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Las variedades de trigo con hábito de crecimiento invernal requieren una prolongada exposición a bajas temperaturas para acelerar la floración. Este requerimiento se denomina 'vernalización' y la variación natural en los genes que controlan este proceso ha favorecido la adaptación del trigo a diferentes ambientes. Los principales loci que controlan el requerimiento de vernalización en trigo se denominan VRN1, VRN2, VRN3 y VRN-D4. Los primeros tres genes han sido aislados y caracterizados pero VRN-D4 no ha sido identificado aún a nivel molecular. El objetivo de esta tesis es la identificación de VRN-D4 mediante clonado posicional, lo que incluyó la construcción de un mapa genético de alta densidad, un mapa físico, el estudio de los genes candidatos y su validación. Usando esta estrategia se encontró que VRN-D4 está localizado en la región centromérica del brazo corto del cromosoma 5D. En esta región se identificó la inserción un fragmento cromosómico de ~290Kb del cromosoma 5A incluyendo una copia del gen de floración VRN-A1. Usando mutantes inducidos por EMS este estudio demuestra que esta segunda copia de VRN-A1 es VRN-D4. VRN-D4 fue encontrado en muy alta frecuencia en la sub-especie T. aestivum ssp. sphaerococcum predominante en el sur del continente Asiático. Esta sub-especie carece de otros genes para hábito de crecimiento primaveral, lo que sugiere que VRN-D4 jugó un rol importante en la adaptación del trigo a esta región. Este estudio también identificó mutaciones en una región regulatoria de VRN-D4 asociadas a su expresión temprana. Mutaciones similares identificadas en alelos de VRN-A1 también estuvieron asociadas con un reducido requerimiento de vernalización. Los alelos de VRN-A1 y VRN-D4 identificados en este estudio representan una herramienta útil para regular la fecha de floración de trigo. Este estudio contribuye también al conocimiento básico de los mecanismos moleculares involucrados en la respuesta a la vernalización.

El presente trabajo consta de 2 capítulos. El primer capítulo describe: • el clonado, la expresión y la purificación de la proteína LIC10365; • la producción de antisuero contra la proteína recombinante; • el análisis del grado de conservación y expresión de LIC10365 entre diferentes serotipos de leptospira; • el estudio de su expresión durante la infección in vivo; • el estudio de su capacidad para activar a la célula endotelial. El segundo capítulo describe: • la construcción de 1 clon codificante de la proteína CTB en fusión con LipL32; • la expresión y purificación de la proteína recombinante; • la producción de antisuero contra la proteína recombinante; • el análisis de la reactividad de la proteína recombinante contra sueros de pacientes convalecientes; • el estudio de la capacidad de la proteína recombinante para proteger a animales inmunizados con la misma frente a la infección con leptospiras patogénicas; • el análisis de la respuesta inmune de los animales inmunizados.

En este trabajo se estudiaron distintos aspectos a nivel molecular del mecanismo catalítico de la nitrito reductasa de cobre (NirK), una enzima que cataliza la reducción de nitrito (NO2-) a óxido nítrico (NO) en la desnitrificación. Estas enzimas se clasifican de acuerdo a sus propiedades espectroscópicas en verdes y azules. El trabajo se desarrolló a partir del estudio de dos NirK producidas de manera recombinante, una verde obtenida del microorganismo Sinorhizobium meliloti 2011 (SmNirK), y otra azul obtenida de Bradyrhizobium japonicum USDA 110 (BjNirK). Los dos microorganismos son bacterias desnitrificantes de importancia económica para la región por su uso en la formulación de bioinoculantes. Ambas NirK presentan una estructura homotrimérica con dos sitios de cobre por monómero denominados T1Cu y T2Cu, en línea con la mayoría de las NirK caracterizadas. El centro T1Cu, el cual le confiere el color característico a la enzima, es un centro de transferencia electrónica (TE). El T2Cu es el sitio activo en donde ocurre la unión y reducción del sustrato. Las NirK requieren de un dador electrónico fisiológico para llevar a cabo la catálisis, los cuales también fueron producidos de manera recombinante y caracterizados. El dador electrónico fisiológico de la SmNirK es una proteína de cobre mononuclear denominada pseudoazurina (SmPaz), mientras que para BjNirK es un citocromo c (BjCitc550). El mecanismo catalítico de las NirK puede ser dividido en líneas generales en tres procesos. El primer proceso de TE resulta de la interacción de la NirK con el dador electrónico fisiológico. Esto implica la transferencia de un electrón desde el dador electrónico reducido al T1Cu de la NirK (TE interproteína). El segundo proceso de TE ocurre desde el T1Cu reducido al sitio activo T2Cu (TE intraproteína), lo que permite la reducción del sustrato (NO2-) unido al sitio y liberación del producto (NO) (tercer proceso). El proceso de TE intraproteína ocurre a través del puente estructural Cis-His que conecta los dos sitios de Cu en las NirK. En este puente coexisten dos vías estructurales que potencialmente pueden actuar como camino de TE. Una de estas vías involucra el camino covalente Cis-His, mientras que la segunda vía involucraría un camino mixto formado por enlaces covalentes y el puente de hidrógeno establecido entre el O del carbonilo de la Cis y el Nδ1 del imidazol de la His (Nδ1H...O=C). Sobre la base de estudios computacionales se ha propuesto que las NirK azules utilizarían la primer vía mientas que las verdes utilizarían la segunda. La determinación de los potenciales formales de reducción (E0’) de los centros de cobre de la forma as-purified de SmNirK mediante titulaciones potenciométricas permitió concluir que, en línea con la mayoría de las NirK, E0’ T1Cu > E0’ T2Cu. Estos valores definen un proceso de TE T1Cu→T2Cu termodinámicamente desfavorable en la enzima. Los resultados obtenidos a partir de ensayos de EPR sugieren que los valores relativos de los E0’ se invierten como consecuencia de la interacción SmPaz/SmNirK en presencia de sustrato favoreciendo el proceso de TE. La TE intraproteína en esta enzima también fue estudiado cambiando los aminoácidos del puente Cis-His mediante mutagénesis sitio dirigida. Las variantes obtenidas resultaron inactivas frente a SmPaz. Modelos estructurales obtenidos mediante estudios computacionales del tipo QM/MM, junto con los resultados experimentales, sugirieren que la falta de actividad se debería a una interrupción de la TE intraproteína, posiblemente por la ausencia del puente de hidrógeno Nδ1H...O=C.Los resultados obtenidos para las variantes de SmNirK derivaron en el estudio de la relevancia de la estructura Nδ1H...O=C en la TE intraproteína de las NirK verdes y azules y en la dependencia de la actividad catalítica de las NirK con el pH del medio. Esto fue realizado mediante estudios dependientes del pH en las dos NirK en los cuales se monitorearon los estados de oxidación de los dos centros mediante espectroscopía UV-vis y EPR luego de varios ciclos redox de la enzima en condiciones catalíticas. Los resultados más importantes de estos estudios mostraron que a pH 10, condición en la cual las NirK se vuelven inactivas, el T2Cu mantiene la capacidad de unir y reducir el sustrato aunque a una tasa no detectable por los ensayos cinéticos utilizados. Esto se atribuye a que el alto pH produce el desacople entre el proceso de TE intraproteina y del proceso de unión nitrito-T2Cu, lo cual se originaría por la ruptura del puente Nδ1H...O=C. Otro de los resultados relevantes es que en las dos NirK el puente Nδ1H...O=C se comportaría como el único camino de TE, lo que implicaría que la estructura electrónicas del T1Cu no determina el camino de TE.