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Se conocen varios sistemas de dirección de proteínas desde su lugar de síntesis hacia donde cumplen su función. Entre los mejor estudiados está uno de los que permite que las. enzimas lisosomales neosintetizadas se dirijan a los lisosomas de las células de mamíferos. Tal como se lo conoce, este sistema de transporte se basa en cuatro componentes: a) un dominio específico común en todas las enzimas lisosomales que lo emplean, b) la enzima clave UDP — N - Acetilglucosamina : Enzima Lisosomal N — Acetilglucosamina — l — Fosfotransferasa (GlcNAc — fosfotransferasa), que reconoce específicamente este dominio común y transfiere GlcNAc-l-fosfato a determinadas manosas de los oligosacáridos de alta manosa de los aceptores, c) una α-N-Acetilglucosamina-l- Fosfodiester N — Acetilglucosaminidasa, que hidroliza la N—acetilglucosamina generando el marcador manosa 6-fosfato, y d) dos receptores de manosa 6-fosfato que median el transporte de las enzimas lisosomales hasta los lisosomas. La enzima clave es la GlcNAc-fosfotransferasa porque reconoce las enzimas lisosomales de entre otras proteínas no lisosomales que contienen oligosacáridos similares de alta manosa. La enzima tiene un sitio catalítico que interacciona con la manosa a la que transferirá la N-acetilglucosamina-l-fosfato, y otro sitio que reconoce específicamente un dominio común a todas las enzimas lisosomales que emplean la vía de la manosa 6-fosfato para su transporte a los lisosomas. La GlcNAc-fosfotransferasa de mamífero mejor caracterizada es la de hígado de rata, una enzima anclada a membrana localizada en el aparato de Golgi. Cataliza la transferencia de N —acetilglucosamina —1 - fosfato desde UDP —N - acetilglucosamina a manosas alfasustituídas en el carbono anomérico. Esta GlcNAc-fosfotransferasa muestra una gran afinidad por enzimas lisosomales, con Km aparentes menores a 20 μM y eficiencias como aceptores (Vmax /Km) mayores de 160 para estas proteínas, contra Km del orden milimolar y eficiencias cercanas a 1 para glicoproteínas no lisosomales con oligosacáridos de alta manosa similares. Hasta el momento la enzima se describió con algún detalle en mamíferos y en la ameba Acanthamoeba castellanii, aunque en esta última no se han detectado los demás componentes del sistema de transporte a lisosomas. También se describió una GlcNAc-fosfotransferasa en Dictyostelium discoideum , pero esta, a diferencia de las anteriores, no tiene la capacidad de discriminar entre enzimas lisosomales de mamífero y otras glicoproteínas. Purificación de la GlcNAcfosfotramferasa de A. castellanii La GlcNAc-fosfotransferasa fue purificada parcialmente a partir de membranas de Golgi de hígado de rata unas 750 veces, y la de linfoblastos humanos fue purificada 3.800 veces. Hasta la fecha no ha.sido posible lograr preparaciones de mayor pureza de la enzima de mamíferos, en parte debido a la dificultad en obtener cantidades suficientemente grandes de estos materiales de partida, y también por su relativamente baja actividad específica. En la A. castellanii la GlcNAc-fosfotransferasa tiene una actividad específica unas cien veces mayor que en mamíferos y presenta características cinéticas y de especificidad de sustrato similares. Además es un microorganismo fácilmente cultivable en grandes cantidades, por lo que aparece a priori como la fuente ideal para encarar la purificación de esta enzima a homogeneidad. En el presente trabajo se describe la purificación 65.000 veces de la GlcNAcfosfotransferasa presente en membranas de la ameba A. castellanii. La enzima se solubilizó de las membranas con los detergentes Lubrol PX y desoxicolato de sodio, y se purificó mediante cromatografías con las lectinas Concanavalina A y de Triticum vulgaris, el intercambiador iónico Q-Sepharosa, y cromatografía de exclusión molecular en Superosa 12. Las proteínas eluídas de la columna de Superosa 12 se analizaron por electroforesis desnaturalizante en geles de poliacrilamida y se observaron solo dos bandas con un perfil de intensidades coincidente con el de la actividad enzimática. Estas proteínas tienen pesos moleculares relativos de 71 kDa y 82 kDa. El peso molecular aparente de la GlcNAcfosfotransferasa nativa estimado por filtración por gel está entre algo más de 1.000 kDa y 130 kDa según la preparación, apareciendo la mayoría de las veces como de 570 kDa. Parece probable que las proteínas de 7l y 82 kDa estén unidas en estado nativo, sea como subunidades de una forma activa mayor, o como agregados menos definidos. Para confirmar la identificación de la GlcNAc-fosfotransfersa se obtuvieron anticuerpos contra esta enzima. Para ello se inmunizaron ratones con preparaciones de GlcNAcfosfotransferasa purificada más de 10.000 veces, produciéndose anticuerpos policlonales específicos para proteínas de A. castellanií y con alta afinidad por la enzima. Tanto preparaciones crudas como altamente purificadas de GlcNAc-fosfotransferasa se cromatografiaron por columnas de exlusión molecular, en las que la actividad presentó volúmenes de elución variables que dependieron de la preparación. Las proteínas de las fracciones eluídas se separaron por electroforesis y se efectuaron inmunoblots que se revelaron con el antisuero de ratón. Analizando las proteínas que reaccionaron con el anticuerpo y cuyo perfil de intensidades se correspondió con el de la actividad GlcNAcfosfotransferasa, se confirmó que las dos proteínas de 71 y 82 kDa son probablemente subunidades o fragmentos de subunidades de la GlcNAc-fosfotransferasa. Identificación de una actividad GlcNAc-fosfotransferasa en pupas de la mosca mediterránea de lafruta Ceratitis capitata. Está bien establecida la existencia de lisosomas en los insectos, pero hasta ahora no se había descripto nada sobre el transporte de hidrolasas ácidas hacia esas organelas, ni la presencia de enzimas de la vía metabóica de la manosa 6-fosfato. Cabe la posibilidad de que se utilize un sistema similar al que hasta ahora solo había sido encontrado en los mamíferos. Como parte del trabajo para esta tesis, se caracterizó por primera vez una actividad GlcNAc-fosfotransferasa en el díptero C. capitata . Para este estudio se usó un sistema de enzayo in vitro en la búsqueda de indicios sobre el sistema de transporte de enzimas lisosomales a los lisosomas de insectos. Se ha establecido la presencia de una actividad GlcNAc-fosfotransferasa asociada a membranas en pupas de seis días de la mosca mediterránea de la fruta C. capitata , capaz de transferir GlcNAc-l-fosfato desde UDP-N-acetilglucosamina a a-metilmanósido. Se demostró también que el producto es N-acetilglucosamina-(l,6)-fosfato-(α1-metilmanósido), similar al descripto para otras GlcNAc-fosfotransferasas con este sustrato. Se encontró además que las propiedades catalíticas de la GlcNAc-fosfotransfersa de C. capitata con estos sustratos. son similares a las de aquella que se encuentra en células de mamíferos, a la de la ameba A. castellanii y a la de D. discoídeum . La enzima presentó in vitro un pH óptimo de 7,0; una temperatura óptima de incubación de 30 °C, y requirió de Mn2+ o Mg2+ para su actividad. La enzima transfiere también N-acetilglucosamina-l-fosfato a manosas presentes en oligosacáridos del tipo de alta manosa, tanto de glicoproteínas endógenas como de uteroferrina, una enzima lisosomal de mamíferos. Por esta última presentó un Km ap de 63 μM,similar al de la GlcNAc-fosfotransferasa de mamíferos. Al igual que esra última, se mostró capaz de discriminar entre enzimas lisosomales y las que no lo son, pero que poseen oligosacáridos similares de alta manosa.

Se conocen varios sistemas de dirección de proteínas desde su lugar de síntesis hacia donde cumplen su función. Entre los mejor estudiados está el que permite que las enzimas lisosomales recién sintetizadas alcancen su destino final dentro de la célula: los lisosomas. Las células de mamíferos utilizan para la localización de las hidrolasas ácidas principalmente el marcador manosa 6-P . Este sistema de transporte se basa de cuatro componentes :a) un dominio proteico específico común presente en todas las enzimas lisosomales que lo utilizan ; b) la enzima clave UDP-N-acetilglucosamina: enzima lisosomal-N-acetilglucosamina-1-fosfotransferasa (GlcNAc-fosfotransferasa) que reconoce dicho dominio y transfiere N-acetilglucosamina a determinadas manosas sobre los oligosacáridos de alta manosa de los aceptores ; c) una N-acetilglucosamina-1-fosfodiester α-N-acetilglucosaminidasa (GlcNAc-fosfodiesterasa), que hidroliza la N-acetilglucosamina generando el marcador manosa 6-P ; y d) receptores de manosa 6-P que median el transporte de las hidrolasas ácidas hacia los lisosomas. Las membranas de dos eucariotas unicelulares , la Acanthamoeba castellanii y Dytiostellium discoideum tienen una actividad enzimática capaz de transferir N-acetilglucosamina 1-fosfato a partir de UDP-N-acetilglucosamina a residuos de manosa sobre oligosacáridos de alta manosa . La ausencia de la segunda enzima de este camino metabólico y de un receptor capaz de reconocer el marcador manosa 6-P, sugiere que la GlcNAc-fosfotransferasa sirve en estos organismos para una diferente función celular. No se ha detectado en el protozoo Trypanosoma cruzi actividad de GlcNAc-fosfotransferasa, ni se han encontrado residuos de fosfato sobre los oligosacáridos de alta manosa de glicoproteínas totales o de una enzima lisosomal purificada. En plantas y levaduras las hidrolasas ácidas están en las vacuolas, equivalentes morfológicos y funcionales de los lisosomas de mamíferos . Las evidencias indican que en estos sistemas la señal para la localización de las hidrolasas ácidas en dichas organelas es independiente del marcador manosa 6-P y que la misma está codificada dentro de la secuencia aminoacídica primaria de las proteínas allí destinadas. Está bien establecida la existencia de lisosomas en los invertebrados, pero hasta el momento no había datos bibliográficos acerca del transporte de las enzimas lisosomales hacia esas organelas. En invertebrados se había informado de la presencia de fosfato hidrolizable por endo-N-acetilglucosaminidasa H en la vitelogenina de la larva de la mariposa del tabaco, Manduca sexta, marcada con [³²P]. También se había encontrado manosa 6-P en hidrolizados de vitelina aislada de los oocitos de la vinchuca venezolana, Rhodnius prolixus, luego de alimentar los insectos con sangre conteniendo [³²P]. Chao y Raikhel encontraron que el cDNA de una proteasa aspártica ácida (lisosomal) del mosquito Aedes aegypti tiene una secuencia homóloga a la que en la catepsina D, enzima lisosomal de mamíferos, está implicada en la formación del dominio protéico para el reconocimiento por la GlcNAc-fosfotransferasa y la formación de manosa 6-P. Recientemente Guillén y colaboradores (1993) informaron por primera vez de la presencia de una actividad de GlcNAc-fosfotransferasa, primera enzima de la vía metabólica en la formación del marcador manosa 6-P, en las membranas de un díptero, la mosca mediterranea de la fruta, Ceratitis capitata La GlcNAc-fosfotransferasa de Ceratitis capitata presenta propiedades cataliticas similares a las de la enzima de mamíferos . Esta enzima transfiere N-acetilglucosamina 1-fosfato a manosas presentes en los oligosacáridos de alta manosa tanto de glicoproteínas endógenas como de la uteroferrina, una enzima lisosomal de mamíferos. Además al igual que la GlcNAc-fosfotransferasa de mamíferos es capaz de discriminar entre enzimas lisosomales y las que no lo son pero que poseen idénticos oligosacáridos de alta manosa La GlcNAc-fosfotransferasa de Acanthamoeba castellanii también fosforila mejor enzimas lisosomales que glicoproteínas no lisosomales, sin embargo no existe en estos organismos direccionamiento de hidrolasas ácidas a través del marcador manosa 6-P. Por lo tanto, la existencia de la GlcNAc-fosfotransferasa específica en Ceratitis capitata no indicaba necesariamente que estuviera toda la vía. Para estudiar la presencia del sistema de translocación de enzimas lisosomales que utiliza el marcador manosa 6-P en invertebrados se utilizó como modelo experimental un crustáceo, el cangrejo de estuario Chasmagnatus granulata. El hepatopáncreas de Chasmagnatus granalata se utilizó como fuente de hidrolasas ácidas. Se purificó a homogeneidad una de ellas, la α-L-fucosidasa. Sobre los oligosacáridos de alta manosa de glicoproteínas solubles totales y en particular sobre los de la α-L-fucosidasa, se determinó la presencia de manosa-P. También sobre los oligosacáridos de alta manosa de glicoproteínas totales se encontró N-acetilglucosamina unida externamente a los mismos través del C1, ya que pudo ser removida por un tratamiento de hidrólisis ácida suave. En las membranas del hepatopáncreas se encontraron además actividades de GlcNAc-fosfotransferasa y GlcNAc-fosfodiesterasa, primera y segunda enzima de la vía que utiliza el marcador manosa 6-P y una posible molécula receptora para la fosfomanosa. UDP-N-acetilglucosamina: enzima lisosomal-N-acetilglucosamina-1-fosfotransferasa (GlcNAc-fosfotransferasa). La actividad de GlcNAc-fosfotransferasa de Chasmagnatus granulata es capaz de transferir in vitro N-acetilglucosamina 1-fosfato a α-metilmanósido. El producto que se forma a partir de esta reacción es GlcNAc-(α1,6) P-(α 1-metilmanósido), similar al descripto para otras GlcNAc-fosfotransferasas . La actividad específica de la GlcNAc-fosfotransferasa de Chasmagnatus granalata está entre las más bajas descriptas hasta el momento. Esta enzima, al igual que la de mamíferos y la de Ceratitis capitata , fosforila mejor enzimas lisosomales que glicoproteínas no lisosomales. La GlcNAc-fosfotransferasa de Chasmagnatus granulata tiene requerimientos de pH y de catiomes similares a los informados para las enzimas de mamíferos y de Ceratitis capitata . N-acetilglucosamina-1-fosfodiester α-N-acetilglucosaminidasa (GlcNAc-fosfodiesterasa) Hasta este momento no se había descripto una actividad de GlcNAc-fosfodiesterasa en organismos distintos de los vertebrados. La GlcNAc-fosfodiesterasa de Chasmagnatus granulata es capaz de liberar [14C]GlcNAc a partir de [14C]GlcNAc-(α 1,6) P-(α 1-metilmanósido). Esta enzima, al igual que su contraparte de mamíferos es una enzima integral de membrana, y su actividad no requiere de la presencia de cationes divalentes. Receptores para manosa 6-fosfato En las membranas del hepatopáncreas se encontraron dos proteínas de pesos moleculares aproximados de 215.000-220.000 Da y 205.000 Da capaces de unirse a una columna de afinidad preparada a partir de fosfomanano de levadura unido a Sepharosa 4-B y eluirse especificamente con manosa 6-P. Estas proteínas fueron reconocidas por antisueros preparados contra los receptores para manosa 6-P de 275.000-300.000 Da ( Man-6-P/IGF-II) y de 46.000 Da (CD-MPR)de mamíferos . Dichas proteínas serían las responsables de unir los residuos de fosfomanosa presentes sobre los oligosacáridos de las hidrolasas ácidas de Chasmagnatus granulata. Por lo tanto, en este trabajo de tesis se demostró por primera vez que el camino que usa el marcador manosa 6-P para la translocación de enzimas lisosomales, tal como se Io describió inicialmente en mamíferos, está presente también en invertebrados.

Estudiar la producción de enzimas pectolíticas (tanto novedosas como previamente reportadas) por Aspergillus kawachii, caracterizarlas y compararlas con sus equivalentes de otros orígenes. Considerando la capacidad de A. kawachii de producir enzimas activas en condiciones de alta acidez y al escaso conocimiento de su sistema pectolítico, se inició este trabajo de investigación para contribuir al estudio de las pectinasas de este microorganismo. Este trabajo incluyó el screening de actividades enzimáticas, la producción, purificación y caracterización de la PE activa a bajos valores de pH (2,0-3,0) y su aplicación a la clarificación de jugo de limón.

Bromelia es un género americano originario de zonas tropicales, integrado por unas sesenta especies que desde las Antillas y México se extiende por Sudamérica hasta el norte de Argentina, adonde llegan solamente cuatro especies: Bromelia balanse Mez, B. hieronymi Mez, B. laciniosa Mart. y B. serra Griseb. Las especies argentinas han sido objeto de un detallado estudio en la Cátedra de Botánica: al análisis de las estructuras secretoras presentes en los frutos, responsables de la producción de gomas (Nájera, 1974), le sucedieron trabajos sobre anatomía foliar (Castells y Nájera, 1974) y sobre quimiotaxonomía de flavonoides (Galdeano y García, 1975) y de los propios exudados gomosos (Caffini et al., 1976). Precisamente al estudiar las propiedades de las gomas que en todos los casos aparecen entre los frutos (Pfirter y Cozzarin, 1971; Pfirter et al., 1973 a y b), se advirtió la presencia de actividad caseinolítica en el jugo obtenido por expresión de los mismos. Esta prematura observación de la actividad enzimática exhibida por preparaciones obtenidas en condiciones precarias nos alertó acerca de la posibilidad de encontrarnos frente a nuevas fuentes de enzimas proteolíticas vegetales, constituyendo el principal justificativo de la elección del tema. En esta oportunidad se ha procedido a aislar y caracterizar los productos enzimáticos provenientes de tres de las especies citadas, en razón de las dificultades habidas para obtener frutos de B. serra en condiciones apropiadas. La información que se obtenga sobre la potencia enzimática y las condiciones de acción de estas proteasas podría sugerir la realización de ensayos referidos a la posibilidad de su aplicación en el campo farmacológico e industrial, en cuyo caso podría disponerse de sucedáneos adecuados para reemplazar productos que no se producen en el país.

The Encyclopaedia of Slovenian cultural history in Carinthia (Austria) is conceaved as a pluridisciplinary and intercultural reference work with over 160 authors, some 1000 entries and in total over 2100 conceptual entries covering areas such as history, legal history, sociology, linguistics, dialectology, literature, ethnology, art history, biographic studies, terminology. It provides a cross-linked understanding of the geographical area as well as of the cultural and societal processes in the region from an innovative perspective.

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