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Objetivo de la tesis: - Desarrollo de un sistema de recombinación para la inserción de fragmentos de DNA heterólogos de gran tamaño en el genoma del virus de la poliedrosis nuclear de Anticarsia gemmatalis (AgMNPV). Objetivos particulares: • Evaluación de la infectividad de EpapGV y AgMNPV en larvas A. gemmatalis. Efectos de la administración conjunta de ambos virus. • Estudio de la actividad transcripcional de promotores de EpapGV en células derivadas de A. gemmatalis. • Desarrollo de un vector de transferencia para la inserción de fragmentos de DNA heterólogos en el genoma del virus de la poliedrosis nuclear de A. gemmatalis (AgMNPV). • Generación de recombinantes de AgMNPV (rAgMNPV) con distintos fragmentos del genoma de EpapGV, o con genes particulares de EpapGV, utilizando los plásmidos de transferencia generados.

Tesis para obtener el grado de Magíster Scientiae en Explotación de Datos y Descubrimiento del Conocimiento, de la Universidad de Buenos Aires, en diciembre de 2008

Entre los mayores desafíos de la investigación actual en Fertilización Asistida se encuentran el mejoramiento de la tasa de embarazo y la disminución de los embarazos múltiples. La gran dificultad que existe para estimar el potencial de implantación embrionaria lleva en la práctica a implementar la transferencia de más de un embrión. Desarrollar un nuevo método que incremente la eficacia de la selección embrionaria permitiría aumentar la tasa de embarazo disminuyendo embarazos múltiples. En la última década, han surgido una serie de tecnologías alternativas no invasivas para estimar el potencial de implantación de embriones empleando técnicas “OMICAS” (transcriptómica, genómica, perfiles proteómicos y metabolómicos). Los métodos más frecuentemente empleados en el estudio de las OMICAS de los sistemas biológicos son las cromatográficas, espectroscópicas, espectrométricas de última generación. El análisis de muestras biológicas mediante espectroscopía infrarroja con transformada de Fourier (FTIR) proporciona información de la composición química y estructural de las mismas. Esta información cuando es procesada mediante el uso de sistemas estadísticos multivariantes resulta esencial para el diagnóstico de enfermedades, caracterización y discriminación de células. El objetivo de esta investigación fue aplicar FTIR para desarrollar una nueva estrategia no invasiva que permita determinar, con mayor precisión que los métodos actualmente en uso, el potencial de implantación de embriones obtenidos en procedimientos de fertilización asistida. El estudio se realizó en el marco de un trial clínico sobre una base de 224 parejas de las cuales se obtuvieron de 1 a 10 embriones mediante cultivos in vitro. Los datos clínicos de los pacientes, la información asociada a los embriones, los datos inherentes a la transferencia y la evolución del embarazo fueron registrados en una base de datos OpenClinica (http://OpenClinica/pages/login). Luego de 3 días de incubación el sobrenadante de cultivo de cada embrión fue transferido a una celda de ZnSe (apropiada para la lectura de espectros FTIR). Luego de registrados los espectros en el rango 4000 - 650 cm-1, con 6 cm-1 de resolución, los mismos fueron pre-procesados (test de calidad espectral, técnicas de aumento de resolución, derivadas primera o segunda y normalización vectorial) y evaluados por diferentes técnicas quemométricas supervisadas y no supervisadas. El estudio realizado por un grupo multidisciplinario de médicos, biólogos, bioquímicos, estadísticos e informáticos permitió el desarrolló un modelo basado en redes neuronales artificiales que permite predecir el potencial de implantación de embriones previo a su transferencia en un tratamiento de fertilización (66% de sensibilidad, 85% de especificidad y 81% de exactitud). La nueva metodología de diagnóstico desarrollada resulta no invasiva, rápida, simple, confiable y se independiza de interpretaciones subjetivas del operador. Asimismo, a través de la aplicación de método multivariantes no supervisados como Análisis de Componente Principal y Análisis Factorial hemos demostrado que si bien la metabolómica embrionaria juega un rol fundamental en la implantación, ésta constituye un fenómeno multifactorial, alguno de los factores que podrían estar influenciando los ciclos de fertilización incluyen la edad de la madre, tabaquismo, el índice de masa corporal. Esta investigación constituyó un aporte significativo en el área de fertilización asistida donde la conclusión no exitosa de un ciclo genera graves consecuencias en los pacientes.

Se evaluó la potencialidad probiótica de un grupo de microorganismos obtenidos del kefir en pollos parrilleros. El kefir es un producto ancestral y natural con comprobada acción probiótica en humanos. Para este fin se planteó el uso de permeado de suero como sustrato de fermentación de los microorganismos seleccionados. Previo a los ensayos in vivo se realizaron estudios in vitro de los microorganismos seleccionados y el permeado de suero fermentado con los mismos. Se analizó la capacidad antifúngica, tanto de los microorganismos como de permeado de suero (PS) fermentado por éstos, contra hongos aislados en distintas etapas la cría de pollos parrilleros. Se probó la capacidad de los microorganismos estudiados en la protección de una línea celular, frente a la acción tóxica de la aflatoxina B1. Para finalizar los ensayos in vitro se comprobó la capacidad de los microorganismos de capturar AFB1 en diferentes concentraciones. Una vez probados todos los desafíos in vitro, tanto el PS fermentado como las cepas se suministraron a pollos parrilleros, comprobando que tienen efectos benéficos y son cepas inocuas para las aves.

Tesis (Magister en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2013

De Ganzó, A. (2018). Desarrollo de una plataforma de presentación y vehiculización de antígenos basada en VLPs derivadas del virus Junín. (Tesis de posgrado). Bernal, Argentina : Universidad Nacional de Quilmes.

La “oruga de las leguminosas” Anticarsia gemmatalis (Lepidoptera: Noctuidae) es una plaga con amplia difusión geográfica, que afecta principalmente al cultivo de soja. En Brasil se desarrolló un bioinsecticida en base al baculovirus AgMNPV para el control de esta plaga, y su aplicación exitosa en más de un millón de hectáreas de soja, representó un ahorro significativo del presupuesto utilizado anteriormente en insecticidas químicos (Moscardi, 2002). En Argentina, esta plaga ha sido controlada durante las últimas décadas mediante el uso de insecticidas piretroides. En la actualidad, se han debido incrementar las dosis y el número de aplicaciones (de una a dos o tres por campaña), lo cual estaría indicando la aparición de variedades resistentes a estos pesticidas (Gamundi, com. pers.). En tales circunstancias, existe una creciente demanda de productos alternativos para su control. El inconveniente más significativo que limita la utilización más amplia de AgMNPV es su baja velocidad de acción, aspecto negativo que se acentúa en regiones templadas como nuestro país (Moscardi, 1999). Otro aspecto que genera interés en relación al estudio de los baculovirus, es su utilidad como vectores muy eficientes para la expresión de genes heterólogos (Luckow y Summers, 1988, O’Reilly eí al., 1992; King y Posse, 1992). El gran tamaño del genoma viral requiere la utilización de la recombinación homologa para introducir cambios dirigidos (Kitts y Possee, 1993; Pfeifer et al., 1997). Recientemente, esta metodología se utilizó con el objetivo de incrementar la potencia insecticida de los baculovirus salvajes. Se ensayaron distintas alternativas, que incluyen la expresión de toxinas específicas para insectos, hormonas de insecto o enzimas o deleciones de genes virales que afectan la metamorfosis (Wood y Granados, 1991, O’Reilly etal., 1991; Chejanovsky etal., 1995, Bonning y Hammock, 1996). En 1994 Cory et al. publicaron el primer trabajo en el que se utilizaron baculovirus mejorados genéticamente en un ensayo de campo. En este contexto, se inició el presente proyecto de Tesis, con el objeto de desarrollar un sistema de producción de recombinantes del virus de la poliedrosis nuclear de Anticarsia gemmatalis (rAgMNPV) que permitiera tanto la generación de AgMNPVs con mayor eficacia bioinsecticida contra plagas de la soja, como su utilización para la expresión de genes foráneos en un ambiente eucariota. Para ello, se localizó, clonó y secuenció el gen de la poliedrina (polh) de AgMNPV y sus regiones flanqueantes; se construyeron vectores de transferencia para la recombinación homologa con el locus polh y se desarrolló el primer sistema de expresión basado en AgMNPV (Arana et al., 2001). Por otra parte, se demostró la eficacia del sistema para la expresión de genes foráneos, a niveles muy altos y biológicamente activos (Arana et al., 2001; Arana et al.,2002). Mediante la utilización de dicho sistema se aislaron y caracterizaron recombinantes de AgMNPV que expresan una proteína neurotóxica (Txp I), específica de insectos. Los resultados obtenidos a partir de insectos tratados con estos recombinantes demostraron la eficacia de la modificación genética realizada. Se comprobó una disminución del 55-60% en el tiempo de muerte de larvas infectadas por el virus recombinante, en comparación con el producido por el virus silvestre. Los objetivos alcanzados sientan las bases para posteriores estudios de impacto ecológico del recombinante obtenido, con el fin de cumplimentar los requisitos imprescindibles para el registro del rAgMNPV como insecticida biológico de utilidad en esta región. Finalmente, los vectores de transferencia generados en el marco del proyecto permiten la potencial utilización del sistema para la expresión de dos o más genes con funciones relacionadas (subunidades proteicas). Este tipo de construcciones podría resultar importante desde el punto de vista biotecnológico para la producción masiva de estructuras proteicas complejas (antígenos, complejos multienzimáticos, etc.).

El presente trabajo comprende dos objetivos. El primero está referido al desarrollo, desde larva hasta adulto, del esqueleto y los músculos en las especies del género Batrachyla. El segundo es realizar un análisis cladístico del género. Batrachyla es un género neotropical de Anuros Neobatracios compuesto por cinco especies distribuidas por los bosques argentinos y chilenos del género Nothofagus. Historicamente ha sido clasificado dentro de “Leptodactylidae”, en la subfamilia “Telmatobiinae”, pero actualmente se conoce que ambas entidades no son monofileticas, sin existir acuerdo en como se distribuyen taxonomicamente los clados que integran esos agrupamientos. Se trabajo con larvas de tres especies (la larva de Batrachyla fitzroya y B. nibaldoi permanecen desconocidas) y adultos todas las especies del género. Al ser B. taeniata la especie con que más material se dispuso, la base de las observaciones y descripciones fue realizada sobre esta especie y luego se realizaron comparaciones con las restantes. El material para análisis ostológico y condrológico se preparó según técnicas convencionales de doble tinción y diafanización. El material destinado al análisis miológico se preparó según esas técnicas evitando el paso final de diafanización. Para el análisis cladístico se emplearon 7 grupos externos que corresponden a las especies Alsodes gargola, Atelognathus patagonicus, Ceratophrys ornata, Chacophrys pierottii, Eupsophus calcaratus, Hylorina sylvatica y Pleurodema borellii (empleada para enraizar). Los 110 caracteres (72 de morfología del adulto, 33 de morfología larvaria, 2 de cariología y 3 de biología reproductiva) se analizaron con el programa TNT. Se realizaron dos análisis, uno con caracteres igualmente pesados y otro con pesos implicados. El condrocráneo de Batrachyla spp. presenta el patrón descrito para larvas exotroficas, microfagas, bentónicas y de charca. Su metamorfosis también sigue los patrones descritos en la literatura para otras especies de anuros. El condrocráneo aporto diversos caracteres, muchos de los cuales resultaron en sinapomorfias de grupos. Respecto del análisis osteológico los aspectos más relevantes fueron: 1) presencia de osificaciones parahioideas en diversos especimenes metamórficos de Batrachyla taeniata, las cuales no fueron observadas en los ejemplares adultos, 2) presencia de un centro de osificación ubicado en la región posterior de la cápsula ótica interpretado como correspondiente a un opistótico reducido, el cual es rapidamente incorporado al centro del hueso exoccipital, y 3) presencia de dos centros para el hueso escamoso, uno correspondiente a la rama ventral, y otro a las ramas ótica y anterior. El primero de ellos fue interpretado como el escamoso de los otros tetrápodos, el segundo se interpreto como tabular. Del mismo modo se discute el problema de los diversos centros que se han reportado para el hueso pterigoides, sugiriendo que el centro correspondiente a la rama zigomática representa el ectopterigoides de los restantes tetrápodos, mientras que el centro de la rama posterior corresponde al endopterigoides.

Tesis (Grado Doctor en Ciencias Biológicas)--Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales. Lugar de Trabajo: Centro de Investigaciones Científicas y Transferencia de Tecnología a la Producción-CICyTTP-Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas -CONICET-Universidad Nacional de Córdoba. 2015 - 93 h. con Anexos + CD. tabls.; grafs.; figuras. Contiene Referencia Bibliográfica y Publicaciones Derivadas de la Tesis + Presentaciones en Reuniones Científicas Derivadas de la Tesis.

Los compuestos enjaulados son entidades moleculares capaces de liberar partes de ellas al ser irradiadas con luz. Esta estrategia permite liberar una molécula con precisión espacio-temporal en un tejido biológico. En particular, los compuestos enjaulados de neurotransmisores son utilizados en la elucidación de circuitos neuronales, estudios cinéticos rápidos en canales iónicos, mapeo de receptores, etc. En nuestro laboratorio se han desarrollado compuestos enjaulados de base rutenio-bipiridina que poseen moléculas bioactivas coordinadas, que son liberadas luego de ser irradiadas con luz (un fotón de luz visible o dos fotones de infrarrojo cercano, NIR). Algunos de ellos son los fotoliberadores de los neurotransmisores ácido γ-aminobutírico (GABA), glutamato, dopamina, glicina entre otros y de moléculas con actividad modulatoria en el sistema nervioso como nicotina. La serotonina (5-hidroxitriptamina, 5HT) es un importante neurotransmisor en el sistema nervioso de vertebrados e invertebrados. Aparece relacionado con las conductas apetitivas, con estados emocionales como la ansiedad, la alegría y la depresión. Los déficits en la regulación de la serotonina pueden conducir a desórdenes psiquiátricos de fuerte impacto social, y su maquinaria molecular es blanco de varios productos farmacéuticos. En este trabajo se realizó el diseño, síntesis y caracterización de un nuevo compuesto enjaulado de serotonina basado en rutenio: [Ru(bpy)2(PMe3)(5HT)]2+ (PMe3 = trimetilfosfina) que presenta actividad en la región visible del espectro electromagnético. Además se caracterizaron sus propiedades químicas como compuesto enjaulado sensible a luz visible y en régimen de dos fotones NIR y se demostró su inocuidad y su efectividad en la modulación de la excitabilidad en tres modelos animales: ganglios de sanguijuela, neuronas prefrontales en rodajas de cerebro de ratón y cerebros enteros de abejas vivas.