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Mycobacterium tuberculosis es un patógeno humano que causa más de un millón de muertes anuales, siendo el agente infeccioso bacteriano más letal. El surgimiento de cepas multi resistentes y extremadamente resistentes de M. tuberculosis, prácticamente intratables con los antibióticos que existen actualmente, ha generado la necesidad de contar con nuevas drogas para combatir esta enfermedad. Por tal motivo es necesario validar nuevos blancos de acción de drogas y estudiar los mecanismos de resistencia a las mismas. Isoxil y Tiacetazona son dos drogas que fueron utilizadas para el tratamiento de la tuberculosis y luego dejadas de lado por producir efectos adversos. Si bien se ha estudiado su acción sobre la síntesis de ácidos micólicos, ácidos grasos de cadena larga que son componentes esenciales de la envoltura celular de las micobacterias, su blanco de acción en M. tuberculosis aún se desconoce. Por lo tanto en este trabajo de tesis decidimos realizar estudios a fin de develar el/los blancos de estas drogas. Para ello se utilizó una estrategia combinada basada en lipidómica y genómica a partir del estudio del efecto de las drogas sobre la síntesis de ácidos grasos y ácidos micólicos y de la secuenciación genómica de mutantes resistentes a las drogas. A partir de estudios llevados a cabo con Tiacetazona se comprobó que la enzima esencial b-hidroxiacil ACP deshidratasa de FASII juega un rol inesperado en la resistencia a esta droga. La sobre-expresión del operón que codifica para esta proteína generó resistencia a TAC y además mutantes espontáneas resistentes a TAC presentaron mutaciones en distintas subunidades de la proteína, lo que sugiere que esta enzima sería el blanco esencial de TAC. En el caso de Isoxil la sobre-expresión de la b-hidroxiacil-ACP deshidratasa de FASII generó resistencia a esta droga pero no se han podido encontrar mutaciones en el operón en las mutantes resistentes de M. tuberculosis. Estudios con inhibidores de bombas de eflujo permiten concluir que la resistencia en las mutantes resistentes a ISO aisladas podría deberse a bombas de eflujo que estén expulsando la droga al exterior. Por otro lado, al analizar las mutantes resistentes de M. kansasii, encontramos una mutación silente dentro del operón que estaría generando resistencia a ISO, aunque no se pudo determinar de qué manera lo está haciendo. Estos resultados validan a la b-hidroxiacil ACP deshidratasa de FASII como blanco para el diseño de drogas antituberculosas y abren la puerta para el desarrollo racional de drogas que inhiban esta enzima esencial de micobacterias. Los resultados obtenidos a partir de este trabajo de tesis, junto con estudios estructurales de la b-hidroxiacil ACP deshidratasa, permitirá sintetizar derivados de TAC e ISO con el fin de aumentar su acción bactericida y disminuir sus efectos adversos. Además la información obtenida se podrá utilizar para generar cepas merodiploides en los genes involucrados en la resistencia a fin de poder dilucidar si existen más blancos esenciales de ISO y TAC así como otros mecanismos de resistencia.

El género Mycobacterium incluye especies patógenas de alto impacto en salud pública, como M. tuberculosis (agente causal de la tuberculosis humana), y especies no patógenas como M. smegmatis. La tuberculosis es un problema de salud mundial que causa aproximadamente 1,4 millones de muertes anuales. En los últimos años con la emergencia de cepas de M. tuberculosis multi, extremada y totalmente resistentes a drogas, el estudio de los blancos moleculares de las drogas anti-tuberculosas ya conocidas así como el diseño de nuevas drogas, han sido planteados como necesidades urgentes. En este sentido, la ruta biosintética de los ácidos micólicos (ácidos grasos α- alquil, - hidroxilados de cadena larga (hasta C86) comunes en todas las micobacterias) ofrece un gran potencial para el diseño de drogas debido a que su compleja síntesis requiere de múltiples genes. En el laboratorio se aislaron, mediante mutagénesis química, mutantes de M smegmatis mc2155 termosensibles (TS) y con sensibilidad aumentada a drogas (SAD) que presentaban deficiencias en diferentes tipos de ácidos grasos y micólicos. En este trabajo de tesis se planteó como objetivo principal la caracterización genética y bioquímica de los genes involucrados en los fenotipos observados en estas mutantes teniendo como metas finales la identificación de nuevos blancos para el diseño racional de drogas así como la obtención de nuevos datos acerca de los mecanismos de acción de drogas anti-micobacterianas ya conocidas que actúan sobre esta vía. Para ello se utilizó una estrategia basada en la aplicación de técnicas moleculares que fueron complementadas con estudios fisiológicos, de lipidómica y análisis bioinformáticos, asociados a una extensiva revisión bibliográfica. Los estudio realizados en la cepa mutante UNR21, deficiente en la síntesis de ácidos α’-micólicos, permitieron concluir que en la vía de síntesis de esta sub familia de ácidos micólicos existen genes cuya función aún no ha sido descrita y que no forman parte de la maquinaria descrita hasta el momento. Por otro lado, se identificó un error en la anotación genómica del ORF MSMEG_1204 anotado como β-cetoacil-ACP hipotética. Mediante el análisis de la cepa UNR18 se identificaron probables blancos de acción de TAC en M. smegmatis (bacteria naturalmente resistente a esta droga) en metriltransferasas asociadas a las vías de modificación de ácidos micólicos, diferenciando a este mecanismo del de inhibición de la ciclopropanación propuesto en M. tuberculosis. Así mismo, se identificó al ORF MSMEG_0902 como una MtfsAM involucrada, posiblemente, en la síntesis de ácidos micólicos diciclopropanados. Por otro lado, a partir de las características encontradas en la cepa UNR1 se estudió el efecto de la mutación puntual encontrada en el ORF MSMEG_1886 (codifica para una enzima homóloga a DesA3 de M. tuberculosis) en la vía de síntesis de ácidos grasos insaturados. En este trabajo, se presentaron evidencias de que la mutación C1006T en el ORF MSMEG_1886 probablemente afecta la regioselectividad de DesA3 y además se aportaron resultados que sustentan la función propuesta para esta enzima como desaturasa con especificidad para cadenas carbonadas de longitud C16-C18. Estos estudios se complementaron con un análisis de la desaturación de ácidos micólicos, mediante los cuales se pudo inferir una posible esencialidad de los ORFs MSMEG_5773 y MSMEG_5773 (anotados como desaturasas de ácidos micólicos hipotéticas) así como su asociación al metabolismo de ácidos grasos en M. smegmatis.

En este trabajo de tesis se describe la síntesis de diferentes análogos de esteroides sulfatados marinos con el objeto de evaluar su actividad biológica y establecer correlaciones estructura-actividad. Los esteroides sintetizados poseen grupos sulfato en C-2 y C-3 con diferentes configuraciones y funciones oxigenadas en C-6 y fueron obtenidos a partir de la sulfatación de sus análogos hidroxilados. La reacción de sulfatación fue optimizada luego de probar diferentes condiciones, entre ellas, la selección del agente sulfatante, la relación de equivalentes entre el esteroide y el agente sulfatante, el tiempo y la temperatura de reacción y el método de calentamiento. Todos los análogos sintéticos se obtuvieron a partir de un precursor común, la 5α-colest-2-en-6-ona, que se sintetizó mediante sucesivas reacciones de oxidación y reordenamientos a partir del colesterol. Se ensayó la actividad de inhibición de la enzima acetilcolinesterasa de los compuestos sulfatados y sus análogos hidroxilados y se observó que el compuesto 2β,3α-dihidroxi-5α- colestan-6-ona disulfato resultó ser el más activo de la serie. Por ello, este compuesto fue el elegido como modelo para el estudio de la cinética de la reacción de inhibición. En base a la cinética de la reacción, se realizó un estudio de docking molecular del compuesto y de su análogo desulfatado, el cual no inhibe a la enzima acetilcolinesterasa. Luego se realizaron estudios de dinámica molecular verificándose la estabilidad de los complejos enzimaesteroide obtenidos en el estudio de docking. En el caso del análogo inactivo, si bien se comprobó la estabilidad del complejo, se observó la apertura de un canal secundario en la superficie de la enzima que comunica con el sitio activo, lo que explicaría la razón por la que dicho esteroide no inhibe a la enzima. Debido a los antecedentes de citotoxicidad de los 6E-hidroximino esteroides, se sintetizaron cuatro oximas novedosas a partir de los correspondientes 6-cetoesteroides obtenidos previamente. Se estudió la citotoxicidad de las oximas sintéticas y de algunos esteroides polihidroxilados sulfatados relacionados -para evaluar la influencia de grupos hidroxilo, sulfato y carbonilo en C-6 en la actividad- frente a dos líneas celulares tumorales de cáncer de próstata humano, PC-3 (andrógeno independiente) y LNCaP (andrógeno dependiente). Los resultados indicaron que el compuesto 2β,3α,6β-trihidroxi-5α-colestano trisulfato fue el más activo frente a la línea celular LNCaP y la oxima 2β,3α-dihidroxi-6E-hidroximino- 5α-colestano, frente a PC-3. Por último, se estudió la actividad antiviral y virucida de los compuestos sulfatados y sus análogos desulfatados frente a los virus herpes simplex tipo 1 (HSV-1) y Junín (JV), responsable de la fiebre hemorrágica argentina. La oxima 2β,3α-dihidroxi-6E-hidroximino- 5α-colestano resultó ser el compuesto más activo frente al virus HSV-1, mientras que los compuestos 2β,3α-dihidroxi-5α-colestan-6-ona disulfato y 2β,3α,6β-trihidroxi-5α-colestano- 2,3-disulfato fueron los más activos frente al virus Junín. Ambos resultados ponen de manifiesto la importancia de los grupos sulfato para la actividad antiviral de estos esteroides.

Los withanólidos son un grupo de esteroides naturales de 28 carbonos aislados de plantas pertenecientes al género Solanacea. En particular un pequeño grupo de withanólidos con un anillo D aromático de seis miembros se aisló de la planta Salpichroa origanifolia. Estos compuestos presentan actividad antialimentaria y antiproliferativa. Para determinar la relevancia del anillo D aromático en las propiedades biológicas de los salpichrólidos, en este trabajo de Tesis se sintetizaron ocho esteroides con anillo D aromático, análogos de los salpichrólidos con cadena lateral simplificada. Se describe una nueva metodología para la preparación de esteroides con anillo D aromático, la cual involucra la abstracción de HBr a partir de un homoesteroide dibromado por tratamiento con DABCO. Todos los nuevos compuestos fueron caracterizados usando técnicas de RMN 2D y espectrometría de masas. Se determinaron las actividades antiestrogénica y antifúngica de los análogos sintéticos y de tres salpichrólidos naturales.

Los “azoles” son compuestos que contienen un anillo heterocíclico de cinco o seis miembros con dos o más nitrógenos. Teniendo en cuenta su interés biológico, en este trabajo se planteó la síntesis y caracterización de una serie de azoles como agentes antivirales. Se sintetizaron compuestos pertenecientes a las siguientes familias heterocíclicas: 1,2,4-triazolil-3-tionas, 1,3,4-oxadiazoles y imidazo[2,1-b]tiazoles, así como los pirrolo[2,1-b]tiazoles análogos isostéricos de imidazo[2,1-b]tiazoles, todos ellos sustituidos con un residuo glicosídico y un anillo aromático halogenado. Primeramente, se llevó a cabo la síntesis de derivados fúranósicos protegidos, donde los heterocíclicos antes mencionados se formaban mediante la funcionalización del carbono exocíclico. Este objetivo también involucró la búsqueda y optimización de condiciones de halogenación y oxidación quimioselectivas. Además, se estudió la influencia de la estereoquímica del carbohidrato sobre los rendimientos de reacción para la síntesis de los precursores. Los compuestos fueron evaluados por colegas contra virus Junín y virus Dengue, siendo los imidazo[2,1-b]tiazoles los derivados más promisorios. Posteriormente y gracias a la versatilidad de la estrategia sintética utilizada, se extendió la síntesis de imidazo[2,1-b]tiazoles que presentan variaciones en la posición relativa de los sustituyentes sobre el heterociclo. Se compararon condiciones de calentamiento térmico y por microondas, logrando con esta última minimizar tiempos de reacción. Los estudios de actividad antiviral indicaron que los derivados bromados y clorados resultaron los más activos. Para evaluar la hidrofilia en la actividad, se sintetizaron derivados análogos donde el hidrato de carbono estuviese desprotegido. Para cumplir con este objetivo se evaluaron distintos grupos protectores siendo el p-metoxibencilo aquel que permitió obtener los compuestos deseados. La evaluación antiviral de los mismos indicó que la mayor hidrofília resultaba en desmedro de la actividad.

Xanthomonas campestris es un patógeno de plantas causando la putrefacción negra en las hojas de las crucíferas. Además, produce un polisacárido extracelular (EPS), de gran importancia industrial, llamado xantano. La estructura de su unidad repetitiva es ( Jansson, P. E. et al., 1975. Carbohydr. Res. 45: 274): (ver figura en el pdf). La biosíntesis in vitro de xantano ha sido estudiada en detalle en nuestro laboratorio (Ielpi et al., 1993. Bacteriol., 175:2490). Se ha determinado que ésta ocurre en al menos dos etapas. En la primera etapa, la unidad repetitiva se ensamba secuencialmente sobre un poliprenol pirofosfato. En una segunda etapa, las unidades repetitivas son polimerizadas y el EPS formado liberado en el medio de crecimiento. Se conoce que los genes involucrados en la biosíntesis del xantano, 12 genes, están agrupados en un segmento de ADN de 16 Kb ( Barrre et al., 1986.Int. Biol. Macromol, 8: 372) y parte de los genes involucrados en la transferencia de azúcares estan identificados (Vanderslice et al., 1990. Synergen, Inc., EEUU), pero no se realizó un estudio detallado de la caracterización de mutantes no productoras de xantano, como asi también, aún se desconoce la ubicación de los genes responsable del proceso de polimerización y exportación. En este trabajo de tesis, presentamos la caracterización de algunas mutantes defectuosas en la producción de EPS, en la cual, en dos de ellas, se realizó un estudio más detallado: X. campestris 8004:: Tn525 y 8004:: Tn570. La primera mutante falló en producir el pentasacárido, unidad repetitiva del xantano, y solamente tres azúcares fueron transferidos al prenil pirofosfato intermediario, esta unidad repetitiva truncada no obstante pudo ser polimerisada. El polímero truncado formado tiene la estructura de una celulosa sustituida alternadamente por residuos de manosa y tiene un potencial interés industrial. El transposón, responsable de la mutación, fue localizado dentro del gen gumk. Por lo tanto, este gene codificaría la glicosil transferasa IV, que cataliza la transferencia de ácido glucurónico al trisacárido manosil-celobiosa. La segunda mutante estudiada resultó ser capaz de sintetizar in vitro el lípido pentasacárido, unidad de repetitiva, con cualquiera de los tres dadores de azúcares utilizados: UDP-Glc, GDP-Man y UDP-GlcA, pero incapaz de polimerizar estas unidades. El Tn5, en la cepa N °70, fue localizado 15 bp "upstream" del sitio de iniciación del gen gumB (primer gen del grupo). Esto suguiere que gumB está involucrado en el proceso de polimerización. Un segundo aspecto desarrollado en este trabajo de tesis fue el efecto de los grupos no glicosídicos en el proceso de polimerización. Se demostró que los niveles más altos de polimerización, en el EPS producido por la cepa mutante N° 25, fueron obtenidos cuando 30 % de las unidades repetitivas truncadas se encontraban acetiladas. Por otra parte, el fosfoenolpiruvato (dador de los grupos piruvatos) se comportó, sobre este polímero, como un regulador positivo en las reacciones de polimerización. En la cepa silvestre solo se observó cierta inhibición en la reacción de polimerización con ambos dadores de grupos no glicosídicos estudiados. Es importante destacar que la unidad truncada que sintetiza la cepa N° 25 no posee grupos piruvatos en su estructura. Finalmente, estudios preliminares mostraron la obtención in vitro de glucanos β -( 1,2 ) lineales y cíclicos utilizando diferentes preparaciones de X. campestris. Algunos resultados preliminares suguieren un posible rol de estos glucanos en el proceso de infección.

Fil:Ortiz, Marcela Beatriz. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

El Observatorio Mundial de la Salud (GHO), entidad responsable de las evaluaciones estadisticas mundiales de la Organización Mundial de la Salud (OMS) considera a la epilepsia como uno de los desordenes neurológicos crónicos más frecuentes. Se estima que afecta al 1-2% de la población mundial y particularmente el 80% de los enfermos se encuentra en los países en vías de desarrollo. Las personas con epilepsia responden a los tratamientos farmacológicos en aproximadamente un 70% de los casos, mientras que entre el 30 a 40% de los pacientes presentan resistencia a los medicamentos actuales (fenómeno conocido como farmacorresistencia). A pesar de las mejoras en la terapia alcanzadas por la incorporación de nuevos antiepilépticos en los últimos 30 años, se encuentra que estos no han logrado superar en forma significativa la farmacorresistencia y en muchos casos presentan serios efectos adversos. Este escenario genera la necesidad de descubrir nuevas entidades químicas que sean capaces de superar la farmacorresistencia y que no presenten efectos secundarios de consideración, a fin de lograr una respuesta adecuada para la totalidad de los pacientes. Se plantea entonces como objetivo general de esta tesis obtener nuevos compuestos con acción anticonvulsiva mediante estrategias eficientes de síntesis. Como objetivo particular se propone abordar racionalmente modificaciones estructurales de sulfamidas derivadas de aminoesteres a fin de optimizar su acción antiepiléptica. El criterio utilizado en el diseño de las sulfamidas fue el de buscar la mejor combinación de sustituyentes de dicha función (aminoester / estructura hidrocarbonada) para obtener un incremento de la actividad anticonvulsiva. La síntesis implicó buscar distintas alternativas de preparación, que tuvieran en cuenta el medio ambiente. Para ello se recurrió a la utilización de reacciones con microondas, y al uso de agentes secuestrantes de intermediarios agresivos para el medio ambiente. Posteriormente se procedió a la evaluación biológica de los compuestos sintetizados en modelos de epilepsia aguda en animales. También se realizaron ensayos in vitro para analizar la capacidad inhibitoria frente a blancos moleculares específicos: diferentes isoformas de anhidrasa carbónica y un receptor inotrópico de ácido γ-amino butírico (GABAA). Finalmente, y de acuerdo a los resultados obtenidos, se analizaron los sustituyentes presentes en las sulfamidas más activas y menos tóxicas. Con esta información se propusieron nuevas estructuras a fin de continuar con la optimización de la acción anticonvulsiva. La presente tesis se ha ordenado por capítulos, en donde los tres primeros abordan los aspectos generales relacionados con la Epilepsia (capitulo 1), con el desarrollo de fármacos (capitulo 2) y con los antecedentes hallados hasta el momento sobre la síntesis de sulfamidas (capitulo 3). En los capítulos subsiguientes se detallan las metodologías aplicadas, los resultados obtenidos, el análisis de los mismos y la conclusión final del trabajo realizado.

Los compuestos piretroides representan hoy dia la familia de insecticidas de mayor crecimiento de uso, fundamentalmente por su seguridad y alta efectividad. Está ampliamente aceptada y establecida su utilización no sólo con fines agropecuarios sino también en salud pública. Una característica de este tipo de compuestos es su particular estereoquímica y la marcada diferencia en el efecto insecticida de los diferentes isómeros geométricos y ópticos. Esta variación en la toxicidad de los isómeros ha sido justificada teniendo en cuenta el modo de acción de estos compuestos. En la búsqueda de nuevas composiciones insecticidas de relación isoméríca definida, este trabajo representa los resultados obtenidos en tres secciones: En la primera, se describen métodos de separación de los cuatro isómeros de la Permetrina y los ocho isómeros de la Cipermetrina por HPLC, y de la Permetrína cis y trans, en escala semipreparativa (placa y columna) y preparativa por recristalización, y se evalúó la acción insecticida de los isómeros, corroborando la mayor actividad del isómero cis. En la segunda sección se estudió la Permetrina en fase sólida, una vez separado el isómero cís en forma cristalina. A partir de allí, se formuló el insecticida en una matriz flowable y se evaluó su acción insecticida en distintas superficies, para varias especies de insectos plaga. El sólido fue caracterizado por difracción de rayos X y por microscopía electrónica. En la tercera y última parte se desarrolló un método novedoso de síntesis estereoselectiva de derivados de ácidos permetrínico (ácido cis, trans-2,2 dimetil - 3 - (2,2 diclorovinil) ciclopropanocarboxílico) RN 59042-49-8 y crisantémico (ácido cis,trans-2,2 dimetil - 3 - (2-metilpropenil) ciclopropanocarboxílico) RN 10453-89-1. Cada uno de los productos obtenidos fue caracterizado por espectrometria de masas. Se utilizaron métodos semiemplricos para sugerir posibles vías mecanísticas del proceso. Se intenta justificar el control cinético del proceso de esterificación, evidente según resultados experimentales, mediante métodos de modelado molecular; la reacción procedería como un ataque nucleofilico del ácido carboxilico a especies catiónicas en solución.