifican para proteínas de eflujo. Según el análisis efectuado en la base de datos del servidor GenBank mediante la herramienta BLASTn, este contig se correspondería con secuencias similares pertenecientes a megaplásmidos de B. cereus y B. thuringiensis. Los resultados del análisis del alineamiento de la secuencia correspondiente al gen de resistencia a tetraciclina presente en el contig09 con secuencias correspondientes a los genes de resistencia tetK, tetL y tet45 permitieron concluir que el gen de resistencia a tetraciclina presente en la cepa m401 se correspondería con el gen tet45, ya que muestra mayor homología (93%) con la secuencia de dicho gen, con respecto a los genes tetL (80%) y tetK (64%). Por todo lo expuesto, se puede concluir que este trabajo es el primer registro de la presencia del gen de resistencia tet45 en un posible megaplásmido de B. cereus.

Tesis para obtener el grado de Magíster Scientiae en Intervención Ambiental con orientación en Ingeniería Ambiental, de la Universidad Nacional del Comahue, en marzo de 2012

En los organismos aerobios el oxígeno es esencial para la producción eficiente de la energía aunque produce estrés oxidativo en las células. El estrés oxidativo se origina cuando la producción de especies reactivas de oxígeno (EROs) excede la capacidad de defensa antioxidante de las células para eliminarlas. Todos los organismos vivos están constantemente expuestos a agentes oxidantes que derivan de fuentes endógenas y exógenas capaces de alterar las biomoléculas y producir daños celulares e incluso apoptosis. Los organismos aeróbicos tienen sistemas de protección que le permiten la adaptación al entorno oxidativo. La carpocapsa, Cydia pomonella (L.) (Lepidoptera: Tortricidae), es una importante plaga de los frutales de pepita en el mundo y es de importancia cuarentenaria en Argentina. En la región de la Patagonia Norte, para la producción de peras y manzanas, se ha tornado en un factor crítico de extrema gravedad debido a que resulta limitante para el mantenimiento y la expansión del agronegocio frutícola al condicionar el mercado externo. El control de carpocapsa es fundamental para lograr una producción sustentable y con calidad de exportación. Su control se ha realizado mediante la aplicación intensiva de insecticidas neurotóxicos de amplio espectro, muy utilizados en la última década. En la actualidad han sido reemplazados por otros grupos de insecticidas más específicos. Además, los programas de manejo integrado de plagas - MIP-, que emplean herramientas sustentables en el tiempo y seguras para el medioambiente, como el uso de bioinsecticidas y prácticas culturales, permiten la optimización del control de la plaga. El objetivo de este trabajo fue evaluar biomarcadores del sistema antioxidante y de daño oxidativo en organismos adultos de C. pomonella de diferentes poblaciones de campo y de una cepa de referencia o laboratorio y estudiar el efecto sobre estos parámetros de la exposición in vivo al insecticida clorantraniliprol. Los parámetros del sistema antioxidante evaluados fueron: las enzimas glutatión S-transferasa (GST), catalasa (CAT) y superóxido dismutasa (SOD) y los biomarcadores del daño oxidativo: nivel de glutatión endógeno (GSH) y malondialdehído (MDA). También, se evaluó sobre estos parámetros bioquímicos el efecto de la exposición durante 24 h a concentraciones crecientes (0; 12,5; 25; 50; 100; 1000 y 2000 mg x L -1 ) del insecticida clorantraniliprol formulación comercial Coragen ® 20 SC. Se recolectaron larvas diapausantes de C. pomonella de ocho huertos con manejo convencional, orgánico y sin tratamiento de la Patagonia Argentina, mediante bandas de cartón corrugado, durante las temporadas 2012 y 2013. Como población de referencia se utilizaron larvas de carpocapsa procedentes de una colonia de laboratorio, provista por el INTA Alto Valle. Se conservaron a 4°C para satisfacer las necesidades de frío hasta la emergencia de los adultos. Las actividades GST detectadas en las polillas de C. pomonella provenientes de todas las poblaciones de campo analizadas resultaron significativamente menores a la observada en los organismos de la cepa de laboratorio. La actividad CAT en los individuos provenientes de Gral. Roca1 fue estadísticamente diferente y resulto 2,13 veces menor a la determinada en la población de referencia. No se encontraron diferencias significativas en la actividad SOD en las diferentes poblaciones ensayadas. A excepción del nivel de GSH obtenido en la población de Sarmiento2 y de Gral. Godoy, las otras poblaciones de campo analizadas presentaron niveles significativamente menores en comparación con el de la cepa de laboratorio. El nivel de GSH medido en insectos adultos de Sarmiento2 resultó significativamente mayor al determinado en los individuos de laboratorio (34,90 ± 2,10 nmoles GSH x mg proteína -1 y 22,17 ± 0,48 nmoles GSH x mg proteína -1 , respectivamente). El nivel de GSH en las polillas de Gral. Godoy fue similar al detectado en la cepa de laboratorio (20,64 ± 1,14 nmoles GSH x mg proteína -1 ). Se determinaron niveles similares de MDA en las polillas de referencia, Centenario y Sarmiento2 que resultaron significativamente mayores a los obtenidos en las poblaciones de Sarmiento1, Gral. Godoy y Allen. La exposición de insectos adultos de C. pomonella a concentraciones crecientes de clorantraniliprol no produjo mortalidad; no obstante se detectó una notable letargia en los individuos expuestos que resultó dependiente de la concentración del tóxico. No se observaron cambios significativos en la actividad CAT ni en el nivel de GSH endógeno en las polillas de carpocapsa expuestas a clorantraniliprol. La exposición de insectos adultos a 50 mg x L -1 del insecticida -equivalente a la dosis de aplicación a campo- durante 24 h causó disminuciones significativas de las actividades GST y SOD (36,4% y 52,5%, respectivamente) y en el nivel de MDA (56,8%,) comparados con los niveles determinados en los organismos control. Este estudio es una contribución al conocimiento creciente de la fisiología de C. pomonella que posibilitará una mejor interpretación de su respuesta bioquímica a la exposición al insecticida clorantraniliprol, lo que resultará en la optimización del control de esta importante plaga. Los resultados obtenidos en este trabajo de tesis demuestran que las alteraciones observadas en los biomarcadores de estrés oxidativo, nivel de GSH endógeno y actividad GST, sugieren la exposición a contaminantes y/o factores ambientales prooxidantes de adultos de C. pomonella provenientes de diferentes huertos de la Patagonia Argentina.

El persistente y excesivo uso de plaguicidas causa una grave contaminación y deterioro del suelo cultivable y del ambiente que lo rodea. En Argentina son cada vez más los estudios que detectan plaguicidas en agua superficial, subterránea, sedimentos, biota acuática y terrestre, por lo que es relevante estudiar su dinámica en suelos y evaluar posibles vías de mitigación para evitar que estos funcionen como fuente difusa de contaminación y para asegurar alimentos de calidad. En la presente tesis, el objetivo fue evaluar estrategias de biorremediación para acelerar la degradación de dos de los insecticidas más utilizados en el país durante una década: un organoclorado, el endosulfán, y un organofosforado, el clorpirifos. Los ensayos fueron mayormente en microcosmos con suelo proveniente del cinturón hortícola platense y aplicando dosis conocidas de los plaguicidas. Se definieron metodologías de extracción de plaguicidas y los análisis se realizaron por CG-ECD. Se estudió la atenuación natural, la bioestimulación y la fitorremediación de dichos compuestos y se obtuvieron curvas de degradación y vidas medias para cada experimento. Entre los hallazgos principales se encontró que la acción de la microbiota edáfica es la principal responsable de la degradación de estos insecticidas. En el caso del clorpirifos, demostró ser poco persistente y la atenuación natural logra concentraciones inferiores a límite de detección. El endosulfán persistió en bajas concentraciones. La biodegradación puede ser intensificada a través del agregado de materia orgánica (bioestimulación), el okara, un subproducto derivado de la soja, una vez hidrolizado es un bioestimulante efectivo para el clorpirifos; el bokashi, un abono orgánico, y la cama de pollo para el endosulfán. En todos los casos se detectó la acumulación de endosulfán sulfato. Estos resultados mostraron la gran cantidad de respuestas que puede tener un plaguicida en suelo incluso en condiciones controladas y que la tarea de descontaminar un suelo requiere de una estrategia hecha a medida.

En Argentina el trigo pan (Triticum aestivum) se comercializa mediante la Norma XX de Senasa -TRIGO PAN- estableciendo que la mercadería debe estar libre de insectos vivos. La prevención es la principal herramienta de un sistema de Control Integrado de Plagas (CIP), basado en una combinación de limpieza con aireación o refrigeración artificial para bajar la temperatura de los granos, creando condiciones desfavorables para el desarrollo de insectos, y utilizando el control químico solo cuando es estrictamente necesario. A su vez, esta práctica tiene beneficios adicionales, como reducir la tasa de respiración y el deterioro de los granos. Bajo ciertas condiciones climáticas, la aireación no logra bajar la temperatura de la masa de granos por debajo del límite de actividad de insectos (17 °C). Para estas situaciones, la refrigeración artificial puede ser una alternativa a la aireación a fin de mantener las condiciones deseables de almacenamiento, a baja temperatura, sin el uso de protectores químicos. El objetivo del presente estudio fue validar y utilizar un modelo de simulación para aireación y refrigeración artificial de granos, evaluando técnica y económicamente la aplicación de ambas tecnologías sobre trigo en diferentes condiciones climáticas de Argentina en el marco de una estrategia de CIP. El modelo de simulación predice cambios de temperatura y humedad en diferentes capas de granos teniendo en cuenta los fenómenos de transferencia de calor y masa entre el aire y el grano, utilizando datos climáticos, horarios de temperatura y humedad relativa ambiente y condiciones de temperatura y humedad iniciales del grano. En el caso de aireación el modelo simula la estrategia prescripta de encendido y apagado de los ventiladores, mientras que en refrigeración simula el funcionamiento de un equipo de refrigeración bajo las condiciones climáticas fluctuantes. La validación del modelo para refrigeración se realizó con datos propios realizando un ensayo a escala real refrigerando un silo con 1138 t de trigo, mientras que la validación para aireación se hizo con datos de la literatura. El modelo de simulación predijo los cambios de temperatura del grano de manera aceptable, con un error estándar de 2,17 °C y 1,7° C y un promedio en valor absoluto de los residuales de 1,94 °C y 1,41 °C para aireación y refrigeración artificial, respectivamente. Estos valores estadísticos son equivalentes a los reportados en la validación de modelos similares. Una vez obtenidas mediante simulación las temperaturas máxima y promedio para 5 localidades (promedio de varios años), se determinó la necesidad de complementar el programa de CIP con control químico preventivo (temperatura promedio mayor a 17 °C) y/o curativo (temperatura máxima de la capa superior mayor a 17 °C). A su vez, una vez superados los 17 °C en la temperatura promedio y máxima, se consideró una mayor dosis de insecticida cuanto mayor fue la temperatura lograda. Las temperaturas del grano logradas con aireación natural durante el principio del verano (cosecha del trigo) no resultaron lo suficientemente bajas como para limitar el desarrollo de insectos en ninguna de las localidades consideradas. La menor temperatura promedio fue de 19,2 °C en Balcarce y la mayor de 22,2 °C en Manfredi. Como resultado, la aireación siempre debió ser complementada con el control químico preventivo y/o curativo, aumentando el costo del CIP. La mayor incidencia de costos corresponde al uso de insecticidas (protectantes y fumigantes), con el 97 % del total. Con refrigeración artificial siempre se logró enfriar la masa de grano por debajo de los límites prescriptos. Sin embargo, las mayores temperaturas ambiente aumentan los tiempos de refrigeración y los consumos de energía. Por cada un 1°C de aumento de temperatura ambiente entre los 14,8 °C y 31,2 °C, el tiempo de refrigeración aumenta 2 horas y el consumo específico 0,11 kWh.t-1. La mayor incidencia de costos se debe al alquiler del equipo de frío, con el 84% del total. Los resultados demostraron que las temperaturas del grano logradas mediante refrigeración fueron menores que aquellas logradas con aireación. Con respecto del consumo de energía, la refrigeración artificial fue más demandante (1,69 kwh.t-1 contra 0,29 kwh.t-1 para aireación), sin embargo al reducir o eliminar la necesidad del control químico las diferencias económicas entre ambas tecnologías son escasas. La conveniencia de una u otra técnica estará en función de la practicidad de cada una, tiempo de enfriamiento necesario, calidad final del grano o nivel demandado de residuos de insecticidas sobre el grano, entre otras.

El pulgón ruso del trigo (PRT), Diuraphis noxia (Kurdjumov) es una de las plagas más dañinas que atacan al cultivo de trigo y cebada, provocando pérdidas considerables en la producción. Este áfido ha evolucionado en numerosos biotipos existiendo al menos tres en Argentina, con características diferenciales a los de otras latitudes. Si bien se han identificado genes de resistencia biotipo-específicos, dentro del manejo integrado de plagas es crítico evaluar las fuentes de resistencia y los materiales nóveles con las poblaciones locales de las plagas. Por esa razón, el objetivo de la presente tesis ha sido estudiar el efecto antibiótico de líneas recombinantes (LR) experimentales de trigo (T. aestivum) sobre los parámetros biológicos del PRT (periodo prereproductivo –d-, reproductivo -PR-, Md, fertilidad total -FT-, supervivencia -LNG- y Tasa intrínseca de incremento poblacional - rm. Se evaluaron 113 LR y ambos padres (Opata y Sintético 6X) sobre los que se registró el ciclo y reproducción del biotipo 5 del PRT. Todos los parámetros estudiados en los áfidos presentaron diferencias significativas entre los genotipos usados. Se identificaron tres líneas antibióticas que alargaron el período prereproductivo (d), la línea más antibiótica incrementó el período d en un 40% con relación a la media poblacional. En el parámetro Md se encontraron cuatro líneas que condicionaron una disminución del 77%. El período reproductivo (PRP) resultó significativamente menor en las mismas LR, que en este caso indujeron una reducción del 78% del PRP en relación a la media de la población. La fertilidad total (FT) fue significativamente reducida en los áfidos criados en las LR más antibióticas, con niveles 89% menores a los de la media de la población. La duración del ciclo de vida fue reducida en un 54% en los áfidos criados en las LR más antibióticas. La Tasa intrínseca de incremento poblacional (rm) presentó valores mínimos en los áfidos criados en las LR más antibióticas, que representaron una disminución del 67% en relación a la media de la población. Se identificaron tres LR con un significativo efecto antibiótico que alteró el ciclo biológico del PRT, estas líneas podrán utilizarse como fuente de genes de antibiosis en la obtención de nuevos cultivares resistentes.