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Enzimas lisosomales. Biosíntesis y translocación hacia los lisosomas: purificación de glicosiltransferasas involucradas en la dirección de enzimas lisosomales a los lisosomas
Eduardo Rodolfo Guillén Roberto O. Couso
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Resumen/Descripción – provisto por el repositorio digital
Se conocen varios sistemas de dirección de proteínas desde su lugar de síntesis hacia donde cumplen su función. Entre los mejor estudiados está uno de los que permite que las. enzimas lisosomales neosintetizadas se dirijan a los lisosomas de las células de mamíferos. Tal como se lo conoce, este sistema de transporte se basa en cuatro componentes: a) un dominio específico común en todas las enzimas lisosomales que lo emplean, b) la enzima clave UDP — N - Acetilglucosamina : Enzima Lisosomal N — Acetilglucosamina — l — Fosfotransferasa (GlcNAc — fosfotransferasa), que reconoce específicamente este dominio común y transfiere GlcNAc-l-fosfato a determinadas manosas de los oligosacáridos de alta manosa de los aceptores, c) una α-N-Acetilglucosamina-l- Fosfodiester N — Acetilglucosaminidasa, que hidroliza la N—acetilglucosamina generando el marcador manosa 6-fosfato, y d) dos receptores de manosa 6-fosfato que median el transporte de las enzimas lisosomales hasta los lisosomas. La enzima clave es la GlcNAc-fosfotransferasa porque reconoce las enzimas lisosomales de entre otras proteínas no lisosomales que contienen oligosacáridos similares de alta manosa. La enzima tiene un sitio catalítico que interacciona con la manosa a la que transferirá la N-acetilglucosamina-l-fosfato, y otro sitio que reconoce específicamente un dominio común a todas las enzimas lisosomales que emplean la vía de la manosa 6-fosfato para su transporte a los lisosomas. La GlcNAc-fosfotransferasa de mamífero mejor caracterizada es la de hígado de rata, una enzima anclada a membrana localizada en el aparato de Golgi. Cataliza la transferencia de N —acetilglucosamina —1 - fosfato desde UDP —N - acetilglucosamina a manosas alfasustituídas en el carbono anomérico. Esta GlcNAc-fosfotransferasa muestra una gran afinidad por enzimas lisosomales, con Km aparentes menores a 20 μM y eficiencias como aceptores (Vmax /Km) mayores de 160 para estas proteínas, contra Km del orden milimolar y eficiencias cercanas a 1 para glicoproteínas no lisosomales con oligosacáridos de alta manosa similares. Hasta el momento la enzima se describió con algún detalle en mamíferos y en la ameba Acanthamoeba castellanii, aunque en esta última no se han detectado los demás componentes del sistema de transporte a lisosomas. También se describió una GlcNAc-fosfotransferasa en Dictyostelium discoideum , pero esta, a diferencia de las anteriores, no tiene la capacidad de discriminar entre enzimas lisosomales de mamífero y otras glicoproteínas. Purificación de la GlcNAcfosfotramferasa de A. castellanii La GlcNAc-fosfotransferasa fue purificada parcialmente a partir de membranas de Golgi de hígado de rata unas 750 veces, y la de linfoblastos humanos fue purificada 3.800 veces. Hasta la fecha no ha.sido posible lograr preparaciones de mayor pureza de la enzima de mamíferos, en parte debido a la dificultad en obtener cantidades suficientemente grandes de estos materiales de partida, y también por su relativamente baja actividad específica. En la A. castellanii la GlcNAc-fosfotransferasa tiene una actividad específica unas cien veces mayor que en mamíferos y presenta características cinéticas y de especificidad de sustrato similares. Además es un microorganismo fácilmente cultivable en grandes cantidades, por lo que aparece a priori como la fuente ideal para encarar la purificación de esta enzima a homogeneidad. En el presente trabajo se describe la purificación 65.000 veces de la GlcNAcfosfotransferasa presente en membranas de la ameba A. castellanii. La enzima se solubilizó de las membranas con los detergentes Lubrol PX y desoxicolato de sodio, y se purificó mediante cromatografías con las lectinas Concanavalina A y de Triticum vulgaris, el intercambiador iónico Q-Sepharosa, y cromatografía de exclusión molecular en Superosa 12. Las proteínas eluídas de la columna de Superosa 12 se analizaron por electroforesis desnaturalizante en geles de poliacrilamida y se observaron solo dos bandas con un perfil de intensidades coincidente con el de la actividad enzimática. Estas proteínas tienen pesos moleculares relativos de 71 kDa y 82 kDa. El peso molecular aparente de la GlcNAcfosfotransferasa nativa estimado por filtración por gel está entre algo más de 1.000 kDa y 130 kDa según la preparación, apareciendo la mayoría de las veces como de 570 kDa. Parece probable que las proteínas de 7l y 82 kDa estén unidas en estado nativo, sea como subunidades de una forma activa mayor, o como agregados menos definidos. Para confirmar la identificación de la GlcNAc-fosfotransfersa se obtuvieron anticuerpos contra esta enzima. Para ello se inmunizaron ratones con preparaciones de GlcNAcfosfotransferasa purificada más de 10.000 veces, produciéndose anticuerpos policlonales específicos para proteínas de A. castellanií y con alta afinidad por la enzima. Tanto preparaciones crudas como altamente purificadas de GlcNAc-fosfotransferasa se cromatografiaron por columnas de exlusión molecular, en las que la actividad presentó volúmenes de elución variables que dependieron de la preparación. Las proteínas de las fracciones eluídas se separaron por electroforesis y se efectuaron inmunoblots que se revelaron con el antisuero de ratón. Analizando las proteínas que reaccionaron con el anticuerpo y cuyo perfil de intensidades se correspondió con el de la actividad GlcNAcfosfotransferasa, se confirmó que las dos proteínas de 71 y 82 kDa son probablemente subunidades o fragmentos de subunidades de la GlcNAc-fosfotransferasa. Identificación de una actividad GlcNAc-fosfotransferasa en pupas de la mosca mediterránea de lafruta Ceratitis capitata. Está bien establecida la existencia de lisosomas en los insectos, pero hasta ahora no se había descripto nada sobre el transporte de hidrolasas ácidas hacia esas organelas, ni la presencia de enzimas de la vía metabóica de la manosa 6-fosfato. Cabe la posibilidad de que se utilize un sistema similar al que hasta ahora solo había sido encontrado en los mamíferos. Como parte del trabajo para esta tesis, se caracterizó por primera vez una actividad GlcNAc-fosfotransferasa en el díptero C. capitata . Para este estudio se usó un sistema de enzayo in vitro en la búsqueda de indicios sobre el sistema de transporte de enzimas lisosomales a los lisosomas de insectos. Se ha establecido la presencia de una actividad GlcNAc-fosfotransferasa asociada a membranas en pupas de seis días de la mosca mediterránea de la fruta C. capitata , capaz de transferir GlcNAc-l-fosfato desde UDP-N-acetilglucosamina a a-metilmanósido. Se demostró también que el producto es N-acetilglucosamina-(l,6)-fosfato-(α1-metilmanósido), similar al descripto para otras GlcNAc-fosfotransferasas con este sustrato. Se encontró además que las propiedades catalíticas de la GlcNAc-fosfotransfersa de C. capitata con estos sustratos. son similares a las de aquella que se encuentra en células de mamíferos, a la de la ameba A. castellanii y a la de D. discoídeum . La enzima presentó in vitro un pH óptimo de 7,0; una temperatura óptima de incubación de 30 °C, y requirió de Mn2+ o Mg2+ para su actividad. La enzima transfiere también N-acetilglucosamina-l-fosfato a manosas presentes en oligosacáridos del tipo de alta manosa, tanto de glicoproteínas endógenas como de uteroferrina, una enzima lisosomal de mamíferos. Por esta última presentó un Km ap de 63 μM,similar al de la GlcNAc-fosfotransferasa de mamíferos. Al igual que esra última, se mostró capaz de discriminar entre enzimas lisosomales y las que no lo son, pero que poseen oligosacáridos similares de alta manosa.Palabras clave – provistas por el repositorio digital
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Disponibilidad
| Institución detectada | Año de publicación | Navegá | Descargá | Solicitá |
|---|---|---|---|---|
| No requiere | 1993 | Biblioteca Digital (FCEN-UBA) (SNRD) |
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Información
Tipo de recurso:
tesis
Idiomas de la publicación
- español castellano
País de edición
Argentina
Fecha de publicación
1993
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