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Tesis (Doctor en Astronomía)--Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Matemática, Astronomía y Física, 2010.

Se describe un método rápido, simple y específico para determinar colorimetricamente el glucógeno en concentraciones que varían entre 0,15 y 1 mg/ml con un reactivo de I2 en Ik en presencia de sales. Este procedimiento colorimétrico puede ser utilizado para la determinación del glucógeno contenido en los tejidos. Se puede diferenciar un polisacárido del tipo del glucógeno de uno del tipo de amilopectina, determinando el λ máx. del complejo polisacárido - iodo. Se utilizó este método para medir la actividad de la enzina ramificante. La α-1,4-glucano, α-1,4-glucano 6-glucosiltransferasa ha sido purificada 35 veces respecto de los extractos de hígado de rata. Se logra separar la α-amilasa, por centrifugación de los extractos de hígado co elevado contenido en glucógeno, a alta veocidad. La acción enzimática sobre amilopectina es óptima en buffer climato 0,3 M a pH 6,4. Requiere sales y es inhibida por Mn++, Mg++ y p-ele[…] de sodio. La enzima ramificante de hígado puede utilizar tamibién como substratos anilosa y dextrina β-límite de amilopectina. Se describe un método para ensayar la enzima en presencia de α-anilosa.

Fil:Alconada Magliano, Teresa María. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

En la actualidad los procesos enzimáticos han ido reemplazando algunos de los procesos químicos tradicionales, por cuestiones económicas, ecológicas o por especificidad. Sin embargo, muchas de las enzimas disponibles no soportan las condiciones de reacción industriales. Como resultado de esto, los microorganismos extremófilos son una valiosa fuente de nuevas enzimas. En base a lo expuesto, se plantearon los siguientes objetivos: • Realizar un screening de actividades enzimáticas de ocho cepas de hongos alcalino-tolerantes o alcalofílicos aislados localmente, focalizando el mismo en las enzimas que degradan pared celular vegetal. • Estudiar la producción y purificación de las Rhasas producidas por A. luteo-albus y por A. murorum a los efectos de optimizar la cantidad de enzima producida y de esta forma poder contar con suficiente cantidad de proteína para caracterizarlas bioquímicamente. • Determinar la capacidad de las Rhasas en estudio para hidrolizar sustratos naturales en condiciones de alcalinidad. • Desarrollar diferentes estrategias de clonado del gen que codifica para la poligalacturonasa ácida (PG1) de A. kawachii. • Analizar la expresión de PG1 activa en cada caso, y caracterizar la proteína obtenida a los efectos de evaluar su posible aplicación en procesos biotecnológicos. • Estudiar el crecimiento de Saccharomyces cerevisiae recombinante en un medio de cultivo sintético y su capacidad de producir PG1 recombinante. • Determinar las mejores condiciones de producción de la enzima recombinante en sistemas batch y batch alimentado. • Purificar y caracterizar la proteína obtenida respecto de las características de la enzima silvestre.

Los objetivos del presente trabajo de tesis son: - Explorar la posibilidad de inmovilizar la enzima Fosfolipasa A2 sobre un soporte inerte. - Estudiar la hidrólisis de Lecitina de Soja mediante el uso de enzima Fosfolipasa A2. - Evaluar los efectos de la difusión sobre los parámetros cinéticos de la reacción de hidrólisis. - Efectuar estudios para diseñar un sistema de reacción continuo en el cual la enzima esté bajo la forma insoluble y el sustrato en forma soluble. - Investigar la hidrodinámica de operación, que incluye estudios de empacado, de velocidades de fluidos y evaluación de los efectos sobre la conversión de sustrato y la productividad del reactor. - Comparar diferentes modelos de flujo con los datos obtenidos experimentalmente.

White rot fungi are the only organisms capable to mineralize the lignin to CO2. These fungi posses at least three enzymes impicated in the process: lignin peroxidase, manganese dependent peroxidase and laccase. The screening of 13 strains of white-rot fungi showed that F. sclerodermeus was the more efficient ligninase producer fungus and the decolorization of the polymeric dye poly R was fast. Lip activity was not detected in any of the media tested. Optimal media conditions for laccase and MnP production in synthetic liquid media were found. The Doehlert uniform factorial experimental design was applied to study the effect of MnSO4, CuSO4 and asparagine. Among the aromatic compounds evaluated in GA medium, vanillin and fenilic acid were the more efficient laccase and MnP inducers. On the other hand, in semidefined medium (YPG) aromatic compounds had not effect on any activity. Under this conditions only copper and Mn increased laccase and MnP activities, respectively. Solid state fermentation on wheat or soy bran, high laccase and MnP were produced. Neither aromatic compounds, MnSO4 nor CuSO4 increased none of the activities. The effect on known ligninolytic inducers was studied on a crystalline cellulose (CC) based medium. Cellulolytic activities decreased 3-fold when CuSO4 or MnSO4 were added to the medium. MnP activity was only detected in the media containing MnSO4 as inducer, while the laccase activity was constitutiver expressed under all the conditions tested, and it was increased to a major extent when copper was added to the medium. Wood blocks of poplar incubated during six months with F. sclerodermeus registered dry weight losses of 51%. Differential hydrolysis of the wood blocks revealed that the remaining content of cellulose and lignin were 58 y 56%, respectively. On the other hand, the hydrosolubles increased 3-fold, due to the degradation products. Observation of the wood showed the degradation of parenchyma rays and thinning of the cell walls. Growing on sawdust medium, enzyme activities were produced only with poplar, whereas on cedar laccase and MnP were inhibited. Laccase and MnP produced in YPG medium by F. sclerodcrmeus were purified to electrophoretic homogeneity and characterized biochemically. Two isoenzymes of laccase (Lac I y Lac II) and two MnP (MnP I y MnP II) were found. Isoforms of both systems showed slight differences in their isoelectric points. Laccase activity produced on wheat bran based medium revealed three bands in PAGE with differential patterns of inactivation. Among the compounds tested, the CuSO4 1,25 mM was the best stabilizer. The combination of both CuSO4 and glycerol 0,2% further increased the stability of the enzyme. Laccase activity produced in the optimized conditions was used in assays of decoloration and detoxification of the fungicide malachite green. P. chrysosporium was used as biotest, this Fungus showed a high sensitivity to the fungicide, while degradation by F. sclerodermeus laccase rendered a not toxic compound. The presence of I-HBT accelerated the detoxification. The detoxification response of other white-rot fungi was similar to that observed for P. chrysosporium.

Se conocen varios sistemas de dirección de proteínas desde su lugar de síntesis hacia donde cumplen su función. Entre los mejor estudiados está uno de los que permite que las. enzimas lisosomales neosintetizadas se dirijan a los lisosomas de las células de mamíferos. Tal como se lo conoce, este sistema de transporte se basa en cuatro componentes: a) un dominio específico común en todas las enzimas lisosomales que lo emplean, b) la enzima clave UDP — N - Acetilglucosamina : Enzima Lisosomal N — Acetilglucosamina — l — Fosfotransferasa (GlcNAc — fosfotransferasa), que reconoce específicamente este dominio común y transfiere GlcNAc-l-fosfato a determinadas manosas de los oligosacáridos de alta manosa de los aceptores, c) una α-N-Acetilglucosamina-l- Fosfodiester N — Acetilglucosaminidasa, que hidroliza la N—acetilglucosamina generando el marcador manosa 6-fosfato, y d) dos receptores de manosa 6-fosfato que median el transporte de las enzimas lisosomales hasta los lisosomas. La enzima clave es la GlcNAc-fosfotransferasa porque reconoce las enzimas lisosomales de entre otras proteínas no lisosomales que contienen oligosacáridos similares de alta manosa. La enzima tiene un sitio catalítico que interacciona con la manosa a la que transferirá la N-acetilglucosamina-l-fosfato, y otro sitio que reconoce específicamente un dominio común a todas las enzimas lisosomales que emplean la vía de la manosa 6-fosfato para su transporte a los lisosomas. La GlcNAc-fosfotransferasa de mamífero mejor caracterizada es la de hígado de rata, una enzima anclada a membrana localizada en el aparato de Golgi. Cataliza la transferencia de N —acetilglucosamina —1 - fosfato desde UDP —N - acetilglucosamina a manosas alfasustituídas en el carbono anomérico. Esta GlcNAc-fosfotransferasa muestra una gran afinidad por enzimas lisosomales, con Km aparentes menores a 20 μM y eficiencias como aceptores (Vmax /Km) mayores de 160 para estas proteínas, contra Km del orden milimolar y eficiencias cercanas a 1 para glicoproteínas no lisosomales con oligosacáridos de alta manosa similares. Hasta el momento la enzima se describió con algún detalle en mamíferos y en la ameba Acanthamoeba castellanii, aunque en esta última no se han detectado los demás componentes del sistema de transporte a lisosomas. También se describió una GlcNAc-fosfotransferasa en Dictyostelium discoideum , pero esta, a diferencia de las anteriores, no tiene la capacidad de discriminar entre enzimas lisosomales de mamífero y otras glicoproteínas. Purificación de la GlcNAcfosfotramferasa de A. castellanii La GlcNAc-fosfotransferasa fue purificada parcialmente a partir de membranas de Golgi de hígado de rata unas 750 veces, y la de linfoblastos humanos fue purificada 3.800 veces. Hasta la fecha no ha.sido posible lograr preparaciones de mayor pureza de la enzima de mamíferos, en parte debido a la dificultad en obtener cantidades suficientemente grandes de estos materiales de partida, y también por su relativamente baja actividad específica. En la A. castellanii la GlcNAc-fosfotransferasa tiene una actividad específica unas cien veces mayor que en mamíferos y presenta características cinéticas y de especificidad de sustrato similares. Además es un microorganismo fácilmente cultivable en grandes cantidades, por lo que aparece a priori como la fuente ideal para encarar la purificación de esta enzima a homogeneidad. En el presente trabajo se describe la purificación 65.000 veces de la GlcNAcfosfotransferasa presente en membranas de la ameba A. castellanii. La enzima se solubilizó de las membranas con los detergentes Lubrol PX y desoxicolato de sodio, y se purificó mediante cromatografías con las lectinas Concanavalina A y de Triticum vulgaris, el intercambiador iónico Q-Sepharosa, y cromatografía de exclusión molecular en Superosa 12. Las proteínas eluídas de la columna de Superosa 12 se analizaron por electroforesis desnaturalizante en geles de poliacrilamida y se observaron solo dos bandas con un perfil de intensidades coincidente con el de la actividad enzimática. Estas proteínas tienen pesos moleculares relativos de 71 kDa y 82 kDa. El peso molecular aparente de la GlcNAcfosfotransferasa nativa estimado por filtración por gel está entre algo más de 1.000 kDa y 130 kDa según la preparación, apareciendo la mayoría de las veces como de 570 kDa. Parece probable que las proteínas de 7l y 82 kDa estén unidas en estado nativo, sea como subunidades de una forma activa mayor, o como agregados menos definidos. Para confirmar la identificación de la GlcNAc-fosfotransfersa se obtuvieron anticuerpos contra esta enzima. Para ello se inmunizaron ratones con preparaciones de GlcNAcfosfotransferasa purificada más de 10.000 veces, produciéndose anticuerpos policlonales específicos para proteínas de A. castellanií y con alta afinidad por la enzima. Tanto preparaciones crudas como altamente purificadas de GlcNAc-fosfotransferasa se cromatografiaron por columnas de exlusión molecular, en las que la actividad presentó volúmenes de elución variables que dependieron de la preparación. Las proteínas de las fracciones eluídas se separaron por electroforesis y se efectuaron inmunoblots que se revelaron con el antisuero de ratón. Analizando las proteínas que reaccionaron con el anticuerpo y cuyo perfil de intensidades se correspondió con el de la actividad GlcNAcfosfotransferasa, se confirmó que las dos proteínas de 71 y 82 kDa son probablemente subunidades o fragmentos de subunidades de la GlcNAc-fosfotransferasa. Identificación de una actividad GlcNAc-fosfotransferasa en pupas de la mosca mediterránea de lafruta Ceratitis capitata. Está bien establecida la existencia de lisosomas en los insectos, pero hasta ahora no se había descripto nada sobre el transporte de hidrolasas ácidas hacia esas organelas, ni la presencia de enzimas de la vía metabóica de la manosa 6-fosfato. Cabe la posibilidad de que se utilize un sistema similar al que hasta ahora solo había sido encontrado en los mamíferos. Como parte del trabajo para esta tesis, se caracterizó por primera vez una actividad GlcNAc-fosfotransferasa en el díptero C. capitata . Para este estudio se usó un sistema de enzayo in vitro en la búsqueda de indicios sobre el sistema de transporte de enzimas lisosomales a los lisosomas de insectos. Se ha establecido la presencia de una actividad GlcNAc-fosfotransferasa asociada a membranas en pupas de seis días de la mosca mediterránea de la fruta C. capitata , capaz de transferir GlcNAc-l-fosfato desde UDP-N-acetilglucosamina a a-metilmanósido. Se demostró también que el producto es N-acetilglucosamina-(l,6)-fosfato-(α1-metilmanósido), similar al descripto para otras GlcNAc-fosfotransferasas con este sustrato. Se encontró además que las propiedades catalíticas de la GlcNAc-fosfotransfersa de C. capitata con estos sustratos. son similares a las de aquella que se encuentra en células de mamíferos, a la de la ameba A. castellanii y a la de D. discoídeum . La enzima presentó in vitro un pH óptimo de 7,0; una temperatura óptima de incubación de 30 °C, y requirió de Mn2+ o Mg2+ para su actividad. La enzima transfiere también N-acetilglucosamina-l-fosfato a manosas presentes en oligosacáridos del tipo de alta manosa, tanto de glicoproteínas endógenas como de uteroferrina, una enzima lisosomal de mamíferos. Por esta última presentó un Km ap de 63 μM,similar al de la GlcNAc-fosfotransferasa de mamíferos. Al igual que esra última, se mostró capaz de discriminar entre enzimas lisosomales y las que no lo son, pero que poseen oligosacáridos similares de alta manosa.

Se conocen varios sistemas de dirección de proteínas desde su lugar de síntesis hacia donde cumplen su función. Entre los mejor estudiados está el que permite que las enzimas lisosomales recién sintetizadas alcancen su destino final dentro de la célula: los lisosomas. Las células de mamíferos utilizan para la localización de las hidrolasas ácidas principalmente el marcador manosa 6-P . Este sistema de transporte se basa de cuatro componentes :a) un dominio proteico específico común presente en todas las enzimas lisosomales que lo utilizan ; b) la enzima clave UDP-N-acetilglucosamina: enzima lisosomal-N-acetilglucosamina-1-fosfotransferasa (GlcNAc-fosfotransferasa) que reconoce dicho dominio y transfiere N-acetilglucosamina a determinadas manosas sobre los oligosacáridos de alta manosa de los aceptores ; c) una N-acetilglucosamina-1-fosfodiester α-N-acetilglucosaminidasa (GlcNAc-fosfodiesterasa), que hidroliza la N-acetilglucosamina generando el marcador manosa 6-P ; y d) receptores de manosa 6-P que median el transporte de las hidrolasas ácidas hacia los lisosomas. Las membranas de dos eucariotas unicelulares , la Acanthamoeba castellanii y Dytiostellium discoideum tienen una actividad enzimática capaz de transferir N-acetilglucosamina 1-fosfato a partir de UDP-N-acetilglucosamina a residuos de manosa sobre oligosacáridos de alta manosa . La ausencia de la segunda enzima de este camino metabólico y de un receptor capaz de reconocer el marcador manosa 6-P, sugiere que la GlcNAc-fosfotransferasa sirve en estos organismos para una diferente función celular. No se ha detectado en el protozoo Trypanosoma cruzi actividad de GlcNAc-fosfotransferasa, ni se han encontrado residuos de fosfato sobre los oligosacáridos de alta manosa de glicoproteínas totales o de una enzima lisosomal purificada. En plantas y levaduras las hidrolasas ácidas están en las vacuolas, equivalentes morfológicos y funcionales de los lisosomas de mamíferos . Las evidencias indican que en estos sistemas la señal para la localización de las hidrolasas ácidas en dichas organelas es independiente del marcador manosa 6-P y que la misma está codificada dentro de la secuencia aminoacídica primaria de las proteínas allí destinadas. Está bien establecida la existencia de lisosomas en los invertebrados, pero hasta el momento no había datos bibliográficos acerca del transporte de las enzimas lisosomales hacia esas organelas. En invertebrados se había informado de la presencia de fosfato hidrolizable por endo-N-acetilglucosaminidasa H en la vitelogenina de la larva de la mariposa del tabaco, Manduca sexta, marcada con [³²P]. También se había encontrado manosa 6-P en hidrolizados de vitelina aislada de los oocitos de la vinchuca venezolana, Rhodnius prolixus, luego de alimentar los insectos con sangre conteniendo [³²P]. Chao y Raikhel encontraron que el cDNA de una proteasa aspártica ácida (lisosomal) del mosquito Aedes aegypti tiene una secuencia homóloga a la que en la catepsina D, enzima lisosomal de mamíferos, está implicada en la formación del dominio protéico para el reconocimiento por la GlcNAc-fosfotransferasa y la formación de manosa 6-P. Recientemente Guillén y colaboradores (1993) informaron por primera vez de la presencia de una actividad de GlcNAc-fosfotransferasa, primera enzima de la vía metabólica en la formación del marcador manosa 6-P, en las membranas de un díptero, la mosca mediterranea de la fruta, Ceratitis capitata La GlcNAc-fosfotransferasa de Ceratitis capitata presenta propiedades cataliticas similares a las de la enzima de mamíferos . Esta enzima transfiere N-acetilglucosamina 1-fosfato a manosas presentes en los oligosacáridos de alta manosa tanto de glicoproteínas endógenas como de la uteroferrina, una enzima lisosomal de mamíferos. Además al igual que la GlcNAc-fosfotransferasa de mamíferos es capaz de discriminar entre enzimas lisosomales y las que no lo son pero que poseen idénticos oligosacáridos de alta manosa La GlcNAc-fosfotransferasa de Acanthamoeba castellanii también fosforila mejor enzimas lisosomales que glicoproteínas no lisosomales, sin embargo no existe en estos organismos direccionamiento de hidrolasas ácidas a través del marcador manosa 6-P. Por lo tanto, la existencia de la GlcNAc-fosfotransferasa específica en Ceratitis capitata no indicaba necesariamente que estuviera toda la vía. Para estudiar la presencia del sistema de translocación de enzimas lisosomales que utiliza el marcador manosa 6-P en invertebrados se utilizó como modelo experimental un crustáceo, el cangrejo de estuario Chasmagnatus granulata. El hepatopáncreas de Chasmagnatus granalata se utilizó como fuente de hidrolasas ácidas. Se purificó a homogeneidad una de ellas, la α-L-fucosidasa. Sobre los oligosacáridos de alta manosa de glicoproteínas solubles totales y en particular sobre los de la α-L-fucosidasa, se determinó la presencia de manosa-P. También sobre los oligosacáridos de alta manosa de glicoproteínas totales se encontró N-acetilglucosamina unida externamente a los mismos través del C1, ya que pudo ser removida por un tratamiento de hidrólisis ácida suave. En las membranas del hepatopáncreas se encontraron además actividades de GlcNAc-fosfotransferasa y GlcNAc-fosfodiesterasa, primera y segunda enzima de la vía que utiliza el marcador manosa 6-P y una posible molécula receptora para la fosfomanosa. UDP-N-acetilglucosamina: enzima lisosomal-N-acetilglucosamina-1-fosfotransferasa (GlcNAc-fosfotransferasa). La actividad de GlcNAc-fosfotransferasa de Chasmagnatus granulata es capaz de transferir in vitro N-acetilglucosamina 1-fosfato a α-metilmanósido. El producto que se forma a partir de esta reacción es GlcNAc-(α1,6) P-(α 1-metilmanósido), similar al descripto para otras GlcNAc-fosfotransferasas . La actividad específica de la GlcNAc-fosfotransferasa de Chasmagnatus granalata está entre las más bajas descriptas hasta el momento. Esta enzima, al igual que la de mamíferos y la de Ceratitis capitata , fosforila mejor enzimas lisosomales que glicoproteínas no lisosomales. La GlcNAc-fosfotransferasa de Chasmagnatus granulata tiene requerimientos de pH y de catiomes similares a los informados para las enzimas de mamíferos y de Ceratitis capitata . N-acetilglucosamina-1-fosfodiester α-N-acetilglucosaminidasa (GlcNAc-fosfodiesterasa) Hasta este momento no se había descripto una actividad de GlcNAc-fosfodiesterasa en organismos distintos de los vertebrados. La GlcNAc-fosfodiesterasa de Chasmagnatus granulata es capaz de liberar [14C]GlcNAc a partir de [14C]GlcNAc-(α 1,6) P-(α 1-metilmanósido). Esta enzima, al igual que su contraparte de mamíferos es una enzima integral de membrana, y su actividad no requiere de la presencia de cationes divalentes. Receptores para manosa 6-fosfato En las membranas del hepatopáncreas se encontraron dos proteínas de pesos moleculares aproximados de 215.000-220.000 Da y 205.000 Da capaces de unirse a una columna de afinidad preparada a partir de fosfomanano de levadura unido a Sepharosa 4-B y eluirse especificamente con manosa 6-P. Estas proteínas fueron reconocidas por antisueros preparados contra los receptores para manosa 6-P de 275.000-300.000 Da ( Man-6-P/IGF-II) y de 46.000 Da (CD-MPR)de mamíferos . Dichas proteínas serían las responsables de unir los residuos de fosfomanosa presentes sobre los oligosacáridos de las hidrolasas ácidas de Chasmagnatus granulata. Por lo tanto, en este trabajo de tesis se demostró por primera vez que el camino que usa el marcador manosa 6-P para la translocación de enzimas lisosomales, tal como se Io describió inicialmente en mamíferos, está presente también en invertebrados.