Catálogo de publicaciones - tesis
Título de Acceso Abierto
Biosíntesis y estructura de exopolisacáridos complejos de Rhizobium leguminosarum, Rhizobium meliloti y Acetobacter xilinum
Carlos Eduardo Semino Marcelo Alberto Dankert
publishedVersion.
Resumen/Descripción – provisto por el repositorio digital
En este trabajo se presenta un estudio de la biosíntesis de los exopolisacáridos complejos producidos por tres especies de bacterias Gram negativas, Rhizobium leguminosarum (R.l.), Rhizobium meliloti (R.m.) y Acetobacter xylinum (A.x.). Con el sistema de R. l. se utilizaron las siguientes cepas: R. l. bv. phaseoli 8002 es una cepa silvestre que sintetiza exopolisacárido (EPS+) y tiene capacidad para nodular (Nod+) y fijar nitrógeno (Fix+) en las raíces de su planta hospedadora, poroto (Phaseolus vulgaris). Dicha capacidad se encuentra codificada en un plásmido simbionte llamado pRP2JI. A la cepa 8002 curada de su plásmido simbionte se la denomina R.l. 8401, que no puede nodular ni fijar nitrógeno en poroto (Nod-, Fix-), pero produce exopolisacárido en cantidades equivalentes a la de su contraparte silvestre (EPS+). Una cepa derivada de la 8401 es la cepa R. l. bv. viciae 8401 pRL1JI, que es la cepa 8401 a la cual se le ha introducido el plásmido simbionte (pRL1JI) de otra cepa silvestre llamada R. l. bv. viciae 248 que nodula y fija nitrógeno en arveja (Vicia hirsuta) (Nod+, Fix+) y produce un exopolisacárido de estructura diferente a la cepa 8002 (EPS+). La cepa 8401 pRL1JI es Nod+ y Fix+ en arvejas y produce un exopolisacárido de estructura idéntica al de la cepa 8002 (EPS+). Otra cepa EPS+ utilizada fue R. l. bv. trifolii NA-30, que tiene capacidad para nodular y fijar nitrógeno (Nod+, Fix+) en trébol (Trifolium repens) y también sintetiza un exopolisacárido de estructura idéntica al de la cepa 8002. La estructura propuesta para la unidad repetitiva del exopolisacárido producido por las cepas 8002, 8401, 8401 pRL1JI y NA-30, es la siguiente: (ver diagrama en la tesis). Además se utilizó una mutante defectiva en la síntesis del exopolisacárido (EPS-), obtenida por mutagénesis con el transposón Tn5 con la cepa silvestre R. l. bv. phaseoli 8002, llamada R. l. bv. phaseoli RW4 pero que sin embargo es Nod+ y Fix+, en porotos. Se realizaron incubaciones in vitro con preparados enzimáticos las distintas cepas (células tratadas con EDTA) en presencia tanto de UDP[14C]Glc como UDP[14C]GlcA y se estudió la transferencia de radioactividad a diferentes fracciones, principalmente Extracto 1203 (extracción con solvente orgánico) y sobrenadante de incubación. Se utilizaron diferentes técnicas analíticas para el estudio de los compuestos presentes en las diferentes fracciones; electroforesis en papel, cromatografía, filtración por geles, perrnetilación, etc. En trabajos anteriores realizados en nuestro laboratorio con la cepa R. l. bv. trifolii NA-30, se pudo observar al analizar los Extractos 1203 que se formaban diferentes lípido-azúcares con las características de un prenol-PP-trisacárido, con la estructura de los primeros tres restos glicosídicos de la unidad repetitiva, GlcAβ(1-4) GlcAβ(1-4)Glc (comenzando por el extremo reductor) que podía estar O-acetilada o no, y un prenol-PP-octasacárido, con la estructura de la unidad repetitiva (octasacárido dipiruvilado y acetilado) correspondiente al exopolisacárido descripto para esta cepa. En este estudio previo no se logró polimerización de la unidad repetitiva in vitro que diera como producto final el exopolisacárido (EPS) (J.C. Bossio, 1989, Tesis Doctoral). En el presente trabajo, al analizar el Extracto 1203 se pudieron aislar, por diferentes técnicas de incubación, todos los intermediarios de biosíntesis a nivel de lípido-azúcares, en las fracciones de extracción orgánica (tanto con marca en [14C]Glc como en [14C]GlcA), desde el prenol-PP-glucosa hasta el prenol-PP-octasacárido dipiruvilado (unidad repetitiva) y se demostró que los mecanismos de biosíntesis del EPS y sus intermediarios eran análogos en todas las cepas estudiadas (8002, 8401, 8401 pR1JI y NA-30). Además, y muy importante, al analizar los sobrenadantes de incubación se observó que se pudo obtener polimerización in vitro de la unidad repetitiva que dió como producto final el polisacárido (EPS), en todos los casos. También se demostró de manera inequívoca, a través de incubaciones en dos etapas, que los intermediarios lípido-azúcares intervienen de manera directa en la síntesis del EPS en todas las cepas estudiadas. Esta es la primera vez que se describe polimerización in vitro de un exopolisacárido producido por bacterias del género Rhizobium. Todas estas cepas también produjeron in vitro un glucano β(1-2) (que estas cepas sintetizan) que no se estudió en mayor detalle. Por otra parte, se estudió la transferencia de restos acetilos, en incubaciones llevadas a cabo en presencia de [14C]acetil-CoA, y se vió que el grupo O-acetilo se incorporaba tanto a nivel de intermediarios lípido-azúcares como de polímero (EPS). Al utilizar la cepa mutante RW4 con este tipo de preparado enzimático (células tratadas con EDTA) no se pudieron obtener buenas incorporaciones de radioactividad al Extracto 1203. En una segunda parte de este trabajo, se realizó con la utilización de un nuevo preparado enzimático (células electroporadas) que resultó extremadamente útil para la caracterización de cepa mutante defectiva en la síntesis de EPS, Rhizobium leguminosarum bv. phaseoli RW4 y para el estudio de biosíntesis in vitro de EPS en cepas en las cuales no había sido posible obtener polimerización in vitro, como en Rhizobium meliloti y Acetobacter xylinum. Con respecto a la cepa RW4 (EPS-), se la caracterizó bioquímicamente y se observó que era capaz de sintetizar la unidad repetitiva a nivel de intermediario lípido-azúcar, aunque en menos cantidad que su contraparte silvestre (la cepa 8002), pero no produjo EPS in vitro. También produjo in vitro Glucanosβ(1-2). El sistema de Rhizobium meliloti fue el segundo en ser utilizado con este sistema de células electroporadas para el estudio in vitro de la síntesis de un exopolisacárido, el succinoglicano. Esta especie se caracteriza por tener la capacidad de nodular y fijar nitrógeno (Nod+, Fix+) en alfalfa (Medicago saliva). Se trabajó tanto con la cepa silvestre Rm 1021 (EPS+) como con la mutante defectiva en la síntesis (EPS-), la cepa Rm 7094 (exo B-), que es además Nod- y Fix-. La unidad repetitiva descripta del siccinoglicano es la siguiente: (ver diagrama en la tesis). Estudios previos realizados por otro investigadores han demostrado que en incubaciones in vitro en presencia de UDP[14C]Glc y células tratadas con EDTA se obtuvieron en los extractos orgánicos, compuestos con las propiedades de lípido-azúcares, que comprenderían desde el prenol-PP-Gal (primer resto glicosídico) hasta el prenol-PP-unidad repetitiva (prenol-PP-octasacárido), pero no se logró obtener el producto final, succinoglicano. En este trabajo al usar la cepa silvestre 1021, se pudo observar que en incubaciones realizadas en presencia de UDP[14C]Glc, tanto con células tratadas con EDTA, como con células electroporadas, se obtuvieron buenas incorporaciones de radioactividad a nivel de los lípido-azúcares (Extracto 1203), pero en mayor cantidad con el sistema de células electroporadas (más del 100%). En ambos casos se observó formación de lípido-azúcares, caracterizados como el prenol-PP-octasacárido (prenol-PP- Octa) y su derivado substituído (acetilado y piruvilado) (prenol-PP-Octa.A.). Sólo en el caso de utilizar células electroporadas se observó formación de polímero in vitro. Se estudió la estructura del Octa y del polímero (succinoglicano) obtenidos in vitro y se demostró que ambos tenían la estructura esperada, siendo la primera vez que se describe formación de succinoglucano in vitro en Rhizobium meliloti. La confirmación de estos estudios se obtuvieron al utilizar la cepa Rm 7094 (exo B-) en ensayos de complementación in vitro, en donde al agregar UDP[14C]Glc en presencia de UDP-Gal, no sólo se obtuvieron lípido-azúcares, sino que se logró obtener polimerización in vitro. También se pudieron sintetizar in vitro otros polisacáridos de bajo peso molecular compuestos por 1, 3 y 4 unidades repetitivas (Octa, Octa3 y Octa4, respectivamente), previamante descriptos in vivo por otros investigadores. Ensayos de incubación en dos etapas con la cepa Rm 7094, demostraron claramente que el prenil-difosfato-Octa.A. intervendría como intermediario en la síntesis del succinoglicano final y además del Octa.A., Octa 3 y Octa 4 libres. Por último, se utilizó la cepa silvestre de Acetobacter xylinum RC Grl, que sintetiza un exopolisacárido llamado acetano cuya unidad repetitiva es un heptasacárido con la siguiente estructura: (ver diagrama en la tesis). Estudios previos realizados en nuestro laboratorio, con células tratadas con EDTA de Acetobacter xylinum como preparado enzimático, han demostrado la síntesis secuencial in vitro de la unidad repetitiva a nivel de compuestos lípido-azúcares (prenol-PP-heptasacárido), pero no se pudo obtener tampoco en este caso polimerización in vitro de la unidad repetitiva, para dar acetano. Se hizo un estudio detallado de la puesta a punto de la técnica de electroporación de células en el sistema de Acetobacter xylinum; se estudiaron diferentes variables como el efecto del voltaje (Voltios), capacitancia (Faradios), resistencia (Ohms), tiempo de permeabilidad, ayuno de las células, temperatura de incubación, etc. En este estudio, al analizar los resultados, se observó que al usar células electroporadas se obtuvo síntesis in vitro tanto de polímero (acetano) como de intermediarios de biosíntesis (prenol-difosfato-heptasacárido) a partir de todos los dadores de restos glicosídicos radioactivos (UDPGlc, UDPGlcA, GDPMan y TDPRam) y no glicosídicos, como acetil-CoA, demostrando que los compuestos radioactivos obtenidos pertenecen tanto a intermediarios en la síntesis del acetano como al producto final (acetano) y que el grupo O-acetilo es transferido a nivel de lípido-azúcares. Con este sistema fue posible observar además otros compuestos no relacionados a la síntesis del acetano (glucanos β(1-2); prenol-monofosfato-β-galactosa; prenol-monofosfato-β-manosa y lípido-GlcA) ya descriptos en estudios anteriores. En incubaciones en dos etapas, en donde parte de los prenol-PP-heptasacáridos, se transforman en polímero, se demostró en forma clara el papel de intermediarios originalmente asignada a estos compuestos. Al analizar la estructura del heptasacárido y del acetano obtenidos in vitro con marca en [14C]Glc por ensayos de permetilación, éstos presentaron la estructura esperable con lo que se obtuvieron evidencias concretas de que el acetano se formó por la polimerización de la unidad repetitiva.Palabras clave – provistas por el repositorio digital
No disponibles.
Disponibilidad
| Institución detectada | Año de publicación | Navegá | Descargá | Solicitá |
|---|---|---|---|---|
| No requiere | 1994 | Biblioteca Digital (FCEN-UBA) (SNRD) |
|
Información
Tipo de recurso:
tesis
Idiomas de la publicación
- español castellano
País de edición
Argentina
Fecha de publicación
1994
Información sobre licencias CC