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Título de Acceso Abierto
Construcción y caracterización de estructuras complejas de biomoléculas con aplicación en el diseño de biosensores
Marcelo Javier Otero Ernesto Julio Calvo
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Resumen/Descripción – provisto por el repositorio digital
Un biosensor es un dispositivo de reconocimiento molecular donde una biomolécula interactúa en forma altamente específica con un analito y donde el cambio químico producido en presencia del analito se traduce en una señal eléctrica procesable. Una de las etapas más importantes en el diseño de un biosensor es la de generar una estructura o superestructura, en la cual estén insertas las biomoléculas responsables de la respuesta del sensor. De esta etapa dependerán la actividad de la biomolécula, la sensibilidad, la especificidad y el ámbito de uso del biosensor. En este trabajo de tesis se estudiaron diversos aspectos de la inmovilización de enzimas y anticuerpos en el contexto de la construcción de electrodos enzimáticos para la detección de glucosa y de la construcción de sensores inmunológicos para detectar moléculas pequeñas a través de un ensayo competitivo. Para ello se utilizaron en forma complementaria distintas técnicas como la Microbalanza de Cristal de Cuarzo (QCM), la Elipsometría, la Microscopía de Fuerza Atómica (AFM)y diversas Técnicas Electroquímicas. Como técnicas de inmovilización se utilizaron la funcionalización covalente de superficies, el autoensamblado electrostático, el empleo de uniones de importancia biológica como avidina-biotina o antígeno-anticuerpo en la inmovilización de enzimas y el uso de proteínas orientadoras como proteína A y proteína G para la inmovilización de anticuerpos. En primer lugar se describe el uso de la microbalanza de cristal de cuarzo para estudiar sistemas autoensamblados en multicapas de glucosa oxidasa (GOx)y polialilamina derivatizada covalentemente con un complejo de Os: [Os(bpy)2ClPyCOH]+, (PAH-Os), depositadas sobre superficies de oro modificadas con ácido 3-mercaptopropansulfónico (MPS). Las etapas de adsorción del polímero y la glucosa oxidasa se repitieron alternadamente obteniendo cristales de cuarzo modificados hasta con 14 bicapas de polímero-enzima. El espesor elipsométrico, determinado a tres longitudes de onda, y la masa de las películas autoensambladas, determinadas por QCM en condiciones gravimétricas, se determinaron en contacto con solución de electrolito y en condiciones de sequedad y se estimó a partir de dichas mediciones la densidad de la película en ambas condiciones. Se plantea en esta tesis una estrategia general para la extracción de las propiedades viscoelásticas de peliculas autoensambladas por combinación de QCM y elipsometría. Por combinación del espesor y densidad estimados de la película, la expresión de la impedancia mecánica superficial del cristal de cuarzo, y la viscosidad y densidad del electrolito, se pudieron estimar los valores de los módulos de almacenamiento (G') y perdida (G") a 10 MHz para una película autoensamblada como función del espesor y el potencial de electrodo durante dos tipos de perturbaciones electroquímicas: voltametría cíclica y saltos de potencial. Una vez planteada la utilidad de ambas técnicas, QCM y elipsometría en el estudio de la construcción de películas autoensambladas, éstas se emplearon para el estudio del crecimiento de películas autoensambladas de glucosa oxidasa biotinizada y PAH-Os utilizando dos estrategias distintas de inmovilización de la enzima: la formación de una unión antígeno-anticuerpo y la formación de una unión avidina-biotina. Se estudió la cinética de adsorción de las biomoléculas y el grado de inespecificidad de las interacciones durante la inmovilización de la enzima. Se estudió además el comportamiento biocatalítico de la glucosa oxidasa biotinizada inmovilizada en las distintas estructuras autoensambladas y se llegó a la conclusión de que la eficiencia de la comunicación eléctrica entre las enzimas y el mediador se ve afectada tanto por el tipo de inmovilización de la enzima, como por la cantidad de centros redox del polímero de osmio por cada molécula de enzima. Las enzimas redox inmovilizadas en estructuras autoensambladas no solamente tienen aplicación en el diseño de electrodos enzimáticos, sino también en el desarrollo de biosensores inmunológicos. La formación de una unión antígeno-anticuerpo no genera una señal medible por lo cual se recurre al uso de sustancias marcadoras. La mayor parte de los inmunoelectrodos desarrollados últimamente están basados en el uso de enzimas oxidoreductasas como marcadoras. Además de los marcadores es necesario utilizar mediadores redox para transferir la carga entre el electrodo y el sitio redox de la enzima y revelar la actividad enzimática a través de la señal del mediador. De este modo la superficie del electrodo representa, tanto el transductor para la detección enzimática, como el soporte inerte sobre el cual se inmovilizan los antígenos o los anticuerpos. En este contexto se construyeron multicapas autoensambladas de PAH-Os y un anticuerpo, IgG antibiotina, con el objetivo de construir un biosensor modelo para la detección de moléculas pequeñas (como la biotina) a través de un ensayo competitivo, utilizando un marcador enzimático basado en peroxidasa de rábano, HRP-biotina. Con la técnica de EQCM se estudió la deposición de las multicapas, es decir la cantidad de IgG depositada en cada capa, los cambios viscoelásticos durante la adsorción, la cinética de adsorción para distintas concentraciones de IgG y el pegado del marcador o conjugado HRP-biotina. Con la técnica de AFM se observó la estructura y orientación de las moléculas de IgG adsorbidas sobre el polímero y finalmente con las técnicas electroquímicas se estudió el crecimiento de las bicapas y la utilidad de la supraestructura como biosensor, a través del estudio de la catálisis enzimática del conjugado. Finalmente se describen resultados preliminares sobre el uso de proteínas orientadoras, proteína A y G’, utilizadas para disminuir la inespecificidad del sensor y favorecer la reacción entre el antígeno y el anticuerpo inmovilizado. En conclusión, los resultados obtenidos confirman que la inmovilización de biomoléculas es por cierto una de las etapas más importantes en el desarrollo de un biosensor al afectar la respuesta del mismo. Además se muestra la necesidad de recurrir a distintas técnicas para su estudio y de este modo contrarrestar las limitaciones propias de cada técnica.Palabras clave – provistas por el repositorio digital
PELICULAS AUTOENSAMBLADAS; ELECTRODOS ENZIMATICOS E INMUNOLOGICOS; MICROBALANZA DE CRISTAL DE CUARZO; PROPIEDADES VISCOELASTICAS; AVIDINA-BIOTINA; ANTIGENO-ANTICUERPO; SELF-ASSEMBLED MULTILAYERS; ENZYMATIC AND IMMUNOLOGICAL ELECTRODES; QUARTZ CRYSTAL MICROBALANCE; VISCOELASTIC PROPIERTIES; AVIDIN-BIOTIN; ANTIGEN-ANTIBODY
Disponibilidad
| Institución detectada | Año de publicación | Navegá | Descargá | Solicitá |
|---|---|---|---|---|
| No requiere | 2003 | Biblioteca Digital (FCEN-UBA) (SNRD) |
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Información
Tipo de recurso:
tesis
Idiomas de la publicación
- español castellano
País de edición
Argentina
Fecha de publicación
2003
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