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La enfermedad de Chagas es una enfermedad parasitaria sistémica causada por el protozoo flagelado Tripanosoma cruzi, considerada una de las endemias mas esparcidas de América Latina. La transmisión vectorial representa la forma de contagio más frecuente de Chagas, siendo Triatoma infestans el principal vector de la enfermedad en el Cono Sur de Sudamérica. Su control se basa en el rociado con insecticidas piretroides (principalmente deltametrina); sin embargo, desde hace varios años se vienen detectando fallas de control debido al desarrollo de poblaciones resistentes. La resistencia a insecticidas es un fenómeno multifactorial, que involucra varios mecanismos, entre ellos: resistencia metabólica por un aumento en la capacidad de metabolizar el insecticida, resistencia por modificación del sitio de acción que reduce la sensibilidad del insecticida y el factor cuticular, que implica una disminución en la penetración a través de la cutícula. El integumento, formado por la cutícula y la epidermis subyacente, es un tejido clave en contribuir al éxito evolutivo de los insectos y en su adaptación a ambientes muy diversos. Los lípidos de la superficie cuticular comprenden una mezcla compleja de compuestos carbonados de largas y muy largas cadenas, donde predominan hidrocarburos, ceras, alcoholes grasos, ácidos grasos y otros compuestos oxigenados de elevado peso molecular. Estos lípidos son esenciales en la fisiología de los insectos ya que evitan la pérdida de agua por evaporación, actúan en comunicación química como feromonas de contacto y regulan la penetración de insecticidas y microorganismos. El objetivo de este trabajo fue avanzar en el conocimiento de aspectos bioquímicos y moleculares del integumento y los lípidos cuticulares involucrados en la resistencia a insecticidas y en la comunicación química en triatominos. Estos conocimientos contribuyen no sólo a dilucidar los mecanismos y regulación de su formación, sino también en el mediano plazo, al diseño de estrategias que permitan tanto interferir en la formación de esta cubierta protectora o utilizarlo para el control de insectos plaga o de interés sanitario. Se lograron cuantificar las feromonas de contacto sexual C20-ol y C22-ol presentes en la epicutícula de hembras de T. infestans, que tienen un importante rol en la eficiencia reproductiva de la especie. A su vez, se comenzó con el estudio de genes codificantes de acil-CoA reductasas, enzimas involucradas en la síntesis de alcoholes grasos, y se evidenció la sobreexpresión de dos de ellos en el integumento de hembras, lo que sugiere su posible participación en la síntesis de estas feromonas. Mediante el análisis cuali-cuantitativos de lípidos cuticulares de insectos T. infestans de poblaciones resistente y susceptible a deltametrina, se logró concluir que los hidrocarburos son los principales responsables del componente lipídico del factor cuticular de la resistencia. Se caracterizaron molecular y funcionalmente los genes CYP4G, y se demostró que intervienen en la síntesis de los hidrocarburos con un rol diferenciado en función de la presencia o ausencia de ramificaciones en la cadena carbonada. Se evaluó la vía de transporte de deltametrina en la hemolinfa de insectos resistentes y susceptibles, y se determinó que la misma es ligada por principalmente por lipoforina y en menor medida por lipoproteína de muy alta densidad I. La cantidad transportada por las proteínas de hemolinfa no está relacionada con la susceptibilidad al insecticida. Se identificaron y clasificaron genes putativamente involucrados en la detoxificación de deltametrina en el integumento de T. infestans, y se demostró por primera vez que 5 genes pertenecientes al clan 4 de las citocromo P450 se encuentran sobreexpresados específicamente en el integumento de insectos resistentes. Esta información aporta nuevas evidencias sobre el rol del integumento en el fenómeno de resistencia: además de participar como barrera física con mayores cantidades de HC cuticulares, también contribuye en la detoxificación de insecticidas. Se incorpora un nuevo rol al factor cuticular: resistencia metabólica en la superficie.

El browning del tejido adiposo es la aparición de adipocitos termogénicos (beige) en los depósitos de tejido adiposo blanco ante la estimulación de las vías adrenérgicas. Los adipocitos beige pueden generarse durante el browning por adipogénesis a partir de precursores o por transdiferenciación de los adipocitos blancos maduros. Se ha observado que la estimulación del browning aumenta el gasto energético ocasionando resistencia al desarrollo de obesidad y también mejora parámetros metabólicos desregulados en esta enfermedad tales como, la tolerancia a la glucosa, la dislipidemia y la insulinosensibilidad. Por otro lado, en los últimos años se han descripto roles de las proteínas reguladoras del ciclo celular (ciclinas, quinasas dependientes de ciclinas [CDKs] y sus inhibidores) en el metabolismo y el tejido adiposo. En particular para CDK4 y CDK6 en el tejido adiposo se describieron acciones en la adipogénesis y en la funcionalidad adipocitaria, pero su participación en el browning no se había evaluado. En el primer capítulo de esta tesis mostramos que CDK4/6 están implicadas en la generación de adipocitos beige por adipogénesis de novo. De acuerdo con esto, cuando inhibimos su actividad in vitro en células precursoras adipocitarias (CPAs) encontramos una disminución en la expresión de marcadores selectivos del linaje beige tanto en las CPAs (Cd137, Tbx1, Ebf2), como en los adipocitos generados al diferenciarse (Ucp1, Pgc1a, Prdm16, Cox8b) indicando una menor capacidad termogénica basal de los mismos. Además, encontramos que parte de su rol en la adipogénesis beige podría estar mediado en parte por una acción sobre el factor de transcripción PPARγ en estadios tempranos de la diferenciación, ya que las CPAs tratadas con el inhibidor mostraron una menor expresión de este factor a d0 y d4 post-diferenciación. En el segundo capítulo observamos que CDK4/6 son importantes para el mantenimiento de la funcionalidad termogénica de los adipocitos y por lo tanto estarían implicadas en transdiferenciación de adipocitos blanco a beige. En este sentido, su inhibición en adipocitos beige diferenciados in vitro disminuyó la expresión de marcadores termogénicos y mitocondriales. Además, el cultivo ex vivo de adipocitos de tejido con el inhibidor redujo la expresión de Ucp1. Finalmente, en el tercer capítulo demostramos que CDK4/6 son importantes en la termogénesis de los depósitos de tejido adiposo blanco in vivo, donde resultaron necesarias para el mantenimiento de la termogénesis basal y para la inducción del browning por frío. De acuerdo con esto, nuestros resultados mostraron que la inhibición de CDK4/6 en ratones induce una disminución en la expresión de marcadores termogénicos en el tejido a temperatura ambiente (basal) e inhibe su estimulación por frío (browning) a nivel génico y proteico. Además, encontramos que el tratamiento con el inhibidor disminuye el pool de CPAs beige en la FEV de los depósitos blancos, indicando que estas quinasas son importantes en la determinación de los precursores hacia el linaje beige. En línea con esto hallamos que las FEVs provenientes de animales tratados in vivo con el inhibidor se diferencian a adipocitos con menor capacidad termogénica basal y estimulada in vitro. En conjunto, nuestro trabajo demuestra la participación de CDK4/6 en la regulación de la termogénesis mediada por Ucp1 en los depósitos de tejido adiposo blanco, y sugiere un rol de estas quinasas en la biogénesis de adipocitos beige por adipogénesis y transdiferenciación.

Se estudió la composición taxonómica de las comunidades parasitarias de dos especies marinas de peces Atherinopsidae del género Odontesthes en los golfos norpatagónicos, y se estableció el rol que estas especies cumplen como hospedadores de helmintos. Se relacionó también la diversidad de la parasitofauna con las principales características biológicas de los hospedadores (talla, sexo, dieta) y con características ambientales (estacionalidad, áreas de procedencia). Las especies elegidas fueron los pejerreyes Odontesthes smitti y O. nigricans, y las áreas de estudio los golfos Nuevo (GN) y San José (GSJ) en la provincia de Chubut. Estas dos especies superponen sus áreas de distribución y su espectro trófico, y constituyen un ítem presa de importancia variable en la dieta de peces, aves y mamíferos marinos de la región Se examinaron 182 ejemplares adultos de O. smitti de GN y 173 de GSJ. Además, se prospectaron 83 ejemplares de tallas chicas (cornalitos y cornalones) en GN y 65 en GSJ. Se examinaron 105 ejemplares adultos de Odontesthes nigricans de GN y 20 ejemplares adultos de GSJ. El bajo número de O. nigricans en GSJ se explica por la baja capturabilidad de esta especie en GSJ. En O. smitti se hallaron y describieron 17 taxa parásitos: Microsporidia, Cestoda: larvas plerocercoides Tetraphyllidea; Digenea: Prosorhynchoides sp. (Bucephalidae), Aponurus laguncula, Lecithaster sp. (Lecithasteridae), Proctotrema n. sp. (Monorchiidae), Diphterostomum sp. (Zoogonidae); Nematoda: Cucullanus marplatensis (Cucullanidae), Huffmanela moraveci (Trichosomoididae), L3 de Cosmocephalus obvelatus (Acuariidae), L3 de Anisakis sp., L3 de Pseudoterranova sp., L3 de Contracaecum sp. (Anisakidae); Acantocephala: larva cystacanta Corynosoma sp. (Polymorphidae), adulto Echinorhynchida; Crustacea: Bomolochus globiceps (Bomolochidae) y Peniculus sp. (Penelidae). En O. nigricans se hallaron las mismas especies con excepción de Microsporidea, larvas plerocercoides Tetraphyllidea, A. laguncula y Contracaecum sp. Odontesthes smitti y O. nigricans se indican como nuevos hospedadores para la mayoría de los taxa parásitos hallados. Dos especies resultaron nuevas para la ciencia, Huffmanela moraveci y Proctotrema n. sp. El análisis de la distribución de los parásitos en las poblaciones de hospedadores en base a la relación varianza‐ media, el coeficiente de agregación k y el índice de Dispersión de Morisita, mostró que la mayoría de los parásitos están distribuidos de manera agregada en la población de hospedadores. El sexo de los hospedadores no influyó en los valores de prevalencia, intensidad y abundancia de las poblaciones parásitas. Esto sugiere que no existirían diferencias tróficas y/o de comportamiento que afecten a las cargas parasitarias. La longitud de los hospedadores fue uno de los principales factores que influyó en el tamaño de las poblaciones parásitas y en la estructura de las comunidades parasitarias de O. smitti y O. nigricans. La riqueza y la abundancia de las infracomunidades correlacionaron positiva y significativamente con la longitud de los pejerreyes, mientras que la diversidad y la equitabilidad lo hicieron de manera negativa. Esto significa que los hospedadores de longitudes mayores albergaron infracomunidades más ricas, caracterizadas por la presencia de pocas especies bien representadas y varias especies raras. Se evaluó la estructura de las comunidades parasitarias a partir de la correlación de la prevalencia y la intensidad media y la distribución de frecuencias de las prevalencias. En las comunidades de O. smitti de ambos golfos se reconocieron dos especies comunes (Prosorhynchoides sp. y C. marplatensis) de acuerdo a sus altos valores de prevalencia e intensidad media. La similitud cualitativa entre infracomunidades fue alta en GN debido a la presencia de estas especies, y más baja en GSJ debido a la presencia de una mayor cantidad de especies con prevalencias e intensidades intermedias. En O. nigricans no se reconocieron especies centrales y la similitud entre infracomunidades fue baja. La riqueza promedio de las infracomunidades fue marcadamente menor que la de las comunidades componentes, característica de las comunidades insaturadas donde los hospedadores individuales albergan muchas menos especies de parásitos de las que podrían albergar y por lo tanto existen nichos vacantes. Se analizó la composición de la dieta de ambas especies hospedadoras, y se la relacionó con la fauna parasitaria hallada. Como resultado de este análisis, se propusieron las posibles vías de transmisión de los taxa parásitos en los pejerreyes a través de las tramas tróficas en los golfos norpatagónicos. Así, en la comunidad de O. smitti los taxa más prevalentes y abundantes fueron los que utilizan organismos bentónicos como hospedadores intermediarios, indicando una preferencia de O. smitti por alimentarse sobre este tipo de organismos. Por el contrario, en la comunidad parasitaria de O. nigricans predominaron aquellos taxa que emplean hospedadores intermediarios planctónicos, por lo que esta especie hospedadora tendría preferencias por una alimentación con mayores componentes del plancton. Estas diferencias se vieron reflejadas en la estructura de sus comunidades parasitarias. Odontesthes smitti se comporta como hospedador intermediario y/o paraténico para larvas plerocercoides de cestodes Tetraphyllidea y digeneos Bucephalidae constituyéndose en un ítem presa para peces cartilaginosos y teleósteos respectivamente. Además, cumplen el rol de hospedadores paraténicos para larvas de nematodes Acuariidae y Anisakidae y de acantocéfalos Polymorphidae que culminan su ciclo de vida en aves y mamíferos marinos de la región. Odontesthes nigricans cumpliría un rol similar como hospedador intermediario de helmintos en las tramas tróficas de la zona bajo estudio, ya que albergan las mismas especies en estado larval, con la única excepción de las larvas plerocercoides. La presencia de parásitos en estado larval y otros en estado adulto sugiere que las especies hospedadoras se encuentran en un nivel intermedio en las tramas tróficas de la región, además de su importante rol en las relaciones tróficas interespecíficas en el área. Además, se comprobó experimentalmente la infección de los pejerreyes con un digeneo de la familia Monorchiidae a partir de las metacercarias enquistadas en la almeja Darina solenoides. Las comunidades componentes de O. smitti y O. nigricans de los golfos norpatagónicos comparten la mayoría de sus especies parásitas, probablemente por ser especies estrechamente emparentadas filogenéticamente. Diferencias en el comportamiento trófico y en el tamaño corporal serían los factores más importantes a partir de los cuales se podrían explicar las variaciones observadas en la estructura de sus faunas parasitarias.

La cosecha y comercialización del brócoli se realiza en momentos en que la inflorescencia se encuentra en pleno desarrollo. La separación de la inflorescencia de la planta madre detiene el suministro de agua, hidratos de carbono provenientes de la fotosíntesis, otros nutrientes y hormonas, principalmente citocininas, las cuales regulan el proceso de senescencia en la planta, retardándolo. Estos factores, sumados a una alta tasa respiratoria conducen a una senescencia acelerada y rápido deterioro postcosecha del producto. Entre los principales síntomas de la senescencia en brócoli se destaca la ocurrencia de un amarilleamiento de la inflorescencia, consecuencia del inicio del catabolismo de las clorofilas. Se produce degradación de proteínas, disminución del nivel de azúcares solubles y de reserva como el almidón, lo que conlleva al inicio de nuevas vías de obtención de energía como la proveniente de los ácidos grasos de membrana, por lo que las células van perdiendo la permeabilidad selectiva de sus membranas. Asimismo, aumenta el número de especies reactivas de oxígeno y disminuye el poder antioxidante. Dada la importancia de los hidratos de carbono en el inicio de la senescencia y la variación existente en el contenido de los mismos en la planta a lo largo del día, dependiente de los ciclos de luz/oscuridad, en el presente trabajo de tesis doctoral se estudió el efecto de la cosecha a diferentes horas del día (8, 13 y 18 h) sobre la senescencia postcosecha. Se encontraron diferencias en el cambio de color, contenido de clorofilas y de azúcares solubles, así como también en la expresión de genes relacionados al catabolismo de clorofilas. Las muestras cosechadas a la tarde mantuvieron mayores contenidos de clorofila, lo que se reflejó en el mantenimiento del color verde por más tiempo, lo que correlacionó con una menor expresión de genes relacionados a la degradación de clorofila como BoCLH2, BoPPH y BoPaO. Las muestras cosechadas tardíamente fueron las que mostraron mayores niveles de almidón y una disminución menos marcada en el nivel de azúcares solubles. La actividad de enzimas relacionadas tanto al catabolismo de sacarosa como de almidón fue superior en las muestras cosechadas a las 18 h sólo en el día inicial, y se mantuvieron sin diferencias entre las muestras cosechadas a diferentes tiempos durante el almacenamiento. Teniendo en cuenta los resultados anteriores, y para determinar el efecto de los azúcares sobre la senescencia, se realizaron ensayos con un suministro externo de glucosa y sacarosa en brócolis cosechados por la mañana. Se halló que las muestras tratadas mantuvieron un nivel de azúcares más alto hacia el final del período postcosecha, manteniendo el color verde por más tiempo, a la vez que retuvieron mayores niveles de clorofilas, contenido de fenoles y antioxidantes. Se estudiaron también diferentes métodos aplicados en postcosecha para retardar la senescencia, como ser las atmósferas modificadas (AM), tratamientos térmicos (TT) y con 1-metilciclopropeno (1-MCP), de modo de evaluar su efecto sobre la actividad de enzimas involucradas en la degradación de almidón y sacarosa. Se encontró un retraso en el amarilleamiento de las muestras almacenadas en AM, las tratadas térmicamente y aquellas a las que se les aplicó 1-MCP, respecto de las utilizadas como controles. Estas últimas mostraron un descenso más acelerado en el contenido de azúcares, con mayor actividad invertasa y sacarosa sintasa durante el período almacenamiento, y con una menor actividad β-amilasa hacia el final de dicho período.