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La pluripotencia y autorrenovación, propiedades fundamentales de las células madre embrionarias (CME), son mantenidas por factores de transcripción (FT) específicos, siendo los más importantes Oct4, Sox2 y Nanog. Estos factores ocupan al mismo tiempo las regiones promotoras de diversos genes a lo largo de todo el genoma, actuando como el núcleo de una red regulatoria que modula la expresión de genes de pluripotencia y de diferenciación celular. Esta regulación de la transcripción está relacionada con cambios en la estructura de la cromatina, generados por distintas proteínas remodeladoras que modifican las colas de las histonas o el DNA, mediante metilación, acetilación, fosforilación, ubiquitinación, etc. Estas enzimas mantienen la cromatina del estado pluripotente y realizan las modificaciones epigenéticas necesarias para comenzar la diferenciación de células madre pluripotentes (CMP). Se ha reportado que la acetiltransferasa de histonas Myst4 posee en su región promotora un elemento regulatorio altamente ocupado por estos FT en CME de ratón. Nuestra hipótesis postula que FT clave de células madre regulan la expresión de Myst4, y que esta expresión es necesaria para el mantenimiento de las propiedades fundamentales de CME. Para estudiarla, nos propusimos como primer objetivo analizar la unión de los FT en la región promotora de Myst4 mediante estudios de inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP-seq) disponibles en bases de datos. Luego, analizamos el patrón de expresión de Myst4 en CME de ratón indiferenciadas y en diferentes etapas de distintos protocolos de diferenciación, tanto en ensayos generados en nuestro laboratorio como en datos de diferenciaciones disponibles de forma abierta. Posteriormente, estudiamos la regulación de Myst4 por los FT esenciales mediante un abordaje de silenciamiento de estos factores en CME. En este trabajo de tesis, observamos que Myst4 se expresa en CME de ratón y que es reprimido durante la diferenciación hacia cualquier tipo celular. Además, nuestros resultados sugieren que su expresión podría estar regulada por Nanog y Oct4, tanto por su posicionamiento en la región regulatoria de Myst4 como por su represión cuando cualquiera de estos dos factores es silenciado. Para estudiar la relevancia de Myst4 sobre el mantenimiento de las propiedades de células madre, utilizamos en primer lugar la estrategia de silenciamiento por shRNA. Sin embargo, ninguno de los tres shRNA ensayados logró un silenciamiento consistente en la expresión de este remodelador. Posteriormente, decidimos utilizar la estrategia de CRISPR/Cas9 para generar líneas celulares de CME knockout para Myst4 (W4 M4-/-). Esta línea no presentó diferencias significativas con respecto a la línea wild type en los niveles de marcadores de pluripotencia y diferenciación temprana. Sin embargo, observamos un cambio en la morfología de las colonias formadas por las células en estado indiferenciado, siendo las mutantes menos refringentes y más planas que las wild type. Por otro lado, las células W4 M4-/- mostraron un mayor número de células cuando se diferenciaron hacia progenitores neurales. Además, este aumento se vió acompañado por una disminución del marcador de progenitor neural Sox1 y el aumento del marcador de mesodermo Brachyury. Estos resultados sugieren que la línea con ausencia de Myst4 presenta una disminución en la eficiencia de diferenciación neural. Los resultados encontrados en este trabajo de tesis sugieren que Myst4 cumple una función en la diferenciación de CME. Nos encontramos analizando la relevancia de Myst4 en la proliferación y la apoptosis de CME en la diferenciación hacia progenitores neurales y neuronas. Consideramos que entender los procesos involucrados en la regulación de la estructura de la cromatina en CME es fundamental para su futura aplicación

Tesis (Doctor en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2021

Los hidrocarburos policicíclicos aromáticos (PAHs) son compuestos ubicuos en el ambiente, que pueden generarse por eventos naturales (erupciones volcánicas, incendios forestales) y a través de la actividad antropogénica. La contaminación con PAHs genera gran preocupación por su potencial carcinogénico y mutagénico. Por estos motivos, dichos compuestos se encuentran regulados por la USEPA (Environmental Protection Agency), siendo 16 prioritarios. Los PAHs son compuestos insaturados, que poseen dos o más anillos aromáticos fusionados. Debido a sus propiedades químicas, como su alta hidrofobicidad, baja volatilidad y solubilidad en agua y alta adsorción, son compuestos altamente recalcitrantes principalmente en sistemas heterogéneos como el suelo. Con el incremento del peso molecular, estas propiedades se acentúan, así como su peligrosidad. Se caracterizó un suelo crónicamente contaminado a través de sus propiedades físicas y químicas (CO, N%, P, S, Fe, WHC, contenido de hidrocarburos totales y biodisponibles, Carbono Total Disuelto (CTD) y la naturaleza fotoquímica de la materia orgánica soluble), biológicas (recuento de poblaciones cultivables generalistas y especialistas; funcionalidad evaluada mediante distintas enzimas, estructura de la comunidad no cultivable mediante PCR-DGGE y pirosecuenciación de las regiones hipervariables del gen 16SrRNA; cuantificación de las poblaciones generalistas y especialistas totales mediante real time PCR y clonado y secuenciación de genes catabólicos involucrados en la degradación de PAHs) y toxicológicas (test de germinación de semillas de Lactuca sativa) con el fin de evaluar la posibilidad de aplicación de diferentes estrategias para su remediación. Se encontró que el suelo crónicamente contaminado (S0), pobre en materia orgánica, evidenció una baja funcionalidad y significativa toxicidad. Se evidenció una comunidad microbiana diversa, con un arreglo uniforme, adaptada a las condiciones del suelo original y con potencial capacidad degradadora de PAHs. Considerando estos resultados, se decidió estudiar la eficiencia de las tecnologías de remediación biológicas aplicadas al suelo crónicamente contaminado, con y sin tratamiento químico con persulfato de amonio (PS), particularmente de estrategias de compostaje, en la eliminación de hidrocarburos y en la recuperación de su funcionalidad. Se encontró que la transformación de la MOS por el agregado de enmiendas orgánicas incrementa la biodisponibilidad de PAHs, y promueve la eliminación diferencial de los PAHs de bajo peso molecular. Estos efectos serían dependientes de la madurez de la enmienda empleada. Particularmente, el alto grado de transformación de la matriz del suelo durante el compostaje promueve el “desecuestramiento” de PAHs de alto peso molecular. La transformación de la MOS (endógena y exógena) promovida por el agregado de enmiendas orgánicas, dio indicios de reducción de la fitotoxicidad. La eliminación de hidrocarburos se vio afectada negativamente por el consumo preferencial de compuestos solubles de bajo peso molecular fácilmente metabolizables. La oxidación inespecífica de la MOS por el PS libera de la matriz del suelo compuestos orgánicos y nutrientes minerales, permitiendo así la eliminación los PAHs e incrementando la biodisponibilidad de los mismos. La aplicación de PS produjo un impacto negativo sobre la comunidad microbiana del suelo, provocando una disminución significativa de la biomasa, de la diversidad y de la riqueza de especies y una menor densidad de poblaciones especialistas (portadoras de genes dioxigenasa). Todas las estrategias de remediación biológica acopladas a la aplicación de PS producen la eliminación de Has y la eliminación adicional de PAHs, incrementando la biodisponibilidad de los PAHs y promoviendo el “desecuestramiento” específico de dibenzo [a, h] antraceno (5 anillos aromáticos), a excepción de la doble estimulación con compost. El uso de estrategias combinadas promueve el metabolismo de CTD y sulfatos, permitiendo la recuperación de poblaciones generalistas y estimulando las poblaciones especialistas, en una comunidad diversa, equitativa y funcional. El alto grado de humificación de la MOS limitaría la eliminación de los PAHs aun biodisponibles, por falta de sustratos co-metabólicos. Las estrategias de compostaje acopladas al tratamiento oxidativo resultan una herramienta valiosa y prometedora para la recuperación de suelos crónicamente contaminados con hidrocarburos.