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La presencia de Mn en aguas subterráneas para consumo humano causa problemas de orden estético y de aceptabilidad, organolépticos, operativos y sanitarios. Los métodos empleados para la remoción de Mn en el agua subterránea se pueden clasificar en: fisico-químicos y biológicos. En estos últimos, el Mn contenido en el agua es oxidado y precipitado con la ayuda de bacterias ambientales que suelen aparecer en forma natural en las aguas subterráneas que contienen Mn. Sin embargo, en estos procesos se alcanza una óptima remoción de Mn únicamente cuando los sistemas contienen comunidades bacteriana apropiadas, es decir, bacterias oxidantes de Mn y formadoras de biofilm.En este trabajo, se evaluaron los microbiomas de dos plantas de tratamiento biológico de aguas subterráneas que actualmente eliminan Mn(II) con alta eficiencia. Por otro lado, se cultivó un gran número de MOB conocidos y varios aislamientos que nunca antes se habían informado como MOB. La cepa MOB-181 del género Pseudomonas, se destacó de las demás por mostrar características de interés. La misma estuvo presente en el sistema de filtración de LT representando alrededor del 4 % del total de las Pseudomonas y pudo cultivarse con facilidad en el laboratorio. Asimismo, demostró buena capacidad de oxidación de Mn(II) en diferentes medios de crecimiento analizados; a diferentes temperaturas; y en presencia de metales inhibidores como el Fe y el propio Mn en altas concentraciones. Resultó ser una excelente formadora de biofilms y pudo oxidar Mn(II) presente en agua cruda mientras estuvo inmovilizada sobre arena. El estudio del rendimiento de la oxidación de Mn(II) de diferentes MOB aisladas en este trabajo permitió postular a MOB-181 como el mejor candidato con potencial para el desarrollo de un inóculo bacteriano aplicable para mejorar el proceso de eliminación de Mn(II) de aguas subterráneas.La oxidación de Mn y la formación de biofilms son dos características deseables para la elección de cepas con potencial uso en los procesos de remoción de Mn de aguas. A fin de determinar si estos dos procesos están relacionados en las MOB, se aplicaron ensayos de morfología de macrocolonia en agar y crioseccionamiento/microscopía para tratar de comprender la oxidación de Mn y la producción de EPS in situ en el modelo de biofilm de macrocolonia. Mediante el simple modelo de biofilm de macrocolonia, se pudo visualizar a los biofilms como sistemas biológicos complejos, donde los distintos grupos celulares están influenciados por un montón de factores, resultando en grupos de células diferentes dependiendo del entorno en el cual se encuentran.Finalmente, se construyó un sistema de filtros a escala laboratorio donde se evaluó la funcionalidad de la inoculación de filtros con MOB-181 en la remoción de Mn del agua. Se demostró que un ensayo de bioaumentación con esta bacteria fue capaz de acelerar el inicio de la remoción de Mn en aguas naturales. Asimismo, se observó que los tiempos requeridos para alcanzar la fase estacionaria de la remocion estaban fuertemente influenciados por las temperaturas, alcanzando más rapido la mayor eficiencia a temperaturas más altas. Estos resultados se utilizarán para optimizar los procesos de remoción de Mn de aguas y para el diseño de mejores tecnologías.

Tesis para obtener el grado de Magister en Gestión Ambiental, presentada en el Instituto Tecnológico de Buenos Aires en septiembre de 2015

Tesis de Maestría

Los hidrocarburos policíclicos aromáticos (PAHs) son contaminantes ambientales que llegan al ambiente vía combustión incompleta de crudo de petróleo y derrames accidentales de productos petroquímicos. A nivel ambiental, los PAHs son tóxicos comúnmente encontrados en suelos y sedimentos de zonas industriales, son electroquímicamente estables y pueden ser extremadamente tóxicos, poniendo en riesgo la salud humana y ecológica. Una técnica habitual para remediar zonas contaminadas consiste en la utilización de plantas, estrategia conocida como fitorremediación, que se basa en la acción combinada de las plantas y sus comunidades microbianas asociadas para degradar compuestos tóxicos ubicados en suelos. A fin de evaluar el potencial de la fitorremediación como una estrategia para reducir el impacto del fenantreno en el suelo y el rol de los exudados en el proceso, se analizó en un sistema de diferentes microcosmos la estructura y dinámica de las comunidades microbianas que intervienen en el proceso de rizodegradación y se cuantificó el fenantreno residual, la actividad deshidrogenasa y el número de hongos y bacterias. El capítulo 2 se centró en analizar comparativamente la cinética de la degradación del fenantreno en un suelo artificialmente contaminado e implantado con plántulas de M. sativa así como también evaluar la actividad degradadora de los microorganismos asociados. En el capítulo 3 se caracterizaron las comunidades microbianas de un suelo artificialmente contaminado con fenantreno e implantado con M. sativa y sus variaciones a lo largo del proceso. Por último, en el capítulo 4 se analizó el efecto de extracto de raíces de M. sativa sobre la remoción de fenantreno en un suelo artificialmente contaminado y sobre la comunidad microbiana asociada. Se observó que el tratamiento de fitorremediación estuvo asociado a una mayor riqueza y diversidad bacteriana. Aunque una sucesión de OTUs (Operational Taxonomic Unit) en el tiempo se detectó en los tratamientos, se demostró que las variables riqueza y diversidad están condicionadas por la concentración de fenantreno, que a la vez, según el tratamiento, poseen diferentes comunidades bacterianas. Según lo expuesto, a lo largo del proceso de fitorremediación existen cambios predecibles en la estructura de la comunidad bacteriana que pueden ser de utilidad para mejorar las técnicas de remediación de suelos contaminados con PAHs. En este estudio, la fitorremediación proporcionó una significativa reducción en el contenido de fenantreno en el suelo después de 56 días, con un 0,45 % residual comparado al tratamiento control (4,25 %).

Un biosensor es un dispositivo de reconocimiento molecular donde una biomolécula interactúa en forma altamente específica con un analito y donde el cambio químico producido en presencia del analito se traduce en una señal eléctrica procesable. Una de las etapas más importantes en el diseño de un biosensor es la de generar una estructura o superestructura, en la cual estén insertas las biomoléculas responsables de la respuesta del sensor. De esta etapa dependerán la actividad de la biomolécula, la sensibilidad, la especificidad y el ámbito de uso del biosensor. En este trabajo de tesis se estudiaron diversos aspectos de la inmovilización de enzimas y anticuerpos en el contexto de la construcción de electrodos enzimáticos para la detección de glucosa y de la construcción de sensores inmunológicos para detectar moléculas pequeñas a través de un ensayo competitivo. Para ello se utilizaron en forma complementaria distintas técnicas como la Microbalanza de Cristal de Cuarzo (QCM), la Elipsometría, la Microscopía de Fuerza Atómica (AFM)y diversas Técnicas Electroquímicas. Como técnicas de inmovilización se utilizaron la funcionalización covalente de superficies, el autoensamblado electrostático, el empleo de uniones de importancia biológica como avidina-biotina o antígeno-anticuerpo en la inmovilización de enzimas y el uso de proteínas orientadoras como proteína A y proteína G para la inmovilización de anticuerpos. En primer lugar se describe el uso de la microbalanza de cristal de cuarzo para estudiar sistemas autoensamblados en multicapas de glucosa oxidasa (GOx)y polialilamina derivatizada covalentemente con un complejo de Os: [Os(bpy)2ClPyCOH]+, (PAH-Os), depositadas sobre superficies de oro modificadas con ácido 3-mercaptopropansulfónico (MPS). Las etapas de adsorción del polímero y la glucosa oxidasa se repitieron alternadamente obteniendo cristales de cuarzo modificados hasta con 14 bicapas de polímero-enzima. El espesor elipsométrico, determinado a tres longitudes de onda, y la masa de las películas autoensambladas, determinadas por QCM en condiciones gravimétricas, se determinaron en contacto con solución de electrolito y en condiciones de sequedad y se estimó a partir de dichas mediciones la densidad de la película en ambas condiciones. Se plantea en esta tesis una estrategia general para la extracción de las propiedades viscoelásticas de peliculas autoensambladas por combinación de QCM y elipsometría. Por combinación del espesor y densidad estimados de la película, la expresión de la impedancia mecánica superficial del cristal de cuarzo, y la viscosidad y densidad del electrolito, se pudieron estimar los valores de los módulos de almacenamiento (G') y perdida (G") a 10 MHz para una película autoensamblada como función del espesor y el potencial de electrodo durante dos tipos de perturbaciones electroquímicas: voltametría cíclica y saltos de potencial. Una vez planteada la utilidad de ambas técnicas, QCM y elipsometría en el estudio de la construcción de películas autoensambladas, éstas se emplearon para el estudio del crecimiento de películas autoensambladas de glucosa oxidasa biotinizada y PAH-Os utilizando dos estrategias distintas de inmovilización de la enzima: la formación de una unión antígeno-anticuerpo y la formación de una unión avidina-biotina. Se estudió la cinética de adsorción de las biomoléculas y el grado de inespecificidad de las interacciones durante la inmovilización de la enzima. Se estudió además el comportamiento biocatalítico de la glucosa oxidasa biotinizada inmovilizada en las distintas estructuras autoensambladas y se llegó a la conclusión de que la eficiencia de la comunicación eléctrica entre las enzimas y el mediador se ve afectada tanto por el tipo de inmovilización de la enzima, como por la cantidad de centros redox del polímero de osmio por cada molécula de enzima. Las enzimas redox inmovilizadas en estructuras autoensambladas no solamente tienen aplicación en el diseño de electrodos enzimáticos, sino también en el desarrollo de biosensores inmunológicos. La formación de una unión antígeno-anticuerpo no genera una señal medible por lo cual se recurre al uso de sustancias marcadoras. La mayor parte de los inmunoelectrodos desarrollados últimamente están basados en el uso de enzimas oxidoreductasas como marcadoras. Además de los marcadores es necesario utilizar mediadores redox para transferir la carga entre el electrodo y el sitio redox de la enzima y revelar la actividad enzimática a través de la señal del mediador. De este modo la superficie del electrodo representa, tanto el transductor para la detección enzimática, como el soporte inerte sobre el cual se inmovilizan los antígenos o los anticuerpos. En este contexto se construyeron multicapas autoensambladas de PAH-Os y un anticuerpo, IgG antibiotina, con el objetivo de construir un biosensor modelo para la detección de moléculas pequeñas (como la biotina) a través de un ensayo competitivo, utilizando un marcador enzimático basado en peroxidasa de rábano, HRP-biotina. Con la técnica de EQCM se estudió la deposición de las multicapas, es decir la cantidad de IgG depositada en cada capa, los cambios viscoelásticos durante la adsorción, la cinética de adsorción para distintas concentraciones de IgG y el pegado del marcador o conjugado HRP-biotina. Con la técnica de AFM se observó la estructura y orientación de las moléculas de IgG adsorbidas sobre el polímero y finalmente con las técnicas electroquímicas se estudió el crecimiento de las bicapas y la utilidad de la supraestructura como biosensor, a través del estudio de la catálisis enzimática del conjugado. Finalmente se describen resultados preliminares sobre el uso de proteínas orientadoras, proteína A y G’, utilizadas para disminuir la inespecificidad del sensor y favorecer la reacción entre el antígeno y el anticuerpo inmovilizado. En conclusión, los resultados obtenidos confirman que la inmovilización de biomoléculas es por cierto una de las etapas más importantes en el desarrollo de un biosensor al afectar la respuesta del mismo. Además se muestra la necesidad de recurrir a distintas técnicas para su estudio y de este modo contrarrestar las limitaciones propias de cada técnica.