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tesis Acceso Abierto

Estudio de la complejación entre selectores quirales derivados de ciclodextrina y solutos con actividad óptica por cromatografía gaseosa en columnas capilares

Pablo Jorge Lebed ; Cecilia Beatriz Marta Castells

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Objetivo general Desarrollo de métodos separativos quirales para la enantioseparación de compuestos de distintas familias químicas por cromatografía gaseosa empleando columnas capilares que contienen sistemas mixtos formados por una matriz polimérica quiral a base de polisiloxanos en los que se disolvió un derivado de γ-ciclodextrina. Objetivos específicos - Preparación y desarrollo de capilares para cromatografía de gases conteniendo como fase estacionaria depositada una película uniforme de espesor conocido. Las fases que se prepararon contienen distintos porcentajes de octakis(3-O-butanoil-2,6-di-O-pentil)-γ-ciclodextrina disuelta en un polisiloxano de polaridad intermedia como OV-1701 (7% fenil-7% ciano-metilpolisiloxano). Los capilares de evaluaron cromatográficamente (medición de eficiencia de la columna y capacidad de enantioreconocimiento). Este derivado de ciclodextrina elegido es líquido a temperatura ambiente, por lo que se prepararon mezclas desde 0 hasta aproximadamente un 30% p/p de selector en el polisiloxano. - Determinación de las constantes de asociación absolutas entre el derivado de ciclodextrina y solutos ópticamente activos de diversas familias químicas en un rango de temperaturas determinado fundamentalmente por la presión de vapor del soluto estudiado - Evaluación de la contribución ejercida por la matriz aquiral sobre la retención cromatográfica total y sobre la enantioselectividad de las columnas. - Medición e interpretación de los parámetros termodinámicos involucrados en la enantioseparación a partir de la dependencia de las constantes de asociación soluto-selector con la temperatura. - Comparación de las constantes absolutas obtenidas a una dada temperatura con los valores que se obtendrían a partir del modelo de incremento de la retención a la misma temperatura. Evaluación crítica de los resultados.
tesis Acceso Abierto

Estudio de la enteropatía inducida por péptidos de gliadinas y ligandos de la inmunidad innata en modelos experimentales

Romina Elizabeth Araya ; Fernando G. Chirdo

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La Enfermedad Celíaca (EC) es una enteropatía crónica de base inmune desencadenada por la ingestión de gluten en pacientes con predisposición genética. Se caracteriza por cambios histológicos severos en la mucosa duodenal definidos por atrofia vellositaria, infiltrado linfocitario e hiperplasia de criptas. Es una patología de alta prevalencia (estimada en un 1% de la población) con una sintomatología variada que puede estar asociada a complicaciones severas. Esta enfermedad ha sido extensamente estudiada utilizando muestras biológicas de pacientes. A pesar de los esfuerzos para desarrollar un modelo animal que reproduzca esta enteropatía, aún no se ha logrado. Usando distintos y complejos esquemas experimentales se han evaluado algunas etapas de la patogenia. Sin embargo, todos los modelos animales desarrollados han logrado replicar sólo algunas etapas del proceso inflamatorio o describir alguno de los mediadores involucrados en la patología, pero ninguno ha logrado modelar la enteropatía en forma plena. En especial, no se han logrado replicar los cambios histológicos característicos observados en el intestino delgado de pacientes con enfermedad celíaca activa. Si bien se conoce con detalle gran parte del mecanismo de patogenia de EC, se ignoran cuáles son las etapas iniciales y en especial, qué factores determinan el inicio de la enteropatía. Por este motivo, el objetivo de este trabajo fue obtener un modelo de inflamación intestinal generada por inductores de la respuesta inmune innata en ratones normales, como posible paso inicial para el desarrollo de una enteropatía más severa y a largo plazo en ratones genéticamente predispuestos. Para ello se optimizó un procedimiento de microcirugía que nos permitió inyectar los mediadores de interés directamente en la luz del intestino delgado. Encontramos que es posible generar enteropatía a las 12 horas en ratones C57BL/6 tanto con la administración de poly (I:C) como con un péptido derivado de gliadina, p31-43. Encontramos que ambos mediadores generan enteropatía por mecanismos diferentes. Por su parte, ambos inductores fueron capaces de generar una enteropatía a largo plazo cuando se emplearon ratones NOD-DQ8, conocidos por presentar sensibilidad al gluten ante ciertas circunstancias. De este modo, con el tratamiento previo de estos ratones con los inductores poly (I:C) o p31-43 y la posterior administración por vía oral de gliadina, obtuvimos dos modelos de enteropatía a largo plazo con características distintivas. En este trabajo mostramos que estos modelos constituyen herramientas muy útiles para el estudio de los mecanismos innatos, tanto moleculares como celulares, que pueden llevar a la generación de procesos crónicos en la mucosa del intestino delgado y conducir al desencadenamiento de EC.
tesis Acceso Abierto

Estudio de la formación de complejos ligando-receptor mediante simulaciones computacionales: El caso albúmina sérica humana-aspirina

Hugo Ariel Álvarez ; José Raúl Grigera

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Son bien conocidas las interacciones que generan la conformación de complejos Enzima-Sustrato como el que se estudia en el presente trabajo, sin embargo, a pesar de los diversos avances que se han hecho al respecto, todavía no se encuentra una técnica efectiva (pero sobre todo eficiente) para una caracterización global de esta interacción. Esto permitiría, por ejemplo, un entendimiento más profundo de la acción catalizadora de la Enzima y de los mecanismos que regula, así como también el desarrollo de inhibidores de su actividad específica. Hoy en día, las técnicas utilizadas para el estudio de conformación tridimensional de macromoléculas biológicas, tales como Difracción de Rayos X (XRD), Difracción de Neutrones (ND), y Resonancia Magnética Nuclear (NMR), han evolucionado notablemente, y esto ha permitido contar con copiosa información accesible a toda la comunidad científica mundial a través de las bases de datos de proteínas (PDB), con acceso libre a través de internet. Asimismo, las técnicas de simulación computacional permiten el modelado y análisis detallado de la estructura microscópica y las propiedades dinámicas de estas macromoléculas, como también de su interacción con otras sustancias. Con este trasfondo es que se inicia un estudio de la interacción de una enzima (la Albúmina Sérica Humana en este caso) con su sustrato. El sustrato utilizado, elegido de entre la gran variedad de pequeñas moléculas hidrofóbicas que interactúan con la Albúmina, fue el Ácido Acetil Salicílico. Con el propósito de desarrollar un método de estudio de la interacción enzima-sustrato, se describen en la presente Tesis los pasos dados en pos de este objetivo.
tesis Acceso Abierto

Estudio de la inhibición de los canales de calcio presinápticos tipo CaV2 por la actividad constitutiva del receptor de ghrelina (GHSR) y su impacto sobre la actividad sináptica en neuronas hipocampales

Valentina Martínez Damonte ; Jesica Raingo

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Los canales de calcio operados por voltaje tipo CaV2 presinápticos acoplan la despolarización de membrana al influjo de calcio, desencadenando la liberación de vesículas sinápticas que contienen neurotransmisores. Existen muchos mecanismos fisiológicos que controlan la actividad de los CaV2, siendo los receptores acoplados a proteína G (GPCR) uno de los más efectivos. Esta modulación ocurre mediante la alteración de la expresión, el tráfico o el funcionamiento de los CaV2 e impacta en la actividad neuronal. GHSR es un GPCR que posee una alta actividad constitutiva -independiente de la unión a ligando- la cual modula los CaV2 en un sistema de expresión heterólogo. A diferencia de la función fisiológica de su actividad evocada por ghrelina, el rol de su actividad constitutiva aún no se comprende completamente, debido a su naturaleza crónica y a la falta de agonistas inversos específicos. GHSR se encuentra ampliamente expresado en numerosos núcleos cerebrales con bajo acceso a la ghrelina plasmática como el hipocampo, donde se ha reportado que la aplicación de ghrelina exógena provoca distintos efectos, como la reorganización y el aumento de la densidad de espinas sinápticas, el incremento en la plasticidad a largo plazo y la neurogénesis. Así, en esta tesis postulamos que la modulación de los CaV2 por la actividad constitutiva de GHSR podría ser relevante en la neurotransmisión hipocampal. Nuestra estrategia experimental consistió en realizar registros de patch-clamp en configuración de célula entera en cultivos hipocampales primarios de embriones de 16-18 días de ratones C57BL6 salvajes y deficientes en GHSR, luego de manipular los niveles de expresión de GHSR mediante transducción lentiviral. Encontramos que la actividad constitutiva de GHSR reduce las corrientes nativas CaV2.1 y CaV2.2, siendo el CaV2.2 el subtipo más afectado. Luego, indagamos acerca del mecanismo por el que ocurre esta modulación mediante la coexpresión de versiones fluorescentes de los CaV2 y GHSR en un sistema de expresión heterólogo. Así, encontramos que la reducción de la corriente macroscópica conlleva una reducción de la densidad en membrana de CaV2.1 y CaV2.2, y además, demostramos que esta forma constitutiva de inhibición de los CaV por GHSR depende de la presencia de la subunidad auxiliar CaVβ. Este subconjunto de datos fue parte de dos trabajos publicados en colaboración con otros miembros de nuestro laboratorio. Al evaluar si la modulación de CaV2 por la actividad constitutiva de GHSR afecta la transmisión sináptica en el hipocampo, encontramos que ésta conduce a una disminución de la liberación del neurotransmisor inhibitorio GABA pero no de glutamato. Por otro lado, encontramos que GHSR no afecta la neurotransmisión inhibitoria o excitatoria independiente de los CaV ni la maquinaria de exocitosis de vesículas sinápticas. En base a nuestros resultados, postulamos que la selectividad del efecto de GHSR está vinculada con la mayor dependencia de la neurotransmisión GABAérgica del subtipo CaV2.2 respecto de CaV2.1. Esto es coincidente con varios estudios que reportan una mayor dependencia de la liberación de GABA con los CaV2.2, mientras que la neurotransmisión glutamatérgica depende en mayor medida de los CaV2.1. Para evaluar las consecuencias fisiológicas del efecto que observamos en neuronas en cultivo exploramos cómo afecta la actividad constitutiva de GHSR al circuito hipocampal intacto. El giro dentado es el punto de ingreso al circuito principal de la formación hipocampal, y funciona como un filtro fuertemente controlado mediante interneuronas locales. Observamos que la actividad constitutiva de GHSR reduce la transmisión GABAérgica local en el giro dentado en rebanadas horizontales de cerebro de ratón, mientas que no modifica la salida excitatoria del giro dentado a las neuronas piramidales de CA3. En resumen, en este trabajo de tesis doctoral estudiamos el efecto de la actividad constitutiva de GHSR sobre las corrientes CaV nativas y la transmisión sináptica en neuronas del hipocampo, un área con acceso restringido a ghrelina. El efecto de la actividad constitutiva de GHSR y su selectividad hacia la neurotransmisión GABAérgica dependiente de CaV2.2 podría tener importantes implicancias en los procesos fisiológicos que dependen del hipocampo como el aprendizaje y la memoria, en los cuales GABA ha ganado relevancia en los últimos años.
tesis Acceso Abierto

Estudio de la relación entre la generación de especies reactivas y la actividad antibacteriana de antibióticos de uso clínico y derivados de benceno sulfonilos

Sol Romina Martinez ; María Cecilia Becerra

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En esta tesis doctoral se plantearon tres ejes de trabajo con la finalidad de aportar nuevos conocimientos en relación a la generación de especies reactivas nocivas asociadas a la acción de antibióticos de uso clínico y nuevos derivados de síntesis. Es fundamental la comprensión del impacto fisiológico derivado del tratamiento con sustancias antimicrobianas para la investigación de nuevos blancos terapéuticos, como también la optimización de las terapias existentes. El primer aspecto de estudio involucró la investigación de la perturbación del estado redox en cepas de Staphylococcus aureus sensibles y resistentes a meticilina cuando fueron expuestas al antibiótico bacteriostático Linezolid (LZD). En este sentido, se exploraron los cambios inducidos por LZD en cepas productoras de biofilm y en cepas en estado planctónico, determinándose la acción antibiofilm de LZD. Además, se indagó si el estrés oxidativo estaba vinculado a la acción del agente bacteriostático LZD.   La segunda etapa de trabajo se focalizó en el estudio del daño oxidativo provocado por el antibiótico ciprofloxacina (CIP) con la particularidad de poder evaluar los daños y comprender el impacto fisiológico de un compuesto bactericida en tiempo real. Se estudió el fenómeno de peroxidación lipídica, uno de los eventos oxidativos más perjudiciales para las células, con una sonda fluorescente de gran sensibilidad. La intención de este análisis fue identificar en células individuales la lesión oxidativa y conocer la evolución de este proceso en el tiempo, así como poder visualizar y entender el metabolismo oxidativo desde una óptica muy cercana. Los resultados obtenidos revelaron heterogeneidad de lesiones oxidativas dentro de una población bacteriana proveniente de un mismo clon. De esta manera, se visualizó por primera vez en tiempo real y en bacterias individuales uno de los eventos oxidativos más nocivos para las células. El tercer eje de trabajo estuvo orientado a la búsqueda de nuevos compuestos con actividad antimicrobiana. Los derivados de N-bencenosulfonilos evaluados presentaron actividad frente a cepas Gram negativas como Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa y Gram positivas, S. aureus meticilino sensibles y resistentes. Se investigó la producción de especies reactivas del oxígeno (ERO) y especies reactivas del nitrógeno (ERN) en las diferentes cepas, con el objetivo de evaluar el estrés oxidativo inducido como también la lesión provocada en macromoléculas bacterianas por el desequilibrio oxidativo inducido. Un estudio teórico planteando un potencial receptor, permitió identificar un potencial blanco para estos derivados. Los compuestos ensayados representan prometedoras estructuras químicas para el desarrollo de nuevas clases de antimicrobianos sintéticos.
Mediante estos estudios pudimos concluir que el estrés oxidativo no presenta un rol preponderante cuando las bacterias son expuestas a un agente bacteriostático como LZD. Por su parte, el antibiótico bactericida CIP demostró la inducción de estrés oxidativo en tiempo real y por estudios de células únicas. Además, los derivados de síntesis también revelaron un efecto de tipo bactericida con elevación de especies reactivas en diferentes géneros bacterianos. Esto conlleva a reforzar la hipótesis de que la producción de especies reactivas está asociada a la muerte celular como parte de la acción de los compuestos bactericidas. 
 
tesis Acceso Abierto

Estudio de la resistencia a insecticidas en triatominos y búsqueda de nuevos blancos endocrinos para su control

Natalia Capriotti ; Sheila Ons

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Los programas de control de Chagas, tanto en Argentina como en el resto de Latinoamérica, han estado basados en la utilización de insecticidas neurotóxicos, principalmente piretroides. La reducción de la población del vector sigue siendo en la actualidad la opción más viable en cuanto a estrategias de prevención. Se han identificado poblaciones de Triatoma infestans con moderadas o altas tasas de resistencia a piretroides en áreas endémicas, lo cual se correlaciona con fracasos en las campañas de control. En este trabajo de Tesis Doctoral se abordó la problemática de la resistencia a piretroides en T. infestans y su relación con mutaciones puntuales en el canal de sodio dependiente de voltaje, sitio de acción de dichos insecticidas. Se logró establecer la sensibilidad de un ensayo de detección para una mutación puntual asociada a resistencia (L925I) y se validó el método para el estudio de frecuencias de esta mutación. Frente a las limitaciones de los métodos de control de vectores empleados hasta la fecha, resulta importante enfocar esfuerzos para conseguir insecticidas más seguros para la salud humana y el medio ambiente, a la vez que selectivos en sus mecanismos de acción para la especie a combatir. Los neuropéptidos y sus receptores, moléculas clave en la señalización y regulación hormonal, son un posible blanco de insecticidas de nueva generación. Para ello es necesario estudiar su estructura, bioquímica y función biológica, dado que los neuropéptidos intervienen en los eventos fisiológicos fundamentales del ciclo de vida. En esta Tesis se realizó un screening de la posible función diurética y/o antidiurética de distintos neuropéptidos en el insecto Rhodnius prolixus, y además se evaluó su función miotrópica. Los resultados apuntan hacia una implicación del neuropéptido CCH amida en la diuresis, y de los neuropéptidos sNPF y Orcoquininas en la regulación de la actividad contráctil en distintos tejidos. Hasta el desarrollo de esta Tesis Doctoral, no se tenía conocimiento de la función de estos neuropéptidos en triatominos.
tesis Acceso Abierto

Estudio de las propiedades tecnológicas, antimicrobianas, antifúngicas y secuestrantes de aflatoxina de los subproductos de la industria cervecera artesanal y su potencial como aditivo en la alimentación para aves

Sofía Sampaolesi ; Ángela María León Peláez ; Graciela Liliana De Antoni

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La cerveza es la bebida alcohólica más consumida a nivel mundial. En Argentina, su consumo se ha intensificado en las últimas décadas y diversificado en años recientes, de la mano del fenómeno de las cervecerías artesanales de pequeña y mediana escala, que se distribuyen a lo largo y ancho de nuestro país. Los cerveceros artesanales buscan mejorar su proceso de elaboración de forma permanente y ampliar la variedad de estilos de cerveza y de ingredientes incorporados a sus recetas. Desde las inquietudes suscitadas en su quehacer artesanal en la cervecería, una cooperativa de productores locales platenses acudió a la Universidad en busca de asistencia técnica. Nuestro grupo de investigación adoptó el desafío de caracterizar starters cerveceros y sus levaduras aisladas respecto de sus propiedades tecnológicas y de estudiar la estabilidad de los starters mixtos con el objetivo de asesorar a los cerveceros respecto de su manipulación. Por otro lado, la elaboración de esta bebida apareja la generación de residuos sólidos, como el bagazo de malta y las levaduras floculadas, que suponen un problema de descarte para los cerveceros artesanales. Los elevados costos de procesamiento que requieren los desechos de alta carga orgánica para su adecuado descarte son inasequibles para productores cerveceros de pequeña y mediana escala. Sin embargo, es posible reutilizar estos residuos sólidos, de considerable valor nutritivo, como materia prima para la producción de alimento balanceado para animales. A la luz de las inquietudes y demandas del sector de los cerveceros artesanales locales y con la experiencia de nuestro grupo de investigación en el estudio de microorganismos probióticos y antifúngicos y su aplicación en alimentación animal, la presente tesis abordó de forma amplia la caracterización de levaduras cerveceras con potencial para ser empleadas como aditivo alimenticio en pequeños establecimientos avícolas. A partir de la bibliografía consultada, surgieron múltiples hipótesis acerca de la funcionalidad de las levaduras activas presentes en el residuo de cervecería. Por un lado, numerosos estudios dan cuenta de las propiedades y los mecanismos probióticos de Saccharomyces cerevisiae var. boulardii, especialmente en el antagonismo de enteropatógenos como Escherichia coli y Salmonella sp. Esta levadura guarda estrecha relación taxonómica con S. cerevisiae cervecera, lo que sugiere que ciertas cepas empleadas en la elaboración de cerveza y que forman parte del residuo de fermentación podrían compartir algunos aspectos probióticos con S. boulardii. Siguiendo esta hipótesis, un alimento balanceado formulado con el residuo de levaduras cerveceras podría redundar en propiedades probióticas antimicrobianas y tener efecto positivo en la sanidad de aves de cría. Por otro lado, se ha reportado la capacidad biocontroladora sobre hongos filamentosos y secuestrante de micotoxinas de levaduras aisladas de diferentes nichos. La contaminación del alimento balanceado por hongos filamentosos reduce su calidad nutricional y se ve favorecida en condiciones inadecuadas de almacenamiento, como la alta humedad y la ventilación insuficiente frecuentes en silos. Muchos de estos hongos son capaces de producir micotoxinas, metabolitos tóxicos de alto impacto en la sanidad animal y en los parámetros zootécnicos. La contaminación fúngica, además de producir pérdidas económicas sustanciales para la actividad pecuaria, es riesgosa para la salud humana, ya que ciertas micotoxinas, como la aflatoxina B1, sufren biotransformación y acumulación en el cuerpo del animal y pueden llegar a ser consumidas por personas a través de su carne. Otra de las hipótesis de este trabajo es que las levaduras vivas que componen el residuo cervecero podrían actuar como agentes de biocontrol fúngico y secuestrantes de micotoxinas en el alimento balanceado adicionado. La presente tesis abordó la caracterización del desecho de levaduras floculadas de la fermentación cervecera sin pre-tratamientos de secado o inactivación. Este residuo incluye a la levadura activa y al sobrenadante de mosto fermentado, que contiene etanol y otros metabolitos potenciales antagonistas. Adicionalmente, se estudiaron aspectos tecnológicos de la producción cervecera vinculados a la manipulación de levaduras y de starters mixtos, de interés para los cerveceros artesanales locales. El capítulo 4 detalla los resultados de la etapa de aislamiento e identificación a nivel de cepa de levaduras provenientes de la actividad cervecera, tanto de muestras provistas por productores artesanales locales como de muestras comerciales. Entre las levaduras pertenecientes al género Saccharomyces, se estudió la presencia de híbridos interespecíficos, particularmente Saccharomyces pastorianus, el híbrido natural propio del nicho cervecero, empleado en la producción de cerveza lager. Este capítulo también aborda la caracterización tecnológica de las levaduras aisladas a través del estudio de sus parámetros de crecimiento en sustratos de interés para la producción cervecera y de sus parámetros fermentativos del mosto de cebada, mediante la realización de micro-fermentaciones a escala de laboratorio. Adicionalmente, se estudió la capacidad de levaduras S. cerevisiae aisladas de kefir de agua de llevar a cabo la fermentación del mosto de cebada en las condiciones mencionadas, como estudio exploratorio de una fuente alternativa de potenciales nuevas cepas cerveceras. En el capítulo 5 se inicia la caracterización funcional de las muestras cerveceras completas y de las cepas aisladas a partir de las mismas, evaluando su capacidad de sobrevivir a las condiciones del tracto gastrointestinal de pollos emulado in vitro. A continuación, se abordó el estudio de sus propiedades auto-agregantes y co-agregantes con enteropatógenos, de su capacidad de producir metabolitos con efecto bacteriostático y bactericida, de adherirse a un modelo celular de epitelio intestinal y el efecto del co-cultivo de levaduras y bacterias sobre la infectividad y el daño celular producido por enteropatógenos en el modelo intestinal. En el capítulo 6 se describe la caracterización de levaduras cerveceras seleccionadas respecto de sus propiedades biocontroladoras de Aspergillus sp. y secuestrantes de aflatoxina B1. Se estudió el efecto de la presencia de levaduras cerveceras y sus metabolitos solubles sobre la germinación y crecimiento de Aspergillus flavus y Aspergillus parasiticus toxigénicos; se determinó el efecto de metabolitos volátiles producidos por las levaduras sobre el desarrollo fúngico; se cuantificó la capacidad de las levaduras de secuestrar aflatoxina B1 y su efecto citoprotector sobre una línea celular de hepatocitos expuesta a la micotoxina. El capítulo 7 inicia con la producción de un residuo de levaduras en el laboratorio, explorando el proceso de elaboración de cerveza y el producto de fermentación del mosto obtenido al emplear un starter cervecero mixto en diferentes esquemas de co-fermentación. Se determinó la capacidad de dicho residuo de capturar y retener aflatoxina B1 luego del pasaje por el tracto gastrointestinal de pollos simulado in vitro. Finalmente, se formuló y caracterizó fisicoquímica y microbiológicamente un alimento balanceado para pollos adicionado con el residuo de levaduras, y se estudió su capacidad de biocontrolar la micobiota natural presente en el alimento en condiciones de humedad y temperatura que favorecen el desarrollo de hongos filamentosos.
tesis Acceso Abierto

Estudio de los quironómidos subfósiles como indicadores de las variaciones en el clima regional a ambos lados de la Diagonal Árida (Patagonia y Pampa) en los últimos 1000 años

Fernanda Montes de Oca ; Julieta Massaferro ; Cecilia Laprida

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Las reconstrucciones paleoambientales y paleoclimáticas a partir de indicadores (proxies) archivados en los sedimentos acumulados en los lagos, permiten conocer la dinámica de estos ecosistemas y la respuesta de los mismos frente a la variabilidad ambiental pasada a distintas escalas que van desde milenios a decenios de años. Los cambios en el clima y la actividad antrópica son las principales forzantes de cambio en los ambientes lacustres. Los restos subfósiles de las larvas de quironómidos (Diptera: Chironomidae) son útiles paleoindicadores (paleoproxies) biológicos porque responden a los cambios en las condiciones ambientales del pasado. Además, son utilizados en estudios multiproxy ya que proveen información independiente que, combinada con otros proxies, genera una respuesta integrada de las condiciones ambientales que reinaron en el pasado. Los últimos estudios paleolimnológicos del norte de la Patagonia y centro de Argentina indican la existencia de un contraste regional en cuanto a precipitaciones y temperaturas que se evidencia a lo largo de la Diagonal Árida Argentina. Esta franja escinde dos grandes conjuntos de sistemas lacustres con diferente regulación hídrica y con respuesta paleohidrológicas contrarias frente a fases climáticas conocidas, como por ejemplo la Pequeña Edad de Hielo. El objetivo principal de esta tesis fue estudiar las variaciones ambientales (naturales y antrópicas) registradas durante los últimos ca. mil años a ambos lados de la Diagonal Árida (DA) con el fin de aportar nuevas evidencias del contraste climático regional (anti-fase). Para ello se estudiaron y compararon los ensambles de quironómidos subfósiles contenidos en secuencias sedimentarias lacustres ubicadas a un lado y otro de la DA. Las secuencias sedimentarias seleccionadas fueron Laguna la Barrancosa (37° S) en el suroeste de la provincia de Buenos Aires, región Pampeana y Lagunas Verde y Toncek (41° S) en el noroeste de Patagonia. Para reconstruir la historia ambiental de cada laguna y relacionarla con los eventos climáticos de los últimos 1000 años, se incorporó información provista por otros proxies sedimentarios como los pigmentos fotosintéticos fósiles (derivados de clorofila y carotenoides totales), la materia orgánica y en los casos que fue posible, información geoquímica (N, C, S) y de ostrácodos. Los resultados obtenidos en cada secuencia sedimentaria a partir de los indicadores estudiados permitieron definir diferentes intervalos de tiempo o períodos con distintas condiciones ambientales. Se definieron 3 períodos climáticos en la historia ambiental de la laguna La Barrancosa: Un primer período oscilante entre condiciones secas y húmedas, entre ~610-1278 AD, coincidentes en parte con la Anomalía Climática Medieval; un segundo período, entre ~1278-1947 AD dominado por condiciones más secas asociada al período la Pequeña Edad de Hielo; y finalmente un tercer período, el más actual, entre 1947-2012 AD, dominado por condiciones húmedas en su primera parte y coincidente con el Salto Climático del siglo XX. La dinámica ambiental, en la historia más reciente de la laguna ubicada en el suroeste de la provincia de Buenos Aires, estuvo marcada por una fuerte impronta de las actividades antrópicas en la región y por el incremento de las precipitaciones con inicio en la década del 1940. Durante el siglo XV, se infirió el establecimiento de un ambiente temporal sub-salino y un balance hidroclimático negativo. Durante la década de 1970, La Barrancosa se habría establecido como una laguna permanente en estado trófico “claro”, asociado al incremento en las precipitaciones regionales (Salto Climático del siglo XX) y al cambio ecológico regional que impulsó el cambio en los patrones de circulación y precipitaciones de esa región. Desde 1990, los procesos de eutrofización en la laguna se aceleraron, probablemente como consecuencia del incremento en la actividad agrícola que registró el área y por el uso de técnicas agrícolas modernas basadas en el uso intensivo de fertilizantes y pesticidas. Otras actividades como la siembra de la especie Odontesthes bonariensis, podría haber favorecido los procesos de eutrofización en la laguna. En la Laguna Verde se definieron 3 períodos climáticos diferentes: el primero de ellos entre ~1561-~1670 AD dominado por condiciones frías y húmedas coincidente, en parte, con el transcurso de la Pequeña Edad de Hielo en Patagonia; un segundo período ~1670- ~1878 AD dominado en su última parte por condiciones mayormente secas; y por último el tercer período, el más actual entre ~1878-2012 AD coincidente en su última parte con el calentamiento global del siglo XX registrando condiciones climáticas más cálidas que en el período anterior. Por último el registro sedimentario de la laguna Toncek, permitió definir 2 períodos climáticos, el primero de ellos (~1644-1960 AD) dominado mayormente por condiciones frías. En la primera parte de este período y hasta ~ 1870 AD habrían dominado condiciones húmedas y frías coincidente también con el transcurso de la Pequeña Edad de Hielo. Y un segundo período 1960 AD-2012 AD, coincidente con el calentamiento global del siglo XX que habría permitido un leve incremento en la productividad de la lagunas. Las importantes diferencias en cuanto a riqueza y abundancia que se observan en los registros de quironómidos subfósiles de las lagunas Verde y Toncek, se relacionan principalmente a condiciones locales (ubicación por encima y por debajo de la línea de crecimiento arbóreo, tipo de cuenca cerrada o abierta, presencia o ausencia de macrófitas) que, entre otras diferencias, definen la contribución de material orgánico, con gran impacto en la dinámica del ambiente y en la composición faunística. En términos generales, las paleocomunidades de quironómidos de cada ambiente reflejaron cambios importantes en su composición y abundancia frente a eventos climáticos, hidrológicos y antrópicos ocurridos durante los últimos 1000 años en el sudoeste de la provincia de Buenos Aires y últimos 500 años en el sector noroeste de Patagonia. Sin embargo, en todos los registros los cambios más notorios se evidenciaron en los últimos 100 años de la historia evolutiva de cada laguna y particularmente en los ambientes del Noroeste de Patagonia por el impacto recurrente de caída de cenizas en el área, proveniente del área cercana chilena durante los últimos 200 años. Las reconstrucciones paleoambientales efectuadas a un lado y otro de la DA permitieron observar patrones de respuesta opuestos en cuanto a cambios en los niveles de agua y productividad durante el período climático frío denominado Pequeña Edad de Hielo. Los cambios hidroclimáticos de los últimos 1000 años, fueron más notorios en el ambiente pampeano, Laguna La Barrancosa, ubicado en el suroeste de la provincia de Buenos Aires. Por otro lado en todos los registros, se observaron cambios de productividad en los últimos 100 años, los cuales estarían asociados a una combinación de 1) aumento de temperatura durante el calentamiento global del siglo XX (desde ~1900) y 2) incremento en las actividades antrópicas (con mayor evidencia en la región pampeana) combinadas con las características propias y locales de cada ambiente (régimen hídrico, cuenca, procesos intrínsecos).
tesis Acceso Abierto

Estudio de reactividad de iso(tio)natos para la obtención de (tio)ureidos

Elizabeth Contreras Aguilar ; Sonia Elizabeth Ulic ; Jorge L. Jios

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En este trabajo de tesis doctoral se sintetizaron y caracterizaron cuatro familias de compuestos, las que se pueden describir como: i) carbonil isocianatos, ii) carbonil isotiocianatos, iii) carbonil ureidos y iv) carbonil tioureidos. El grupo isocianato está compuesto por enlaces dobles acumulados N=C y C=O. Gran parte de la reactividad de este grupo radica en la alta electronegatividad del oxígeno y del nitrógeno, lo cual hace que el carbono central sea altamente electrofílico, a la vez que el grupo concentra una alta densidad electrónica en sus enlaces pi. La alta reactividad química en solución acuosa de los isocianatos los hace particularmente tóxicos que se refleja en el efecto irritante directo sobre los pulmones, los ojos, la piel y la mucosa expuesta. Los efectos directos pueden ser instantáneos como en el caso de MIC (metilisocianato) o manifestarse después de un tiempo. Los polímeros derivados de isocianatos, que incluyen poliureas, poliisocianuratos y poliuretanos, resultan una de las aplicaciones más importantes. Esto se debe a la alta reactividad del grupo isocianato con cualquier molécula que contenga un hidrógeno activo, como por ejemplo alcoholes, aminas, agua y tioles. Para testear la potencial bioactividad de los nuevos (tio)ureidos estudiados en este trabajo, algunos de los compuestos obtenidos fueron evaluados por su inhibición de Quorum sensing (QS) en Pseudomonas aeruginosa y Chromobacterium violaceum.
tesis Acceso Abierto

Estudio del efecto de genes involucrados en el desarrollo de la vía secretoria y su aplicación a la producción de proteínas recombinantes en células vegetales

Flavia Noelia Mazzini ; Silvana Petruccelli

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El desarrollo de los sistemas de expresión basados en plantas para la producción de proteínas recombinantes constituye un paradigma tanto en la producción de biológicos como de proteínas con diversas aplicaciones como son la investigación médica, la medicina regenerativa, como también las destinadas a la producción de biocombustibles, entre otros. El uso de esta tecnología se consolidó en distintos mercados gracias a algunas ventajas que permitían lidiar con las fallas de los sistemas tradicionales, como por ejemplo la rápida escalabilidad de la producción, la capacidad de síntesis de moléculas que no se sintetizan eficientemente en otros sistemas y la ausencia de endotoxinas y seguridad intrínseca. Las plantas representan además, un sistema de expresión sustentable y amigable con el medio ambiente. Este trabajo de tesis pretende contribuir al conocimiento de las plantas como fábricas de proteínas recombinantes y se basó en dos grandes aspectos. Por un lado, las condiciones de crecimiento de las plantas, teniendo en cuenta un factor clave que es el bajo costo tanto en la producción de biomasa, como de infraestructura y del proceso downstream. Y por otro lado, el estudio de estrategias que incrementen el rendimiento de producción, teniendo en cuenta que los mismos se encuentran limitados por procesos como el correcto plegado de proteínas y el transporte de las mismas a través de la vía secretoria hacia su destino final. En una primera sección, se analizó el efecto de la utilización de iluminación LED Full Spectrum o Rojo-Azul sobre el crecimiento de plantas Nicotiana benthamiana y sobre la producción de proteínas recombinantes en sistemas de expresión transitoria, con respecto a un sistema de iluminación tradicional como son los tubos fluorescentes blancos fríos. Para ello, en primer lugar se determinó la intensidad de luz emitida por cada una de las fuentes de luz estudiadas. Luego se evaluaron parámetros de crecimiento y fisiológicos de plantas Nicotiana benthamiana crecidas durante cuatro semanas bajo las distintas luces, como su altura, color, diámetro de hoja, y contenido relativo de agua (CRA). La mejor condición para el crecimiento de las plantas fue la de tubos fluorescentes o luces LED Full Spectrum para las cuales las plantas presentaron una coloración verde oscura, tamaños de planta y hojas adecuados para ensayos de agroinfiltración y valores de CRA superiores a 90%. Por otro lado, para evaluar el efecto de las luces sobre la producción de proteínas recombinantes, se analizaron los niveles de expresión de dos proteínas reporteras retenidas en el retículo endoplásmico: la proteína fluorescente verde (RE-GFP) y la enzima β glucuronidasa (RE-GUS). La mejor condición de luz para la producción de estas proteínas reporteras fue la de tubos fluorescentes, donde se alcanzaron los mayores niveles de RE-GFP y RE GUS y en donde se obtuvieron los niveles más bajos de la chaperona BiP, que es indicadora de estrés en el retículo endoplásmico. En la segunda sección de este trabajo, se exploró una estrategia de ingeniería de la vía secretoria a partir del estudio del efecto de la sobreexpresión de distintos genes candidatos sobre la producción de proteínas recombinantes. Los genes candidatos codifican para factores de transcripción del tipo bZIP, homólogos a aquellos que se expresan durante la diferenciación de células secretorias profesionales en otros organismos, o para chaperonas involucradas en el plegado proteico, que se expresan durante fase de acumulación de proteínas de reserva en semillas y también tienen un rol en los procesos vinculados a estrés, tal como la respuesta a proteínas mal plegadas o UPR. Los genes estudiados en este trabajo codifican para los factores AtbZIP60 (AT1G42990; NM_103458), AtbZIP28 (AT3G10800; NM_111917) y AtbZIP17 (AT2G40950; NM_129659), en sus formas completa o truncada (sin dominio C-terminal – ΔC) y para la chaperona Calnexina1 (CNX1) (AT5G61790). Se evaluó su efecto sobre la expresión de las proteínas reporteras sencillas RE GFP y RE-GUS y sobre la expresión de proteínas de interés más demandantes en su plegado como la versión simple cadena del anticuerpo 2G3 fusionado a la proteína fluorescente roja y un tag de histidinas (RFP-ScFv-KDEL) y el anticuerpo monoclonal tetramérico 14D9. Los resultados obtenidos muestran que la expresión de los genes codificantes para la forma activa del factor AtbZIP28ΔC o la chaperona Calnexina1, provoca un incremento en los niveles de GUS y GFP, como también de moléculas más demandantes para el plegado como los anticuerpos simple cadena 2G3 (RE-RFP-2G3) y multimérico 14D9. La co-expresión de la forma activa del factor bZIP60ΔC, también produjo incrementos en los niveles de acumulación de las reporteras GUS y GFP pero fue menos efectiva que la obtenida con los genes del bZIP28ΔC o Calnexina1. Este trabajo demuestra que la expresión de los genes codificantes para la forma activa del factor AtbZIP28ΔC o la chaperona Calnexina1, representa una estrategia válida para incrementar los niveles de proteínas reporteras con distintos requerimientos de plegado en plantas Nicotiana benthamiana por ensayos de expresión transitoria.