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Tesis (Grado Doctor en Ciencias Biológicas)--Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales. Lugar de Trabajo: Instituto Multidisciplinario de Biología Vegetal-INBIV- CONICET-Universidad Nacional de Córdoba, 2013 - 132 h. con Anexos + CD. tabls.; grafs. Contiene Referencia Bibliográfica y Publicaciones Derivadas de la Tesis. Abstract en español e inglés.

Cuando una célula está expuesta a un agente físico o químico mutagénico. carcinogénico y/o teratogénico existe 1a posibilidad que ese agente pueda causar algún daño sobre su material genético ya sea directa o indirectamente. Si el daño se produce en células germinales, podría provocar esterilidad en los mismos individuos expuestos o mutaciones perjudiciales que se expresan en sus descendientes (Archer y col. 1981). Si el daño ocurre en células somáticas puede conducir a cambios neoplásicos o a envejecimiento prematuro (Sorsa, 1984). Estas mutaciones en células somáticas pueden ir desde simples cambios de pares de bases hasta cambios cromosómicos numéricos o estructurales. Este daño en la estructura del cromosoma se manifiesta como incrementos en los valores de aberraciones cromosómicas (AC) estructurales en relación a la exposición. La exposición a agentes genotóxicos puede producir también, un aumento en 1a frecuencia del intercambio de cromátidas hermanas (ICH). El ICH involucra un intercambio simétrico entre cromátidas hermanas que no da origen a una alteración de la morfología cromosómica. El análisis de AC estructurales y del ICH constituyen hasta ahora, los únicos métodos útiles para acceder al daño sobre el material genético humano provocado por agentes exógenos. Estos ensayos capaces de detectar efectos biológicos en respuesta a una exposición ambiental, son esenciales para determinar el peligro potencial de una exposición y tomar las medidas preventivas necesarias para la protección de la salud humana. La detección de ese daño "in vivo" puede ser realizada solamente con muestras de células humanas en división, como médula ósea o tejido testicular. Debido a la dificultad en obtener estas muestras, tales técnicas no pueden usarse para un monitoreo biológico rutinario. En base a esto, el sistema frecuentemente usado es el de linfocitos sanguíneos estimulados con mitógenos en cultivo. Existiría una correlación entre el daño cromosómico ocurrido en los linfocitos con el presente en otras células somáticas y por lo tanto, los linfocitos serían útiles células indicadoras (Nordenson y col., 1984). En esta Tesis se utilizaron las técnicas citogenéticas mencionadas para detectar los posibles efectos genotóxicos en sangre y orina de dos poblaciones expuestas ocupacionalmente. Una de estas poblaciones está constituida por trabajadores de una industria química de Buenos Aires donde se producen taninos sintéticos, EDTA y blanqueadores estilbénicos y se formulan los pesticidas malatión, diazinón y heptacloro. El valor medio de ICH en los linfocitos periféricos de 22 trabajadores (7.85 ± 0.26) no fue estadísticamente diferente del valor medio del grupo control (8.52 ± 0.34). Además no se observaron efectos de los concentrados de orina de 9 trabajadores sobre la frecuencia de ICH de los linfocitos de un único dador. Estos resultados confirman hallazgos anteriores (Hansteen y col., 1978; Anderson y col.. 1981; Lambert, 1984) donde se demuestra que el en sayo de ICH puede no dar una respuesta satisfactoria en el caso de exposiciones crónicas de bajo nivel. La otra población estudiada está localizada en José C. Paz, Provincia de Buenos Aires, y su principal actividad es el cultivo de plantas ornamentales en macetas. Bajo las condiciones de trabajo empleadas, se puede considerar que los integrantes de esta población están expuestos a una mezcla compleja de pesticidas. A pesar de esta exposición, no se halló un incremento en la frecuencia de AC estructurales en el grupo expuesto en relación al grupo control (porcentaje de células anormales: 1.25 ± 0.21 en los cultivadores de plantas y 1.10 ± 0.35 en los controles). Nuevamente es evidente que, mientras exposiciones intensas a pesticidas pueden producir daño cromosómico (Yoder y col.. 1973; Dulout y col., 1985), no existe un aumento significativo en el nivel de AC en trabajadores expuestos crónicamente a bajos niveles (Stocco y col., 1982). Finalmente, el daño cromosómico detectado “in vivo" por medio del sistema de linfocitos periféricos dependerá del grado de exposición. Por otro lado, el pesticida carbámico Aldicarb fue probado por su habilidad para inducir ICH y AC y para alterar la cinética de división celular en linfocitos periféricos humanos"in vitro", en presencia de un sistema de activación metabólica exógeno. El Aldicarb es un pesticida muy utilizado en nuestro país y del que se conoce poco acerca de sus efectos genotóxicos. Los resultados obtenidos mostraron un aumento significativo en la frecuencia de ICH y de roturas cromatidicas y cromosómicas, siendo este aumento superior en presencia de la mezcla S9. El agregado de este sistema metabólico disminuyó ligeramente la sucesiva progresión mitótica de las células en cultivo. El Nitroso-Aldicarb es un derivado altamente tóxico del Aldicarb y puede formarse en presencia de nitrito de sodio a pH ácidos como los hallados en el estómago de mamíferos. Se analizó si el Nitroso-Aldicarb era capaz de modificar la frecuencia de ICH y la cinética de división celular de linfocitos periféricos. Los cultivos de linfocitos mostraron un incremento en el valor de ICH por célula en relación a las dosis crecientes de Nitroso-Aidicarb. La presencia de esta sustancia en el medio de cultivo produjo además en lentecimiento del ciclo celular. El uso de estos ensayos a corto plazo “in vitro" con células de mamíferos como los linfocitos ofrece la posibilidad de analizar el efecto de un agente químico en particular sobre células humanas y establecer si este agente podría ser considerado como potencialmente mutagénico, carcinogénico y/o teratogénico. Los efectos genotóxicos producidos "in vitro" por el Aldicarb y su derivado nitrosado sugieren que la exposición a estas sustancias podría tener consecuencias para la salud genética humana.

A. La utilización de técnicas adecuadas ha permitido establecer con certeza, en varias especies del género Amaranthus, el número cromosómico, la descripción de las fórmulas cariotípicas y sus indices de asimetría. Además, se ha evaluado el contenido de DNA total y de heterocromatina en la mayoría de las especies analizadas. Las conclusiones más relevantes son: 1) En Amaranthus se han descripto. en general, dos números cromosómicos somáticos: 2n=32 y 2n=34. Ambos números han sido citados para algunas de las especies estudiadas. En este trabajo se determinó el número cromosómico en especies graniferas, en distintos cultivares de las mismas y en especies silvestres relacionadas. Estos estudios serán útiles para predecir resultados al elaborar planes de mejoramiento. 2) Las fórmulas cariotípicas y parámetros relacionados, tales como los indices de asimetría A1 y A2 permiten distinguir a las especies estudiadas hasta el momento (Tabla 3). 3) El contenido de DNA es un dato que complementa los restantes estudios cromosómicos realizados. Aquellas especies con mayor contenido de DNA poseen mayor contenido de heterocromatina y mayor período vegetativo (Tabla 4). 4)En algunos casos estos estudios permitieron aportar datos para clarificar situaciones conflictivas desde el punto de vista taxonómico. Así, por ejemplo, se apoyó la hipótesis de que A. powelii y A. bouchonii deberían ser consideradas dos buenas especies biológicas por diferir en número cromosómico, fórmula cariotípica, contenido de DNA total y heterocromatina. B. Pese a la importancia del amaranto como potencial cultivo alternativo, hay muy pocos estudios de híbridos interespecíficos tanto en especies cultivadas como en silvestres. Estos estudios son importantes desde el punto de vista agronómico y evolutivo. El análisis del comportamiento meiótico de 13 híbridos interespecificos espontáneos y el de sus especies progenitoras permitió estimar la afinidad genómica entre las especies, analizar el tipo de aislamiento postcigótico existente entre las mismas y predecir el éxito de ciertas combinaciones hibridas en planes de mejoramiento. Además, este estudio aportó datos que permiten resolver situaciones taxonómicas conflictivas en Ia delimitación específica de algunos taxa. 1) En las especies con 2n=32 y 2n=34 se observó una meiosis regular con formación de 16 ó 17 bivalentes respectivamente. A. dubius que posee 2n=64 cromosomas, presentó meiosis regular con formación de 32||. También fué elevado en las mismas, el porcentaje de polen teñido mediante el colorante de Alexander (90-98%). 2) Los híbridos entre especies con 2n=32 cromosomas mostraron siempre meiosis aparentemente regular, con formación de 16||. En algunos casos se observaron bivalentes heteromorfos. Estos serían consecuencia del apareamiento de cromosomas entre especies que difieren en su contenido de DNA total, siendo esta diferencia más notable en algunos pares de cromosomas. La tinción de polen de los híbridos, como una evaluación indirecta de su fertilidad, varió considerablemente (0-60%). La baja viabilidad del polen asociada con meiosis regular sugiere que en los híbridos existiría hibridez estructural críptica. Las especies diferirían en rearreglos estructurales pequeños que, pese a la formación de bivalentes, disminuyen Ia fertilidad de los individuos híbridos. No puede descartarse la existencia de diferentes combinaciones génicas responsables de éste fenómeno. Es interesante destacar que al analizar el híbrido A. hybridus x A. quitensis se encontró que la viabilidad de polen estimada es del 60%, indicando que ambas especies estarían relacionadas, pero no pertenecerían al mismo taxon específico como fue sugerido por otros autores sobre la base de estudios morfológicos. Las mayores diferencias con los resultados informados por otros autores se encuentran en híbridos donde A. hybridus esta involucrado como progenitor. Siendo esta una especie polimórfica, el apareamíento cromosómico en híbridos puede verse influenciado por el genotipo paterno. La gran variabilidad en A. hybridus sería la causa de Ia discrepancia encontrada entre los resultados de distintos autores (Figura 24). 3) Los híbridos entre especies con 2n=32 y 2n=34 cromosomas tales como A. cruentus x A. quítensis y A. caudatus x A. cruentus formaron 15||+1|| en todas las células presentando una baja viabilidad del polen (5-7%). El híbrido A. hybridus (2n=32) x A. spinosus (2n=34) mostró 8||+17| en la mayoría de las células sugiriendo que ambas especies poseerían sólo 8 cromosomas homólogos. Esto sugiere que los números básicos del género serian x=8 y x=9, siendo x=16 y x=17 números derivados. Otra observación que apoyaría esta hipótesis es la frecuente presencia de asociación secundaria de bivalentes en especies e híbridos. Sobre esta base, las especies actuales de Amaranthus serían tetraploides (alotetraploides). 4) El hibrido A. spinosus x A. dubíus presentó 17||+15| en la mayoría de las células estudiadas. Este hecho apoyaría la hipótesis que sugiere que los bivalentes formados se deberían al apareamiento alosindético entre 17 cromosomas de A. spinosus y 17 de los 32 cromosomas de A. dubíus, los 15 cromosomas restantes de A. dubíus se mantendrían como univalentes. Este resultado sugiere que que A. spinosus sería uno de los progenitores de A. dubíus. 5) Las observaciones meióticas de los híbridos, analizados en su conjunto, permitió postular una fórmula genómica para cada una de las especies analizadas (Tabla 9) C. La utilización de los perfiles de proteínas seminales, obtenido por electroforesis, se ha revelado como una técnica útil para la caracterización de especies y cultivares. El fenograma de Ia figura.33.muestra que se forman dos grupos a un nivel de similitudde 0,47. Estos grupos están formados por las especies graníferas y por A. spinosus. Dentro de A. spinosus se distinguen los distintos orígenes estudiados. Dentro de las especies graníferas se forman dos grupos a un nivel de similitud de 0,5. Uno de ellos está formado por A. hypochondriacus y A. cruentus y el otro por A. mantegazzianus y A. caudatus. A. hypochondriacus se diferencia de A. cruentus a un nivel de similitud de 0,65, mientras que, A. mantegazzianus se diferencia de A. caudatus a un nivel de similitud de 0,69. Dentro de A. hypochondriacus y A. caudatus se pueden discriminar los cultivares analizados, mientras que los pertenecientes a A. cruentus y A. mantegazzianus son indistinguibles electroforeticamente.

Fil:Dubcovsky, Jorge. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Fil:Wulff, Arturo Federico. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

El presente trabajo de Tesis se basa en el estudio citogenético evolutivo de especies de Heteropteros acuaticos. Se analizó el complemento cromosómico y el desarrollo meiotico de las siguientes especies: Bélostama bifoveolatum, B. cummingsi, B. dentatum, B. dilatatum, B. discretum, B. elegans, B. elongatum, B. gestrai y B. martini (todas 2n= 26 + X1X2Y, macho); B. micantulum, B. plebejum y B. arbiculatum (2n= 14 + XY, macho), y B. oxyurum (2n= 6 + XY, macho) (Belostomatinae, Belostomatidae); Lethocerus annulipes (2n= 26 + XY, macho) (Lethocerinae, Belostomatidae); Pelocoris binotulatus binotulatus, P. binotulatus nigriculus y P. lautus (todas 2n= 18 + 2 m + X0, macho) (Limnocoridae). Se determinó el contenido C de ADN en espermátidas de especies de Belostoma y el análisis estadistico de los resultados demostró que hay diferencias significativas en el contenido de ADN entre las especies con igual o diferente número diploide, salvo entre B. gestroi y B. martini (ambas 2n=29), y entre B. micantulum y B. plebejum (ambas 2n=16), cuyos valores C no difieren significativamente. Se aplicó la técnica de bandeo C a celulas de las diferentes especies con el fin de determinar el patrón de distribucion de la heterocromatina C positiva, el contenido de heterocromatina por complemento cromosómico, y su relación con el número diploide y el contenido de ADN. En todas las especies analizadas la localizacion de las bandas C positivas es exclusivamente telomérica, no habiéndose encontrado bandas intersticiales. Los resultados de la cuantificación de la heterocromatina C positiva mediante la medición de áreas, permite agrupar a las especies de la siguiente manera: B. dentatum, B. elongatum, B. bifoveolatum y B. elegans (todas 2n= 29) tienen un alto porcentaje de heterorromatina C positiva (alrededor de un 60%); B. gestroi y B. discretum (ambas 2n=29) tienen un porcentaje menor (alrededor de un 40%), y B. oxyurum (2n=8) (30%) B. martini (2n= 29) (25%) y B. micantulum (2n=16) (15%) presentan un contenido de heterocromatina C positiva relativamente bajo. El análisis de los resultados del contenido de ADN y de la cuantificación de la heterocromatina C positiva permite apreciar que no existe una relación directa entre el número diploide y el contenido de ADN, y que hay una tendencia general al aumento de la heterocromatina C positiva concomitantemente con el aumento en el contenido de ADN. La aplicación de la tecnica de bandeo NOR a celulas mitoticas embrionarias de B. oxyurum permitió localizar la region organizadora nucleolar en una de las regiones teloméricas del cromosoma X, corroborando las observaciones previamente realizadas con respecto a la asociación del nucléolo únicamente con los cromosomas sexuales. Estos resultados, junto con otros antecedentes descriptos en la literatura, parecen indicar que existe una relación entre las regiones de coloración C intermedia y las regiones organizadoras nucleolares. En este trabajo se han analizado alrededor de 500 individuos y se han encontrado muy pocos casos de individuos portadores de alteraciones numéricas y/o estructurales. En una poblacion de B. plebejum se encontró un individuo heterocigota para una fusión autosómica; el comportamientodel trivalente de fusion permitió corroborar la división pre-reduccional de los autosomas en los Heteroptera. En una población de B. micantulum, se encontraron dos individuos portadores de un cromosoma B, que por sus caracteristicas se habria originado a partir de un autosoma. Finalmente, se encontraron individuos con alteraciones en los cromosomas sexuales: un ejemplar de B. plebejum presentaba un sistema sexual múltiple X1X2Y en lugar del sistema XY característico de la especie; un ejemplar de B. oxyurum era un mosaico XY/XO; y en una población de B. orbiculatum se encontro un polimorfismo para el sistema cromosómicode deteminación del sexo XY/ x1X2Y. Apartir de todos estos resultados, y teniendo en cuenta la información brindada por otras disciplinas, se plantea la hipótesis de que en la familia Belostomatidae los cariotipos de las especies actuales habrian derivado de un complemento cromosómico 2n: 26 + XY, que se postula como el ancestral. A partir de el se habrian originado, por un lado, los complementos 2n= 26 + X1X2Y por una fragmentación del cromosoma X original, y se habrian producido además variaciones en el contenido C de ADN por cambios en la heterocromatina C positiva asi como en la cromatina C negativa. Por otro lado, una segunda linea evolutiva habria procedido por fusiones que llevaron a la reducción del número diploide (2n= 16 y 2n= 8); esta segunda linea se caracteriza además, por presentar un contenido de ADN y un contenido de heterocromatina C positiva relativamente bajo. Finalmente, en base a la escasez de polimorfismos y politipismos cromosómicos, y al comportamiento regular de los cromosomas en los individuos portadores de alteraciones cromosómicas, se postula que si bien dentro de Belostomatidae las especies difieren marcadamente desde un punto de vista citogenétíco, los cambios cromosomicosno constituyen una barrera efectiva de aislamiento reproductivo, y por lo tanto habrian acompañado, o bien serian posteriores, al proceso de especiación.

Se han realizado estudios morfológicos, citogenéticos y quimiotaxonómicos sobre cuatro especies hexaploides (2n = 42) de Bromus del subgénero Ceratochloa (B. cathartitus, B. brevis, B. parodii y B. bonariensis). Mediante técnicas de taxonomía numérica se analizaron los caracteres exomorfológicos, electroforéticos (proteínas seminales) y cromatográficos (compuestos fenólicos en hojas). Se han obtenido y estudiado cinco de los seis posibles híbridos artificiales interespecíficos (B. bonariensis x B. catharticus, B. catharticus x B. brevis, B. parodii x B. catharticus, B. parodii x B. brevis y B. bonariensis x B. brevis). La meiosís de las especies fue regular con formación de 21 bivalentes cerrados. Los híbridos presentaron, en general, meiosis muy regular pero con disminución significativa de bivalentes cerrados y de quiasmas respecto a sus progenitores. Los híbridos en que participa B. catharticus presentaron mayor irregularidad meiótica y la fertilidad en ellos fue muy baja (0 al 5%). Las irregularidades meióticas observadas no explicarían la alta esterilidad en estos híbridos. Los híbridos B. parodii x B. brevis y B. bonariensis x B. brevis fueron más fértiles (40% y 47%, respectivamente). La cruzabilidad entre las especies está correlacionada con la fertilidad de sus híbridos y varió de 0 al 11%. Además, se pudo obtener y estudiar el alododecaploide artificial B. catharticus - B. brevis (2n = 84). En base a resultados citogenéticos, de fertilidad de los híbridos y de la cruzabilidad se puede inferir que las especies de los pares B. brevis - B. bonariensis y B. parodii - B. brevis, serían las más afines reproductivamente. B. catharticus estaría muy aislada, ya que todos los híbridos en que está involucrada muestran baja fertilidad y cruzabilidad. El aislamiento reproductivo entre B. bonariensis y B. parodii sería de prefertilización o debido a inviabilidad de la cigota. Entre las otras especies sería postfertilización, incompletamente desarrollado entre la mayoría de ellas. La esterilidad de los híbridos sería cromosómica segregacional (heterocigosis para translocaciones e inversiones) siendo en la mayoría críptica. En algunos casos podría existir, además, esterilidad génica. La formación de hasta 7 IV (y 28 II, por apareamiento preferencial) en el alododecaploide indicaría que las especies progenitoras poseerían alta homología en uno de sus genomios básicos y serían alopoliploides. En consecuencia se asigna a las especies progenitoras las siguientes fórmulas genómicas: B. catharticus (AA B1B1 C1C1) y B. brevis (AA Bˡ1Bˡ1 Cˡ1Cˡ1) Al estudiar el contenido de ADN y volumen nuclear de cuatro especies de Bromus subgénero Ceratochloa se determinó que ellas diferían significativamente y se encontró alta correlación entre contenido de ADN y volumen nuclear. El contenido 2C de ADN en ellas es: B. bonariensis (14,55 pg), B. parodii (l3,48 pg), B. brevis (12,87 pg) y B. catharticus (ll,66 pg). Los resultados de estudios exomorfológicos y quimiosistemáticos apoyarían las relaciones obtenidas con los estudios citogenéticos, de fertilidad de los híbridos y del contenido de ADN. En especial indicarían que B. catharticus es la especie más diferenciada y evolucionada. Cromatográficamente B. uruguayensis y B. brachyanthera (subgénero Festucoides) forman un grupo fenético separado del de las especies del subgénero Ceratochloa . Además estas dos especies muestran menor similitud cromatográfica que el par B. bonariensis - B. brevis. Considerando que B. uruguayensis y B. brachyanthera se encuentran bastante diferenciadas bioquímicamente y por el aislamiento reproductivo que existe (no se pudo obtener el híbrido) se recomienda mantenerlas como especies diferentes a pesar de la gran similitud morfológica entre ellas. Se ha estudiado la adición de proteínas y de compuestos fenólicos en híbridos y poliploides. La adición de proteínas fue total mientras que en compuestos fenólicos hubo supresión y aparición de compuestos nuevos en los híbridos. Dentro de este estudio pudo verse que la electroforesis de las proteínas seminales apoya la hipótesis del origen de las especies octoploides del subgénero Ceratochloa. Finalmente, los resultados indican que Bromus bonariensis sería la especie más primitiva, siendo perenne, estrictamente chasmógama, con mayor contenido de ADN y con distribución geográfica y ecológica más restringida. B. catharticus, por el contrario, sería la especie más evolucionada poseyendo características derivadas como ciclo de vida corto (anual o bianual), alto porcentaje de cleistogamia, el más bajo contenido de ADN y con distribución geográfica muy amplia. Además B. catharticus es la especie reproductivamente más aislada. En una posición intermedia a las especies mencionadas se encuentran B. Parodii y B. brevis. Esta última, por su alta cruzabilidad con las otras tres especies podría servir como especie “puente” que permitiría la transferencia artificial de genes de las tres especies a B. catharticus.

Fil:Gomiz, Natalia Elva. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Tesis presentada para optar al Grado de Doctor en Ciencias Naturales

Tesis (Doctor en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2016