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Las porfirinas y sus derivados se encuentran ampliamente distribuidas en la naturaleza. Son compuestos tetrapirrólicos que cumplen funciones fisiológicas fundamentales en todas las células vivas, formando parte como grupos prostéticos de una gran variedad de hemoproteínas, entre las que se hallan la hemoglobina, los citocromos, las peroxidasas, y la catalasa. La biosíntesis del hemo está estrictamente regulada. Si los mecanismos de control fallan o son defectuosos, la sintesis o acumulación de intermediarios en la cadena de dicha camino metabólico puede alcanzar niveles mayores que los normales. Esto trae como consecuencia la aparición de una serie de patologías conocidas como porfirias, entre las cuales se destacan por su importancia las porfirias hepáticas. Dentro de estas últimas se encuentra la porfiria aguda intermitente (PAI), caracterizada bioquímicamente por una sobreproducción hepática de ácido δ-aminolevúlico (ALA) y porfobilinógeno (PBG), metabolitos que son excretados por orina. La afección enzimática de esta porfiria se encuentra a nivel de la enzima Porfobilinógeno - Deaminasa (PBG-D). Actualmente se conoce una gran cantidad de drogas que pueden desencadenar una crisis de porfiria aguda, siendo las más comunes los hipnóticos, barbitúricos, sulfonamidas, esteroides, anestésicos y alcohol. A pesar de que el hígado es el órgano donde los intermediarios ALA y PBG se sintetizan en exceso, los síntomas clínicos predominantes pertenecen casi exclusivamente al sistema nervioso. Además, se ha estudiado extensamente la biosintesis de porfirinas en higado de distintas especies animales pero es muy poca la información existente acerca del metabolismo de las porfirinas en el tejido nervioso. Dado estos antecedentes se decidió estudiar la enzima PBG-D de corteza cerebral y de cerebelo de rata. En la etapa inicial del presente trabajo se planeó determinar las condiciones óptimas para la extracción y medición de la actividad de PBG-D. Una vez obtenida la enzima de ambas fuentes se desarrolló un método para la purificación de la misma y empleando la fracción parcialmente purificada, se efectuaron estudios comparativos de caracterización y cinética. Por otra parte, aún se desconoce cuál es el mecanismo que ocurre en la neuropatía porfirica durante los ataques agudos de PAI. Las distintas hipótesis involucran al ALA como agentes neurotóxico, aunque todavía está en discusión si éste atraviesa o no la barrera hematoencefálica, una vez ocurrida la sobreproducción hepática. Por otro lado el camino del hemopodría estar también alterado en el tejido nervioso, contribuyendo a desencadenar los síntomas característicos de esta patología. Durante los últimos años se ha manejado la hipótesis que el ALA se autooxida generando especies reactivas de oxigeno (ROS) capaces de peroxidar los lípidos de las membranasy producir daño a nivel celular, actuando estas especies comoagentes etiológicos de la PAI. Considerando lo expuesto, fue objetivo de la presente Tesis investigar la captación de ALA y su metabolización a PBG y porfirinas empleando como modelo el sistema de particulado de cerebelo de rata. Para lograr este propósito en primer lugar habia que determinar la viabilidad de los particulados, medida como incorporación de leucina a proteínas y como captación de glucosa. Sobre esta base, nuestro interés fue analizar la respuesta del particulado al agregado exógeno de ALA, variando la cantidad de proteína, la concentración de sustrato ALA y el tiempo de incubación. Paralelamente a estos estudios se determinó la distribución de los metabolitos sintetizados y se identificaron las porfirinas formadas por HPLC. Además fue importante establecer la dependencia energética del proceso de incorporación de ALA a las células del particulado. En incubados a distintos tiempos y variando la concentración de sustrato ALA, se evaluó la formación de ROS, midiendo marcadores de daño celular (TBARS y dienos conjugados) y se estudió el efecto de "scavengers" de ROS como la SOD, la CAT y el DMSO sobre la captación de ALA y la biosíntesis de PBG y porfirinas. Por otra parte y teniendo en cuenta que a los pacientes con PAI se les administra como tratamiento ácido fólico y una dieta en carbohidratos se resolvió llevar a cabo un estudio en particulados de cerebelo acerca de la captación de glucosa en presencia de ALA y el efecto de los distintos "scavengers". Comparativamentese analizó el efecto del ácido fólico sobre la biosintesis de porfirinas en particulado y sobre la actividad de PBG-D de corteza cerebral y de cerebelo de rata. Considerando la acción de las sulfonamidas como desencadenantes de una PAI y dado que la sulfamerazina (SMZ) produce una inhibición no competitiva reversible de la PBG-D de higado de rata, correlacionada con la inhibición encontrada in vivo e in vitro en la PBG-Dde sangre de rata, se estudió el efecto de la SMZ sobre la biosintesis de porfirinas en el sistema de particulados, asi como también sobre la actividad de PBG-D de corteza cerebral y de cerebelo de rata. El conocimiento de la respuesta que brinden las células nerviosas al agregado de ALA exógeno es de sumo interés pues podrá contribuir posiblemente al desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas.

El estudio del pigmento presente en la glándula de Harder de ratas blancas, demuestra que es una mezcla de porfirinas cuyo componente principal es protoporfirina, pero que contiene en cantidades mucho menores una porfirina tricarboxílica y coproporfirina de la serie isomérica III. La concentración de porfirinas en la glándula de animales adultos es de 0,15 µg por mg de tejido fresco. Se demuestra la presencia de todas las enzimas relacionadas con la biosíntesis de la protoporfirina 9, lo que avala la naturaleza secretora de porfirinas de esta glánflula. Se estudian además algunas propiedades de los sistemas catalíticos. La δ-ALA sintetasa, primera enzima de esta secuencia, está localizada en las mitocondrias. Utiliza como sustratos glicocola y succinil-CoA, siendo cofactores necesarios de la reacción fosfato de piridoxa], ATP, Mg(++) y aerobiosis. Diferentes condiciones ensayadas para obtener mayor actividad demuestran que es fundamental un pretratamiento de las partículas mitocondriales con agentes quelantes y sulfhidrílicos. El producto de la reacción inhibe la actividad catalítica de la sintetasa. La segunda enzima de este camino, la δ-ALA dehidratasa, se encuentra en la fracción citoplasmática, no asociada a partículas subcelulares. Se logra purificarla unas 150 veces respecto del extracto crudo, la que se comporta como homogénea en diferentes corrilas electroforéticas. Se establece su naturaleza sulfhidrílica, presentando actividad máxima en anaerobiosis. Es estable al calor, su acción es óptima en buffer fosfato a pH 6,8 y a temperaturas más altas que las fisiológicas (55°C). No se determina requerimiento de metales pero es inhibida fuertemente por EDTA. Sus propiedades cinéticas la incluyen dentro de las actividades de las otras δ-ALA dehidratasas de origen animal, y no justifican la acumulación de protoporfirina presente en este órgano, por un incremento excesivo de su actividad catalítica. El complejo porfobilinogenasa-Uro'gen sintetasa y cosintetasa- es también "soluble". Se detectan ambas actividades y se comprueba la labilidad del sistema sintetizante de Uro'gen III, ya sea por precalentamiento del sistema como por estudios de estabilidad. El sistema descarboxilante de los porfirinógenos, que lleva a coproporfirinógeno III, está en el sobrenadante de mitocondrias y es inestable al calor. Se detectan en esta etapa todos los intermediarios conocidos de la cadena biosintética, es decir, los porfirinógenos que poseen 7-, 6-, 5- y 4-CO0H. La coprogenasa, sistema que sintetiza el último de los intermediarios tetrapirrólicos comunes a los caminos divergentes de hemo, proteínas y clorofilas - la protoporfirina 9 - se encuentra localizada en mitocondrias y requiere oxígeno para su actividad. Todos estos resultados demuestran la biosíntesis "de novo" de la proto 9 en la glándula de Harder de rata a partir de sus precursores primarios, la presencia de todos y cada uno de los sistemas enzimáticos relacionados, y, por ende, la existencia de una funcionalidad similar a la de otros sistemas de vida.

Agrobacterium radiobacter produce un polisacárido extracelular (EPS), el succinoglicano, cuya unidad repetitiva (U.R.) es un octasacárido constituído por Glc, Gal, piruvato y succinato en relación 7:1:1:1 (Amemura et al; 1981, Carbohydr. Res. 91:59-65): Glcß1--3Glcß1--3Glcß1--6Glcß1-- 6Glcß1--4Glcß1--4Glcß1--4Glcß1--3Gal—4-6-4Pyr (ver en versión PDF). Este polisacárido tiene gran importancia en la industria del petróleo, y el producto comercial, se extrae de la bacteria en estudio debido a que lo produce en cantidades elevadas. En otros sistemas, se ha demostrado que la biosíntesis de EPS se realiza fundamentalmente en cuatro etapas (Ielpi et al, 1993, J. Bacteriol, 175: 2490-2500). En la primera, se sintetizan los nucleótido-azúcares precursores. En una segunda etapa, se forma la U.R. por transferencia secuencial de los distintos monosacáridos que la componen a partir de los respectivos nucleótido-azúcares a un prenil-fosfato aceptor ubicado en la membrana plasmática. Estas reacciones están catalizadas por enzimas específicas, las glicosiltransferasas. Una vez completada la U.R., ésta actúa como monómero en una reacción de polimerización, siendo el producto final el EPS. Es probable que la polimerización y el transporte al exterior celular (cuarta etapa) del polímero sean simultáneos. En este estudio, se describe la biosíntesis "in vitro" del succinoglicano en A. radiobacter. Se obtuvieron y caracterizaron algunos prenil difosfato azúcares intermediarios y el producto final, es decir el succinoglicano sintetizado "in vitro". Para estudiar la posible formación de compuestos relacionados con la síntesis de EPS, se realizaron incubaciones con células permeabilizadas con EDTA (García et al, 1974, Eur. J.Biochem. 43:93-105) en presencia de UDP-Glc y/o UDP-Gal uno de los dos marcado con [14C]-Glc. La mezcla de incubación se centrifugó y el precipitado de células se lavó con buffer acuoso y luego se trató con solventes orgánicos, que extraen los lípido-azúcares formados. Los lavados se unieron al sobrenadante y en esta fracción se investigó la presencia de EPS. Al realizar incubaciones con células provenientes de la cepa silvestre en presencia de UDP-[14C]-Glc, si bien se observó la síntesis de numerosos compuestos, algunos de ellos de propiedades novedosas, ninguno presentó las propiedades esperables para los compuestos intermediarios, es decir, los prenil fosfo-azúcares. Sin embargo, fue posible observar polímero en los lavados acuosos aunque en muy baja cantidad. En caso de incubar en presencia de UDP-[14C]-Gal se pudieron obtener algunos compuestos de interés, uno de ellos liberaba Gal, pero en cantidades no adecuadas como para ser analizadas. Cuando se incubó en presencia de ambos dadores, uno de ellos radioactivo, se obtuvo menor cantidad de radioactividad en los extractos orgánicos que en el caso de incubar en presencia de un solo nucleótido. Este hecho se atribuyó a la dilución de la marca radioactiva, debido a que la cepa silvestre contiene la UDP-Gal-4-epimerasa, enzima que cataliza la interconversión de UDP-Glc en UDP-Gal. Se buscó, entonces resolver el problema utilizando una mutante, defectiva en la síntesis de esta enzima, de forma tal de poder realizar incubaciones con ambos nucleótidos sin observar el efecto de dilución mencionado anteriormente. En efecto, al utilizar la cepa SGN-1, defectiva en la síntesis de la epimerasa, se pudo lograr la síntesis de los siguientes compuestos: Gal-P-P-prenol, celobiosil- galactosa-P-P-prenol y los prenil difosfato derivados de un octasacárido y de su derivado piruvilado, estrechamente relacionados con la U.R. del succinoglicano. La cantidad de polímero obtenida fue sensiblemente mayor que en el caso de la cepa silvestre. Mediante incubaciones en dos etapas, se demostró también que los prenilfosfo-azúcares analizados eran los precursores del polisacárido. Por otro lado, se estudió el efecto de los dadores de grupos no glicosídicos sobre la síntesis del polímero. El PEP estimula discretamente la formación de polímero, probablemente por un aumento en la piruvilación de la U.R., que es, aparentemente un sustrato mas adecuado para la polimerasa, es decir la enzima o grupo de enzimas que catalizan la polimerización de la U.R. El SuccCo-A ejerce un efecto dual. A una concentración de 0,1 mM estimula en forma notoria la polimerización, mientras que a una concentración diez veces mayor se observó una reducción gradual en dicha estimulación. Finalmente, estos estudios se extendieron a una bacteria estrechamente relacionada, patógena de plantas, Agrobacterium tumefaciens que también produce succinoglicano. En esta cepa, se habían aislado y caracterizado parcialmente varios prenil-fosfo-azúcares, pero no se había logrado su polimerización (Staneloni et al, 1984, J. Gen. Microbiol., 130: 869-879). Con la experiencia lograda en A. radiobacter, se logró obtener succinoglicano "in vitro"también en A. tumefaciens.

En el presente trabajo se estudió la síntesis de un lípido-trisacárido y su papel en la biosíntesis de la porción azúcar de las glicoproteínas. Se pueden considerar tres aspectos en esta investigación: Biosíntesis del Dolicol-P-P-N-acetilglucosamina. Microsomas de oviducto de gallina incubados con dolicol-P, Mg++, detergente y UDP 14C GlcNac catalizan la transferencia de la GlcNac a un compuesto soluble en la fracción lipídica. Por hidólisis ácida suave del lípido-azúcar, seguida de cromatografía en papel, se obtiene unicamente 14C GlcNac. La formación del lípido- de N-acetilglucosamina se incrementa por la adición de cantidadas crecientes de dolicol-P. Se estudiaron también las condiciones óptimas de incubación. Se compararon estos resultados con los obtenidos a partir de microsomas de hígado de rata. Biosíntesis del Dolico-P-P-di-N-acetilquitobiosa. lncubando dolicol-P-P-N-acetilglucosamina radioactivo y UDPGIcNac, no marcado, con microsomas de oviducto de gallina, en presencia de Mg++ y detergente, se obtiene la formación de un nuevo lípidoazúcar. Este nuevo compuesto es lábil al tratamiento ácido suave y el resto hidrofílico fue identificado por cromatografía en papel y por digestión con β-N-acetilglucosaminidasa como la di-N-acetilquitobiosa (2-acetoamido-2deoxi-0- β -D-glucopiranosil-( 1-4)-2 acetoamido-2 deoxi-D-glucosa).Se estudió también la síntesis de este disacárido en distintos tejidos y las condiciones óptimas para obtener un mejor rendimiento. Se presentan evidencias de que este lípido-disacárido, al igual que el de GlcNac son derivados del dolicol-pirofosfato. La biosíntesis de estos dos lípido-azúcares había sido descripta anteriormente en este Instituto, (110), con preparaciones de microsomas de hígado. Biosíntesis del lípido-trisácarido. Manosa puede ser transferida desde guanosina difosfato manosa al dolicol-P-P-di-N-acetilquitobiosa cuando estos sustratos se incuban con microsomas de oviducto de gallina en presencia de Mg++ y detergente. Por hidrólisis-ácida suave del compuesto formado se obtiene un oligosacárido que por cromatografía en papel con distintos solventes y por acción de diferentes glicosidasas parece ser el siguiente trísacarido: β-manosil-β-N-acetilglucosaminil-( 1-4)-N-acetilglucosamina. Se estudiaron las condiciones experimentales para la formación de este lípido-trisacárido. El lípido-trisacárido puede ser sintetizado con microsomas preparados a partir de otros tejidos. En ciertas condiciones experimentales se puede transferir más moléculas de manosa formándose un lípido-oligosacárido de mayor tamaño. Parte de estos resultados se han presentado en la IX y X Reunión Nacional de la Sociedad Argentina de Investigaciones Bioquímicas (151) (152) y han sido publicadas en el Biochemical and Biophysical Research Communications, (153).

Fil:Kotler, Mónica Lidia. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Fil:Sopena de Kracoff, Yolanda Elvira. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

• Se estudian las condiciones de determinación de actividad del sistema descarboxilante que transforma uroporfirinógeno III en coproporfirinógeno III (Porfirinógeno carbozi-liasa) en eritrocitos de pollo, hallándose que la reacción está favorecida por anaerobiosis, pH aproximadamente neutro, glutation y EDTA. El MgCl2 no tiene ningún efecto y la cisteína y el β-mercaptoetanol son inhibidores. • Se realiza una purificación de dicho sistema, basada en procesos de intercambio iónico sobre DEAE-Celulosa (en tanda o "batch" y en columna) y precipitaciones salinas. Se obtiene de ese modo una proteína activa, homogénea de acuerdo a su comportamiento electroforético. Ciertas evidencias indican que podría tratarse de una sola especie molecular. • Se estudian algunas características del sistema enzimático: es relativamente estable en un estado intermedio de pureza, es lábil al calor y parace poseer grupos sulfhidrilos y disulfuros que deben mantenerse como tales para que no se pierda actividad. Se encontró un efecto activador no clásico del glutation. • Durante el curso de la descarboxilación enzimática del uroporfirinógeno se detectan los porfirinógenos de 8 a 4 carboxilos y durante la del firiaporfirinógeno, los de 7 a 4 carboxilos. • Se verifica la existencia de dos etapas en la reacción de descarboxilación: 1) 8-COOH → 7-COOH y 2) 7-COOH → 4-COOH porfirinógeno, siendo la velocidad de la primera mayor que la de la segunda. • La velocidad de cada una de las etapas mencionadas tiene diferente susceptibilidad frente a diversos agentes: calentamiento del sistema enzimático, oxígeno, sales, uroporfirina III. Todos ellos inhiben en mayor grado la segunda etapa. El aumento de la temperatura de reacción hace incrementar en mayor proporción la velocidad de la primera etapa. • Se estudia la cinética de las reacciones de descarboxilación enzimática, determinándose los siguientes valores de Km aparentes: 5x10^(-6) M para el uroporfirinógeno III y 1,3x10^(-6) M para el firiaporfirinógeno III. Se observan efectos de inhibición por sustrato tanto con uroporfirinógeno como con firiaporfirinógeno. El uroporfirinógeno inhibe su propia descarboxilación y probablemente la de firiaporfirinógeno a coproporfirinógeno. El firiaporfirinógeno inhibe también su propia descarboxilación y, además, la del uroporfirinógeno. En base a los resultados obtenidos, se discuten en una forma general el mecanismo de descarboxilación para la serie III y las inhibiciones por sustrato. • Se describen las características de la descarboxilación del uroporfirinógeno I a coproporfirinógeno I, que presenta diferencias frente a la serie III. Aparte de ser menos veloz, es distinta la distribución cuantitativa de los productos de descarboxilación parcial. El intermediario de 7 carboxilos no se acumula como en el caso de la serie III y el de 5 carboxilos se encuentra presente en mayor cantidad que en la serie III.

En esta tesis se estudia la biosíntesis del munano,uno de los principales componentes de la pared celular de la levadura. Se desarrolla una técnica de obtención de la enzima a partir de la descripta por Algranati, Carminatti y Cabib (1). La enzima se prepara reproduciblemente en forma particulada. Este resultado es coherente con el hecho que debe sintetizar un componente estructural de la célula como es el manano en la pared celular. Dos métodos rápidos de dosaje que se desarrollan, permiten acelerar la obtención de los resultados. Empleando GDP-manosa14C en la manosa, en el primero se separa el exceso de CDP-manosa14C del manano 14C formado sometiendo la mezcla de reacción a una electroforesis, mientras que en el segundo se separan por precipitación del manano con etanol 66%. Mediante gradientes de sacarosa se intenta fraccionar e identificar a la partícula subcelular a la cual se encuentra unida la enzima. Se estudiaron varias propiedades de la enzima. Se determinó que requiere específicamente Mn++ para su actividad. No se pudo detectar un requerimiento de aceptor, de manera que la enzima tendría un aceptor endógeno asociado. Se estudió la estructura del producto, comparandola con la estructura del manano natural. Se determina que posee las mismas uniones químicas y que la enzima une por lo menos tres manosas en forma consecutiva. Con estos resultados se demuestra que lo que se sintetiza es efectivamente manano. Como el manano posee tres tipos de uniones químicas en su estructura a1->6 al->2 y a1->3, es posible que exista más de una enzima responsable de su síntesis. Se determinó que en la reacción la guanosina aparentemente se libera como una mezcla de GDP y GMP. Este resultado podría ser explicado por 1a acción de dos enzimas distintas. Se estudia algunas propiedades de 1a unión que mantiene al manano formado por la enzima unido a una partícula subcelular sedimentable, a diferencia del manano purificado, que es perfectamente soluble. Se determinó que la unión es muy sensible a cambios del pH y es posible destruirla por acción de enzimas específicas. El conocimiento del mecanismo de la biosíntesie del manano,junto con los estudios que deberán efectuarse sobre la formación de los demás componentes de la pared celular, podrá servir para llegar finalmente a sintetizar una pared celular in vitro.

La Porfobilinogenasa (PBG-asa) es un complejo enzimático que cataliza la ciclotetramerización del monopirrol Porfobilinógeno (PBG) en el Uroporfirinógeno III (Urogen III), intermediario fisiológico en la sintesis de hemos,clorofilas y corrinas. Está constituido por dos enzimas, la Deaminasa o Urogen I Sintetasa y la Isomerasa o Urogen III Cosintetasa. En ausencia o deficiencia de la segunda, la Deaminasa forma el Urogen I, que sólo se detecta naturalmente en condiciones anormales. Por fallas en el camino metabólico de las porfirinas, se producen una familia de enfermedades conocidas como Porfirias. En ellas, una deficiencia enzimática especifica y primaria, acompañada generalmente de un aumento secundario en la actividad de la enzima limitante ALA-Sintetasa, conduce a una sintesis anormal de precursores y/o porfirinas, responsables de los cuadros clinicos que caracterizan a las distintas porfirias. En algunas de estas porfirias, la falla metabólica se localiza precisamente a nivel de la conversión del PBG en Uroporfirinógenos, como en la Porfiria Aguda Intermitente (PAI), Porfiria Congénita Eritropoyética (PCE) y en algunos casos de intoxicación por plomo. Este sistema enzimático se ha venido estudiando en nuestro laboratorio durante más de 20 años, desde múltiples puntos de vista y en los más variados sistemas. Entre ellos, uno de los más fascinantes ha sido el alga protozoo Euglena gracilis que en virtud de sus peculiares caracteristicas ha constituido uno de los modelos experimentales más atractivos para la investigación de ciertos aspectos del metabolismo de los tetrapirroles. Empleando justamente Euglena gracilis, hemos logrado pruebas acerca de la existencia de un factor regulador de la biosintesis de porfirinas en este organismo, y el estudio de algunas de sus propiedades nos ha permitido identificarlo con un compuesto de naturaleza pteridinica, al tiempo que desarrollar una nueva terapia de la PAI, administrando ácido fólico a pacientes en fase aguda, luego de lo cual se ha logrado una positiva recuperación clinica y bioquimica. En consecuencia resultó importante continuar nuestros estudios acerca de este factor regulador. De manera que, entre los objetivos del presente trabajo nos habíamos propuesto: Emplear como fuentes, además de Euglena gracilis por las razones conocidas, una bacteria fotosíntética, que aparte de poder compartir algunas de las propiedades de la Euglena nos permitiera ampliar nuestros conocimientos acerca de la PBG-asa, poco investigada en estos organismos. Entre ellos, los datos existentes sobre las enzimas involucradas en la sintesis de porfirinas en Rhodopseudomonas palustris se refieren solo al ALA-Sintetasa y también provienen de nuestro laboratorio; de manera que la elección de la segunda fuente fue simple y lógica. Este trabajo comprendía asi, el uso de dos organismos diferentes para el logro de una serie de objetivos. Como etapa previa se planteó entonces un estudio de las condiciones necesarias para la medición de la actividad de PBG-asa EN Rp. Palustris es decir, curvas de crecimiento y actividad en función de los días de desarrollo de las células, asi como condiciones óptimas de extracción y medición de la enzima, en cuanto a atmósfera, tiempo, temperatura y pH de incubación. Se desarrollaría luego un método para la obtención de preparaciones altamente purificadas sobre las cuales se planeaban estudiar algunas propiedades generales como peso molecular, cinética de la reacción y efecto de ciertos cationes y aniones. Pero entre los fines de este trabajo se encontraba además, tratar de identificar y determinar en otros tejidos, la presencia de un factor regulador, análogo al encontrado en Euglena gracilis de manera, que se planearon una serie de experiencias en RP. palustris tendientes al logro de este propósito. Los estudios que se enfocarían en Euglena gracilis estában principalmente relacionados con la obtención de mayores datos experimentales acerca del factor regulador. Se trataba de conocer sus efectos sobre la cinética de la reacción de diferentes preparaciones de la enzima. De datos previos, nos interesó estab1ecer su relación con ciertos compuestos como sulfas y derivados sulfurados. Y dado el conocido efecto activante del factor de Euglena sobre la enzima de igual fuente y del ácido fólico en pacientes con PAI, se pretendía determinar el comportamiento de ambos compuestos frente a distintas preparaciones de la enzima proveniente de los origenes más diversos, con el objeto de aclarar el posible mecanismo de acción de este factor regulador.

En este trabajo se presenta un estudio de la biosíntesis de los exopolisacáridos complejos producidos por tres especies de bacterias Gram negativas, Rhizobium leguminosarum (R.l.), Rhizobium meliloti (R.m.) y Acetobacter xylinum (A.x.). Con el sistema de R. l. se utilizaron las siguientes cepas: R. l. bv. phaseoli 8002 es una cepa silvestre que sintetiza exopolisacárido (EPS+) y tiene capacidad para nodular (Nod+) y fijar nitrógeno (Fix+) en las raíces de su planta hospedadora, poroto (Phaseolus vulgaris). Dicha capacidad se encuentra codificada en un plásmido simbionte llamado pRP2JI. A la cepa 8002 curada de su plásmido simbionte se la denomina R.l. 8401, que no puede nodular ni fijar nitrógeno en poroto (Nod-, Fix-), pero produce exopolisacárido en cantidades equivalentes a la de su contraparte silvestre (EPS+). Una cepa derivada de la 8401 es la cepa R. l. bv. viciae 8401 pRL1JI, que es la cepa 8401 a la cual se le ha introducido el plásmido simbionte (pRL1JI) de otra cepa silvestre llamada R. l. bv. viciae 248 que nodula y fija nitrógeno en arveja (Vicia hirsuta) (Nod+, Fix+) y produce un exopolisacárido de estructura diferente a la cepa 8002 (EPS+). La cepa 8401 pRL1JI es Nod+ y Fix+ en arvejas y produce un exopolisacárido de estructura idéntica al de la cepa 8002 (EPS+). Otra cepa EPS+ utilizada fue R. l. bv. trifolii NA-30, que tiene capacidad para nodular y fijar nitrógeno (Nod+, Fix+) en trébol (Trifolium repens) y también sintetiza un exopolisacárido de estructura idéntica al de la cepa 8002. La estructura propuesta para la unidad repetitiva del exopolisacárido producido por las cepas 8002, 8401, 8401 pRL1JI y NA-30, es la siguiente: (ver diagrama en la tesis). Además se utilizó una mutante defectiva en la síntesis del exopolisacárido (EPS-), obtenida por mutagénesis con el transposón Tn5 con la cepa silvestre R. l. bv. phaseoli 8002, llamada R. l. bv. phaseoli RW4 pero que sin embargo es Nod+ y Fix+, en porotos. Se realizaron incubaciones in vitro con preparados enzimáticos las distintas cepas (células tratadas con EDTA) en presencia tanto de UDP[14C]Glc como UDP[14C]GlcA y se estudió la transferencia de radioactividad a diferentes fracciones, principalmente Extracto 1203 (extracción con solvente orgánico) y sobrenadante de incubación. Se utilizaron diferentes técnicas analíticas para el estudio de los compuestos presentes en las diferentes fracciones; electroforesis en papel, cromatografía, filtración por geles, perrnetilación, etc. En trabajos anteriores realizados en nuestro laboratorio con la cepa R. l. bv. trifolii NA-30, se pudo observar al analizar los Extractos 1203 que se formaban diferentes lípido-azúcares con las características de un prenol-PP-trisacárido, con la estructura de los primeros tres restos glicosídicos de la unidad repetitiva, GlcAβ(1-4) GlcAβ(1-4)Glc (comenzando por el extremo reductor) que podía estar O-acetilada o no, y un prenol-PP-octasacárido, con la estructura de la unidad repetitiva (octasacárido dipiruvilado y acetilado) correspondiente al exopolisacárido descripto para esta cepa. En este estudio previo no se logró polimerización de la unidad repetitiva in vitro que diera como producto final el exopolisacárido (EPS) (J.C. Bossio, 1989, Tesis Doctoral). En el presente trabajo, al analizar el Extracto 1203 se pudieron aislar, por diferentes técnicas de incubación, todos los intermediarios de biosíntesis a nivel de lípido-azúcares, en las fracciones de extracción orgánica (tanto con marca en [14C]Glc como en [14C]GlcA), desde el prenol-PP-glucosa hasta el prenol-PP-octasacárido dipiruvilado (unidad repetitiva) y se demostró que los mecanismos de biosíntesis del EPS y sus intermediarios eran análogos en todas las cepas estudiadas (8002, 8401, 8401 pR1JI y NA-30). Además, y muy importante, al analizar los sobrenadantes de incubación se observó que se pudo obtener polimerización in vitro de la unidad repetitiva que dió como producto final el polisacárido (EPS), en todos los casos. También se demostró de manera inequívoca, a través de incubaciones en dos etapas, que los intermediarios lípido-azúcares intervienen de manera directa en la síntesis del EPS en todas las cepas estudiadas. Esta es la primera vez que se describe polimerización in vitro de un exopolisacárido producido por bacterias del género Rhizobium. Todas estas cepas también produjeron in vitro un glucano β(1-2) (que estas cepas sintetizan) que no se estudió en mayor detalle. Por otra parte, se estudió la transferencia de restos acetilos, en incubaciones llevadas a cabo en presencia de [14C]acetil-CoA, y se vió que el grupo O-acetilo se incorporaba tanto a nivel de intermediarios lípido-azúcares como de polímero (EPS). Al utilizar la cepa mutante RW4 con este tipo de preparado enzimático (células tratadas con EDTA) no se pudieron obtener buenas incorporaciones de radioactividad al Extracto 1203. En una segunda parte de este trabajo, se realizó con la utilización de un nuevo preparado enzimático (células electroporadas) que resultó extremadamente útil para la caracterización de cepa mutante defectiva en la síntesis de EPS, Rhizobium leguminosarum bv. phaseoli RW4 y para el estudio de biosíntesis in vitro de EPS en cepas en las cuales no había sido posible obtener polimerización in vitro, como en Rhizobium meliloti y Acetobacter xylinum. Con respecto a la cepa RW4 (EPS-), se la caracterizó bioquímicamente y se observó que era capaz de sintetizar la unidad repetitiva a nivel de intermediario lípido-azúcar, aunque en menos cantidad que su contraparte silvestre (la cepa 8002), pero no produjo EPS in vitro. También produjo in vitro Glucanosβ(1-2). El sistema de Rhizobium meliloti fue el segundo en ser utilizado con este sistema de células electroporadas para el estudio in vitro de la síntesis de un exopolisacárido, el succinoglicano. Esta especie se caracteriza por tener la capacidad de nodular y fijar nitrógeno (Nod+, Fix+) en alfalfa (Medicago saliva). Se trabajó tanto con la cepa silvestre Rm 1021 (EPS+) como con la mutante defectiva en la síntesis (EPS-), la cepa Rm 7094 (exo B-), que es además Nod- y Fix-. La unidad repetitiva descripta del siccinoglicano es la siguiente: (ver diagrama en la tesis). Estudios previos realizados por otro investigadores han demostrado que en incubaciones in vitro en presencia de UDP[14C]Glc y células tratadas con EDTA se obtuvieron en los extractos orgánicos, compuestos con las propiedades de lípido-azúcares, que comprenderían desde el prenol-PP-Gal (primer resto glicosídico) hasta el prenol-PP-unidad repetitiva (prenol-PP-octasacárido), pero no se logró obtener el producto final, succinoglicano. En este trabajo al usar la cepa silvestre 1021, se pudo observar que en incubaciones realizadas en presencia de UDP[14C]Glc, tanto con células tratadas con EDTA, como con células electroporadas, se obtuvieron buenas incorporaciones de radioactividad a nivel de los lípido-azúcares (Extracto 1203), pero en mayor cantidad con el sistema de células electroporadas (más del 100%). En ambos casos se observó formación de lípido-azúcares, caracterizados como el prenol-PP-octasacárido (prenol-PP- Octa) y su derivado substituído (acetilado y piruvilado) (prenol-PP-Octa.A.). Sólo en el caso de utilizar células electroporadas se observó formación de polímero in vitro. Se estudió la estructura del Octa y del polímero (succinoglicano) obtenidos in vitro y se demostró que ambos tenían la estructura esperada, siendo la primera vez que se describe formación de succinoglucano in vitro en Rhizobium meliloti. La confirmación de estos estudios se obtuvieron al utilizar la cepa Rm 7094 (exo B-) en ensayos de complementación in vitro, en donde al agregar UDP[14C]Glc en presencia de UDP-Gal, no sólo se obtuvieron lípido-azúcares, sino que se logró obtener polimerización in vitro. También se pudieron sintetizar in vitro otros polisacáridos de bajo peso molecular compuestos por 1, 3 y 4 unidades repetitivas (Octa, Octa3 y Octa4, respectivamente), previamante descriptos in vivo por otros investigadores. Ensayos de incubación en dos etapas con la cepa Rm 7094, demostraron claramente que el prenil-difosfato-Octa.A. intervendría como intermediario en la síntesis del succinoglicano final y además del Octa.A., Octa 3 y Octa 4 libres. Por último, se utilizó la cepa silvestre de Acetobacter xylinum RC Grl, que sintetiza un exopolisacárido llamado acetano cuya unidad repetitiva es un heptasacárido con la siguiente estructura: (ver diagrama en la tesis). Estudios previos realizados en nuestro laboratorio, con células tratadas con EDTA de Acetobacter xylinum como preparado enzimático, han demostrado la síntesis secuencial in vitro de la unidad repetitiva a nivel de compuestos lípido-azúcares (prenol-PP-heptasacárido), pero no se pudo obtener tampoco en este caso polimerización in vitro de la unidad repetitiva, para dar acetano. Se hizo un estudio detallado de la puesta a punto de la técnica de electroporación de células en el sistema de Acetobacter xylinum; se estudiaron diferentes variables como el efecto del voltaje (Voltios), capacitancia (Faradios), resistencia (Ohms), tiempo de permeabilidad, ayuno de las células, temperatura de incubación, etc. En este estudio, al analizar los resultados, se observó que al usar células electroporadas se obtuvo síntesis in vitro tanto de polímero (acetano) como de intermediarios de biosíntesis (prenol-difosfato-heptasacárido) a partir de todos los dadores de restos glicosídicos radioactivos (UDPGlc, UDPGlcA, GDPMan y TDPRam) y no glicosídicos, como acetil-CoA, demostrando que los compuestos radioactivos obtenidos pertenecen tanto a intermediarios en la síntesis del acetano como al producto final (acetano) y que el grupo O-acetilo es transferido a nivel de lípido-azúcares. Con este sistema fue posible observar además otros compuestos no relacionados a la síntesis del acetano (glucanos β(1-2); prenol-monofosfato-β-galactosa; prenol-monofosfato-β-manosa y lípido-GlcA) ya descriptos en estudios anteriores. En incubaciones en dos etapas, en donde parte de los prenol-PP-heptasacáridos, se transforman en polímero, se demostró en forma clara el papel de intermediarios originalmente asignada a estos compuestos. Al analizar la estructura del heptasacárido y del acetano obtenidos in vitro con marca en [14C]Glc por ensayos de permetilación, éstos presentaron la estructura esperable con lo que se obtuvieron evidencias concretas de que el acetano se formó por la polimerización de la unidad repetitiva.